Method Article

الجمع بين الرطب وتقنيات مختبر الجافة لتوجيه بلورة البروتينات كبيرة ملفوف لفائف تحتوي على

DOI:

10.3791/54886

⸱

January 6th, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Pittsburgh, 2Institute of Structural Biology, German Research Center for Environmental Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نصف إطارا يتضمن تحليلا كيميائيا حيويا وحسابيا مباشرا لتوجيه توصيف وبلورة مجالات الملفات الملفوفة الكبيرة. يمكن تكييف هذا الإطار مع البروتينات الكروية أو تمديده لدمج مجموعة متنوعة من التقنيات عالية الإنتاجية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = 'jove_content'> يمكن أن يكون الحصول على بلورات لتحديد الهيكل اقتراحا صعبا ويستغرق وقتا طويلا لأي بروتين. تم العثور على بروتينات ومجالات الملف الملفوف في جميع أنحاء الطبيعة ، ومع ذلك ، نظرا لخصائصها الفيزيائية وميلها إلى التجمع ، ينظر إليها تقليديا على أنها يصعب تبلورها بشكل خاص. هنا ، نستخدم مجموعة متنوعة من التقنيات السريعة والبسيطة المصممة لتحديد سلسلة من حدود المجال المحتملة لبروتين ملفوف معين ، ثم توصيف سلوك هذه البروتينات في المحلول بسرعة. مع إضافة علامة الفلورسنت القوية (mRuby2) ، يكون توصيف البروتين بسيطا ومباشرا. يمكن تصور البروتين المستهدف بسهولة تحت الإضاءة العادية ويمكن قياسه كميا باستخدام جهاز تصوير مناسب. الهدف هو تحديد المرشحين الذين يمكن إزالتهم من خط أنابيب التبلور بسرعة لأنه من غير المرجح أن ينجحوا ، مما يوفر مزيدا من الوقت لأفضل المرشحين وأموالا أقل يتم إنفاقها على البروتينات التي لا تنتج بلورات. يمكن تكرار هذه العملية لدمج المعلومات المكتسبة من جهود الفحص الأولية ، ويمكن تكييفها مع إجراءات التعبير والتنقية عالية الإنتاجية ، ويتم تعزيزها عن طريق الفحص الآلي للتبلور.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جعلت تحديد هيكل عبر البلورات بالأشعة السينية مساهمات أساسية في كل ميدان من ميادين علم الأحياء الحديث. تقديم وجهة نظر الذري من الجزيئات التي تدعم الحياة وكيفية تفاعلها مع بعضها البعض في مجموعة متنوعة من السياقات. مما يتيح لنا فهم الآليات التي تسبب المرض، وتوفير فرص لتصميم بعقلانية الأدوية لعلاج المرض. وقد البلورات منذ فترة طويلة تقنية تجريبية المهيمنة لتحديد بنية الجزيئات، ويمثل في الوقت الحالي 89.3٪ من قاعدة البيانات الهيكلية (www.rcsb.org). هذه التقنية لديها العديد من المزايا، بما في ذلك القدرة على دقة عالية جدا، والقدرة على تصور الجزيئات مع مجموعة واسعة من الأحجام، وجمع البيانات بسهولة نسبيا، وإتاحة الفرصة لتصور كيف يتفاعل جزيء مع المذيبات وكذلك بروابط.

وعلى الرغم من التحسينات التكنولوجية عديدة في المؤتلف تعبير البروتين 1،2، بورification 3، والبيولوجيا الجزيئية المستخدمة لتوليد هذه الأنظمة 4، وأكبر عقبة واحدة في عملية البلورات لا تزال القدرة على بلورات نوعية الحيود. وقد كان هذا ينطبق بشكل خاص على البروتينات التي تحتوي على مجالات ملفوف لفائف كبيرة. وتشير التقديرات إلى أن ما يصل إلى 5٪ من جميع الأحماض الأمينية وجدت داخل لفائف الملفوف 5،6، مما يجعل هذا سمة هيكلية شائعة جدا 7، ولكن هذه البروتينات غالبا ما تكون أكثر صعوبة لتنقية وبلورة من البروتينات الكروية 8-10 . ومما يفاقم ذلك من حقيقة أن المجالات ملفوف لفائف وغالبا ما توجد في إطار بروتين أكبر، لذلك بشكل صحيح التنبؤ حدود هذه المجالات أمر بالغ الأهمية لتجنب إدراج تسلسل غير منظم أو مرن التي غالبا ما تكون مضرة للتبلور.

يحلل هنا نقدم الجمع بين الإطار المفاهيمي على شبكة الإنترنت الحاسوبية مع experimentaبيانات ل من على مقاعد البدلاء، لمساعدة المستخدمين على دليل من خلال المراحل الأولى من عملية البلورات بما في ذلك: كيفية تحديد جزء من البروتين (ق) للدراسات الهيكلية، وكيفية إعداد وتوصيف عينات البروتين قبل محاولات التبلور. ونحن نركز تحليلنا على اثنين من البروتينات التي تحتوي على مجالات ملفوف لفائف كبيرة، شروم (SHRM) ورو-كيناز (الصخرة). وقد تم اختيار هذه البروتينات لأن كلا منهما يحتوي على المجالات ملفوف لفائف ومعروفة لتشكيل معقد 11-16 بيولوجيا. ومن المتوقع شروم ورو-كيناز (روك) لاحتواء ~ 200 و 680 مخلفات ملفوف لفائف على التوالي، العديد من الأجزاء التي تم التعرف هيكليا 17-20. الطريقة الموصوفة هنا يوفر تبسيط العمل لتحديد أجزاء من ملفوف لفائف تحتوي على البروتين من شأنها أن تكون قابلة للتبلور بسرعة، ومع ذلك، فإن الأساليب المذكورة يمكن بسهولة أن تتكيف لمعظم البروتين أو البروتين المجمعات أو تعديل لدمج الإنتاجية العالية approaالكولينستراز المتاحة و. وأخيرا، وهذه الأساليب هي غير مكلفة عموما، ويمكن أداؤها من قبل المستخدمين في مستويات الخبرة تقريبا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: يتم وصف الرسم البياني للإطار المفاهيمي أو سير العمل في الشكل رقم 1 لتكون مرجعا. ويمكن تقسيم البروتوكول إلى أربع مراحل: التوقعات الحسابية أو تسلسل القائمة، وتعبير البروتين وتنقية وتوصيف والكيمياء الحيوية، والتبلور. الأمثلة يظهر تحليل المجالات شروم SD2 و / أو المجمعات شروم روك، ولكن يمكن الاستفادة منها مع أي بروتين.

1. استخدام تأسست أدوات على شبكة الإنترنت لتوليد التوقعات الحسابية من حدود المجال ملفوف لفائف

  1. جمع مجموعة متنوعة من النشوء تسلسل Homologs.
    1. الذهاب إلى www.uniprot.org واكتب في شروم في شريط البحث العلوي.
    2. حدد متواليات لتحميل عن طريق التحقق من مربع بجانب عدد انضمامها. تسلسل مع نجم تشير تسلسل مراجعتها من قبل يونيبروت وعادة ما تكون أكثر موثوقية. الحرص على التأكد من أن جميع سلاسل كاملة ودقيقة.
    3. حفظ الصورة المختارةequences عن طريق النقر على زر تحميل.
    4. محاذاة جمع متواليات شروم باستخدام كلوستال أوميغا 21 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). انقر فوق الزر "استعراض" لتحديد الملف مع تسلسل شروم ومن ثم دفع إرسال.
    5. بعد محاذاة كاملة، انقر فوق "تحميل محاذاة ملف" زر.
    6. فتح تسلسل متعددة محاذاة ولدت في 1.1.5 باستخدام Jalview (ملف | الإدخال محاذاة | من الملف). ضمن إطار جديد محاذاة، اللون من الهوية (اللون | المئة الهوية).
  2. حساب التنبؤات هيكل الثانوي، والتنبؤات من تسلسل مرن أو المختلين، وتوقع المناطق ملفوف لفائف داخل البروتين (ق) من الفائدة.
    1. الذهاب إلى http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi، لحساب التنبؤات ملفوف-لفائف. نسخ ولصق تسلسل في صندوق تسلسل وانقر على إرسال.
      ملاحظة: هذا التحليل قد يستغرق بضع ساعات لتراكبوليته. منذ متواليات شروم كبيرة جدا، قد تحتاج إلى تقسيمها إلى كتل من أقل من 1000 الأحماض الأمينية لتناسب داخل حجم القيد من خادم متواليات. عند تحليل Shrm2، فمن المستحسن أن يتم استخدام الأحماض الأمينية C-الطرفية 1000 كما يحتوي هذا القسم على نطاق SHRM SD2 والذي يعرف لاحتواء المناطق ملفوف لفائف. عندما تكرار هذا التحليل مع بروتينات أخرى، فمن المستحسن استخدام سلاسل بروتين كامل طول عندما يكون ذلك ممكنا. إذا كان هذا ليس خيارا، واستخدام أكبر جزء ممكن أو تشريح تسلسل استنادا إلى البيانات الحيوية أو وظيفية معروفة.
    2. الذهاب إلى http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi، لحساب التنبؤات ملفوف-لفائف. نسخ ولصق تسلسل في صندوق تسلسل وانقر على إرسال.
  3. الجمع بين نتائج الخطوات 1.1 إلى 1.2.2 إلى شرح شامل واحد للتسلسل شروم.
    ملاحظة: يتم تشجيع بشدة لتشمل أيضا أي وكل ما ذات الصلةتفقد المعلومات التي يمكن استخلاصها من الأدب أو مصادر أخرى عن وظيفة البروتين أو تنقية في هذه المرحلة.
  4. باستخدام هذا التسلسل المشروح شامل، التنبؤ حدود المجال (أو مجموعة من الحدود الممكنة) للبروتين، في محاولة لتحقيق أقصى قدر من الحفاظ على وتوقع السمات الهيكلية مع التقليل من كمية تسلسل المختلين أو مرنة. إذا كان معروفا، يجب أن البروتين الناتج الإبقاء على الخصائص الفنية للاهتمام.

2. صريحة وتنقية البروتينات مع حدود المجال التي تم تحديدها في القسم 1

ملاحظة: إن الهدف من هذا القسم هو استخدام سلسلة من فحوصات سريعة وقابلة للقياس بسهولة للكشف حدود نطاق افتراضية ولدت في القسم 1.

  1. باستخدام تقنيات البيولوجيا الجزيئية القياسية، توليد التعبير البلازميد مع تسلسل الترميز المطلوب في إطار ضمن له 10 -mRuby2-XH2 البلازميد (انظر الشكل 3 لناقلات خريطة لالثانية تفاصيل إضافية).
  2. مستويات التعبير اختبار لكل التعبير البلازميد باستخدام BL21 (DE3) كولاي أو غيرها من سلالة التعبير مناسبة في وسائل الإعلام autoinduction 1 في درجة حرارة الغرفة ل18-24 ساعة.
    1. تحويل البلازميدات التعبير فضلا عن السيطرة البلازميد فارغة إلى BL21 (DE3) باتباع الإرشادات التي جاءت مع الخلايا أو باستخدام بروتوكول التحول القوي، مثل واحد هنا (https://www.addgene.org/plasmid-protocols/bacterial -تحويل/).
    2. من لوحة تحولت حديثا، واختيار مستعمرة واحدة وتنمو ثقافة كاتب 5 مل عند 37 درجة مئوية خلال الليل في استذابة مرق (LB) وسائل الاعلام مع 34 ميكروغرام / مل الكانامايسين.
    3. في اليوم التالي، بيليه الثقافة ويغسل بيليه مع LB. جديدة
    4. إضافة الثقافة بداية ل50 مل من وسائل الاعلام autoinduction مع 34 ميكروغرام / مل الكانامايسين. السماح للثقافة ليصل إلى تشبع في أي درجة حرارة الغرفة أو 37 درجة مئوية. عادة، وتنمو ل~ 18-24 ساعة.
    5. خلية بيليهالصورة وتجميد الكريات خلية مما يؤدي إلى -80 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى قبل التنقية.
    6. قارن مقتطفات خلية كاملة من كل سلالة التعبير ومكافحة ناقلات الفارغة التي كتبها SDS-PAGE لتحديد السلالة التي تنتج أكثر كفاءة البروتين الانصهار المطلوب. لصاحب 10 البروتينات الانصهار -mRuby2-شروم SD2، تشغيل 10٪ والمواد الهلامية SDS-PAGE في 180 V ل~ 50 دقيقة أو حتى الجبهة صبغ يصل إلى الجزء السفلي من هلام 22.
    7. هلام وصمة عار مع Coomassie الأزرق لتصور مجموع البروتينات الخلوية داخل كل سلالة 23.
  3. إجراء خطوة تقارب اللوني الأولية على كل سلالة أن أعرب بنجاح البروتين mRuby2 الانصهار. عادة، نفذ تنقية خطوات 2.3.2-2.3.7 في درجة حرارة الغرفة، ما لم سيستفيد البروتين من الظروف المتغيرة مثل تنقية في 4 درجات مئوية.
    1. الكريات خلية ذوبان الجليد من الخطوة 2.2.5.
    2. resuspend كل بيليه خلية في 1.5 مل من تحلل العازلة (10٪ الجلسرين، 500 مم كلوريد الصوديوم، و 40ملي إميدازول 20 ملي تريس pH8.0، 1 ملم بيتا المركابتويثانول). تكملة تحلل العازلة مع مثبطات الأنزيم البروتيني حسب الاقتضاء.
    3. إضافة 30 ميكرولتر من 10 ملغ / مل الليزوزيم ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. يصوتن اتباع التعليمات لأداة المستخدمة.
    4. نقل في أنبوب 1.5 مل وأجهزة الطرد المركزي في أعلى الجدول الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة في 14000 x ج لتكوير المواد غير القابلة للذوبان أو خلايا unlysed. حفظ كل وطاف بيليه لتحليلها لاحقا عبر SDS-PAGE.
    5. أداء تنقية النيكل تقارب، احتضان جزء قابل للذوبان مع 100 ميكرولتر من الخرز ني NTA. احتضان حبات مع المحللة للذوبان لمدة 5-10 دقائق، عكس عدة مرات لخلط حبات.
    6. أجهزة الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 30 ثانية في جهاز للطرد المركزي الطاولة لتكوير حبات. اتبع هذا عن طريق غسل بيليه 3-5 مرات مع العازلة تحلل لتنظيف قبالة الملوثات غير محددة.
    7. أزل روبي انصهار بروتين من الخرز مع العازلة تحلل تستكمل مع 1M ايميدازول.
    8. استخدام SDS-PAGE لمقارنة سلوك صاحب-mRuby2-شروم البروتينات في تنقية "سريعة وقذرة" أعلاه.

3. تميز البروتين عينة لتحديد تلك مع خصائص مفيدة

  1. استخدام مجموعة معمل في 280 نانومتر لقياس تركيز البروتين الانصهار روبي، ومن ثم تقييم تجانس العينة عن طريق تحميل 1-5 ميكروغرام من البروتين الانصهار على هلام الصفحة الأصلي 24. تشغيل 10٪ هلام الصفحة الأصلية عند 4 درجة مئوية لمدة 140 دقيقة في 175 V.
    1. صورة PAGE الأم باستخدام تصوير مجهزة لتصور مضان، ومراقبة حيث يهاجر الانصهار الموسومة mRuby في هذا الاختبار.
      ملاحظة: كن حذرا لمراقبة البروتين الانصهار التي عالق في وكذلك من المرجح تجميع هذا البروتين. إذا كان تصوير مضان غير متوفر، يمكن للمرء أن غالبا ما تصور وصورة تتركز عينات من روبي الموسومة البروتين تحت ضوء أسود أو مع مربع ضوء الأشعة فوق البنفسجية.
  2. أداء التحلل البروتيني محدود لتحديد المجالات مطوية ثابت. احتضان 95 ميكرولتر من روبي SHRM SD2 الانصهار في ~ 1 ملغ / مل مع 5 ميكرولتر من 0.025٪ سبتيليزين أ.
    1. أخذ عينات من رد فعل في نقطة زمنية من 0، 0.5، 2، 5، 15، 60، و 120 دقيقة، وإزالة 10 ميكرولتر من رد فعل لكل نقطة زمنية وتصور التقدم من رد فعل عبر SDS-PAGE باستخدام هلام الأكريلاميد 15٪ .
    2. وصمة عار مع Coomassie الأزرق كما في الخطوة 2.2.7 وتقييم ما إذا كانت الأنواع المقاومة البروتيني يمكن تحديدها.
  3. دمج البيانات من كفاءة تنقية والسلوك في الصفحة الأم، والتحلل البروتيني محدود على البروتينات الانصهار mRuby2-شروم النقاء جزئيا إلى إجراء تقييم شامل للسلوك العام لهذه البروتينات في الحل.
    1. (اختياري) إذا مقايسة وظيفية مناسبة متاحة، تحقق من وجود نشاط في هذه المرحلة.

4. إنتاج بلورات عالية الجودة للملفوف لفائف SD2المجال من شروم

ملاحظة: يتم تنفيذ كافة الخطوات في القسم 4.1 في درجة حرارة الغرفة ما لم سيستفيد البروتين من تنقية في درجة حرارة مختلفة، وعادة 4 درجات مئوية.

  1. استخدام 50 مل زوائد كتقدير تقريبي التعبير وإمكانية تنقية، أداء تعبيرات واسعة النطاق من mRuby2-شروم SD2 بهدف تحقيق 5-20 ملغ من عينة النقاء تماما. عادة 2 لتر للثقافة ويوفر المواد انطلاق كافية. بعد خلايا بيليه النمو عن طريق الطرد المركزي في 8000 x ج لمدة 10 دقيقة.
    1. resuspend الكرية من النمو 2 لتر في تحلل العازلة كما كان من قبل، وذلك باستخدام ~ 2 مل من تحلل في كل غرام من بيليه الخلية المجمدة في حالة استخدام الليزوزيم للتحلل. بدلا من ذلك، و resuspend في ~ 8 مل / ز من بيليه إذا يستخدم الخالط أو الصحافة الفرنسية. بيليه الحطام الخلوي عن طريق الطرد المركزي في 30000 x ج لمدة 30 دقيقة.
    2. ربط دفعة الكسر للذوبان من 4.1.1 باستخدام 10 مل من راتنج ني NTA. تصب في عمود الثقل المناسبوتسمح البروتينات غير منضم إلى استنزاف قبالة.
    3. غسل الراتنج 3-5 مرات مع 40 مل من تحلل العازلة، تليها يغسل مع العازلة تحلل تستكمل إلى 1 M كلوريد الصوديوم.
    4. الراتنج غسل مع 40 مل من تحلل العازلة تستكمل مع 80 ملي ايميدازول.
    5. أزل البروتين الانصهار روبي شروم مع 40 مل من العازلة تحلل تستكمل إلى 1 M ايميدازول. يجزئ يدويا بروتين مزال إلى 4-10 مل الكسور.
    6. تأكيد الكسور التي تحتوي روبي شروم انصهار بروتين باستخدام 10٪ SDS-PAGE.
    7. Dialyze كسور المناسبة (عادة كسور 2-4) إلى 8٪ الجلسرين، 250 مم كلوريد الصوديوم، و 15 ملي إميدازول 20 ملي تريس pH8.0، 1 ملم β-ME، وذلك باستخدام 6-8 كيلو دالتون MWCO غسيل الكلى الأنابيب. إضافة 1 ملغ من TEV البروتيني لكل 25-50 ملغ من البروتين الانصهار. Dialyze بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة مع التحريك البطيء.
    8. كرر تنقية النيكل تقارب خطوات 4.1.2. إلى 4.1.6. وينبغي أن تظل المجال شروم SD2 الآن في جزء غير منضم في حين أن صاحب 10 -mRuby2 ستبقى ملزمة لسيتم العثور على الراتنج وفي الكسور شطف. تأكيد ذلك باستخدام 12٪ SDS-PAGE تلطيخ مع Coomassie الأزرق.
    9. Dialyze الكسور التي تحتوي نطاق شروم SD2 إلى 8٪ الجلسرين، و 100 مم كلوريد الصوديوم، و 20 ملي تريس درجة الحموضة 8.0، 5 ملي العازلة بيتا المركابتويثانول بين عشية وضحاها.
    10. أداء أنيون تبادل اللوني 25 باستخدام FPLC، ويبلغ حجمه مع التدرج كلوريد الصوديوم 0،1-1،0 M كلوريد الصوديوم. تحليل الكسور باستخدام 12٪ SDS-PAGE.
    11. باستخدام مكثف تدور (MWCO من 10 كيلو دالتون أو أكثر اعتمادا على بروتين قيد الدراسة)، والتركيز الكسور الذروة إلى ~ 0 ملغ / مل، ثم قم بإجراء حجم الإقصاء اللوني 26، تحليل الكسور الذروة عبر 12٪ SDS-PAGE.
    12. تجمع الكسور الذروة وdialyze إلى 20 ملي تريس درجة الحموضة 8.0، 50 ملي كلوريد الصوديوم، 2٪ الجلسرين، 1 ملم β-ME، والتركيز على 10 ملغ / مل قبل التبلور.
      اختياري: خلال هذه الخطوة، وإزالة 5 عينات ميكرولتر بتركيزات 1، 2، 5، و 10 ملغ / مل خلال تركيز العينة.تشغيل الأصلي PAGE تحميل 2-5 ميكرولتر من كل عينة للنظر في سلوك عينة خلال هذه الخطوة.
  2. كشف مجموعة صغيرة من 12 شروط لتحديد تركيز البروتين الأمثل للمحاكمات التبلور. يوصف تكوين هذه الشروط في الشكل 7.
    1. باستخدام 24-جيدا يجلس صواني بلورة قطرة، نفذ التجارب تبلور باستخدام طريقة بخار نشرها، pipetting ل500 ميكرولتر من كل الظروف 12 في آبار منفصلة تليها قطرات تحتوي في البداية 1 ميكرولتر من حل جيد و 1 ميكرولتر من عينة البروتين على لل coverslips . يرجى الاطلاع على 27 للحصول على معلومات إضافية حول هذه التقنية.
    2. بسرعة ختم صينية مع الشريط واضح ونقل صينية في بيئة درجة حرارة مناسبة للرقابة التي هي الاهتزاز الحرة. درجة الحرارة المستخدمة يمكن أن تختلف، ولكن 4 درجات مئوية، 16 درجة مئوية، و 20 درجة مئوية شائعة جدا.
    3. دراسة قطرات في الأدراج على د 3 القادمآيس باستخدام مجهر تصل إلى 100X التكبير. في نهاية الفترة لمدة 3 أيام، والنتيجة كل قطرة كما لا تحتوي على هطول الأمطار (واضح)، وهطول الأمطار الخفيفة، والأمطار الغزيرة (البني)، أو البلورات. يجب أن تحتوي على تركيز البروتين مناسب لا يزيد عن 6 الامطار الغزيرة.
    4. باستخدام تركيز البروتين المحددة في 4.2، وشاشة مجموعة واسعة من الشاشات تبلور متاحة تجاريا. استخدام المناولة أو بلورة سائلة الروبوت بسرعة كبيرة في هذه العملية مع التقليل أيضا خطأ في قطرات. ويتطلب ذلك أقل بكثير من البروتين أيضا، مما يتيح للمستخدم الشاشة أكثر الظروف مع عينة واحدة.
    5. تحسين الظروف الأولية التي تم تحديدها من شاشات واسعة من خلال تغيير منهجي لكل متغير من المتغيرات داخل قطرة بلورة باستخدام 24-جيدا صواني الفرز كما كان من قبل.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويظهر رسم تصور سير العمل المستخدمة في هذا النظام في الشكل (1) ويتضمن ثلاث مراحل رئيسية. ويستخدم التحليل الحسابي للتسلسل لتطوير الفرضيات حول حدود المجال من البروتين ملفوف لفائف من الفائدة. ويرد مثال لتحليل المشروح المجال Shrm2 SD2 في الشكل 2. في هذا المخطط، كان الهدف هو تحديد حدود نطاق ممكن لمجال محفوظ في محطة سي المنظم هيكل الخلية يسمى شروم SD2. من هذا التحليل كان تم إنشاء ثلاث مجموعات متميزة من حدود نطاق افتراضية ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تصميم البروتوكول الموصوفة هنا لمساعدة المستخدم على تحديد حدود نطاق داخل البروتينات ملفوف لفائف كبيرة لتسهيل بلورة بهم. يعتمد البروتوكول على دمج كلي من مجموعة متنوعة من البيانات من التوقعات الحسابية ومصادر أخرى لتوليد سلسلة من حدود نطاق المحتملة. هذه هي تليها مجموعة من التجارب الكيميائية الحيوية التي هي سريعة وغير مكلفة، وتستخدم لزيادة تحسين هذه الفرضيات الأولية. باستخدام هذا النهج، يمكن للمستخدم القضاء بسرعة شظايا البروتين المحتملة التي هي غير مرغوب فيه، وتركز المزيد من الاهتما...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من خلال منحة NIH R01 GM097204 (APV و JDH). تم توفير التمويل ل JHM من خلال زمالة HHMI الصيفية للأبحاث الجامعية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BL21 (DE3) RosettaEMD Millipore70954-3
BL21 (DE3) StarThermoFisher ScientificC601003
BL21 (DE3) Codon PlusAgilent Technologies230245
LysozymeSpectrum Chemical Mfg CorpL3008-5GM
Ni-NTA ResinLife Technologies25216
SubtilisinASpectrum Chemical Mfg CorpS1211-10ML
24 بئر Cryschem Plateهامبتون للأبحاثHR3-160
INTELLI-PLATE   ؛ 96:Art Robbins Instruments102-0001-03
PEG 3350هامبتون للأبحاثHR2-591
PEG 8000هامبتونللأبحاث HR2-515
PEG 400هامبتونللأبحاث HR2-603
PEG 4000هامبتون للأبحاثHR2-605
pcDNA3.1-Clover-mRuby2Addgene49089
نظام الحث الذاتي السريع بين عشية وضحاها 1EMD Millipore71300
مسحوق مرق LysogenyThermoFisher Scientific12795027 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Studier, F. W. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli. Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).
  2. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol. 189 (1), 113-130 (1986).
  3. Chapman, T. Protein purification: pure but not simple. Nature. 434 (7034), 795-798 (2005).
  4. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  5. Lupas, A., Van Dyke, M., Stock, J. Predicting coiled coils from protein sequences. Science. 252 (5009), 1162-1164 (1991).
  6. Offer, G., Hicks, M. R., Woolfson, D. N. Generalized Crick equations for modeling noncanonical coiled coils. J Struct Biol. 137 (1-2), 41-53 (2002).
  7. Lupas, A. N., Gruber, M. The structure of alpha-helical coiled coils. Adv Protein Chem. 70, 37-78 (2005).
  8. Hernandez Alvarez, B., et al. A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors. Protein Eng Des Sel. 21 (1), 11-18 (2008).
  9. Slabinski, L., et al. The challenge of protein structure determination--lessons from structural genomics. Protein Sci. 16 (11), 2472-2482 (2007).
  10. Slabinski, L., et al. XtalPred: a web server for prediction of protein crystallizability. Bioinformatics. 23 (24), 3403-3405 (2007).
  11. Haigo, S. L., Hildebrand, J. D., Harland, R. M., Wallingford, J. B. Shroom induces apical constriction and is required for hingepoint formation during neural tube closure. Curr Biol. 13 (24), 2125-2137 (2003).
  12. Hildebrand, J. D. Shroom regulates epithelial cell shape via the apical positioning of an actomyosin network. J Cell Sci. 118 (Pt 22), 5191-5203 (2005).
  13. Dietz, M. L., Bernaciak, T. M., Vendetti, F., Kielec, J. M., Hildebrand, J. D. Differential actin-dependent localization modulates the evolutionarily conserved activity of Shroom family proteins. J Biol Chem. 281 (29), 20542-20554 (2006).
  14. Bolinger, C., Zasadil, L., Rizaldy, R., Hildebrand, J. D. Specific isoforms of drosophila shroom define spatial requirements for the induction of apical constriction. Dev Dyn. 239 (7), 2078-2093 (2010).
  15. Farber, M. J., Rizaldy, R., Hildebrand, J. D. Shroom2 regulates contractility to control endothelial morphogenesis. Mol Biol Cell. 22 (6), 795-805 (2011).
  16. Das, D., et al. The interaction between Shroom3 and Rho-kinase is required for neural tube morphogenesis in mice. Biol Open. 3 (9), 850-860 (2014).
  17. Dvorsky, R., Blumenstein, L., Vetter, I. R., Ahmadian, M. R. Structural insights into the interaction of ROCKI with the switch regions of RhoA. J Biol Chem. 279 (8), 7098-7104 (2004).
  18. Mohan, S., et al. Structure of a highly conserved domain of Rock1 required for Shroom-mediated regulation of cell morphology. PLoS One. 8 (12), e81075(2013).
  19. Mohan, S., et al. Structure of Shroom domain 2 reveals a three-segmented coiled-coil required for dimerization, Rock binding, and apical constriction. Mol Biol Cell. 23 (11), 2131-2142 (2012).
  20. Tu, D., et al. Crystal structure of a coiled-coil domain from human ROCK I. PLoS One. 6 (3), e18080(2011).
  21. Sievers, F., et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Mol Syst Biol. 7, 539(2011).
  22. Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. Jr Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).
  23. Diezel, W., Kopperschlager, G., Hofmann, E. An improved procedure for protein staining in polyacrylamide gels with a new type of Coomassie Brilliant Blue. Anal Biochem. 48 (2), 617-620 (1972).
  24. Wittig, I., Schagger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. Proteomics. 5 (17), 4338-4346 (2005).
  25. Jungbauer, A., Hahn, R. Ion-exchange chromatography. Methods Enzymol. 463, 349-371 (2009).
  26. Yu, C. M., Mun, S., Wang, N. H. Theoretical analysis of the effects of reversible dimerization in size exclusion chromatography. J Chromatogr A. 1132 (1-2), 98-108 (2006).
  27. Giege, R. A historical perspective on protein crystallization from 1840 to the present day. FEBS J. 280 (24), 6456-6497 (2013).
  28. Lobley, A., Sadowski, M. I., Jones, D. T. pGenTHREADER and pDomTHREADER: new methods for improved protein fold recognition and superfamily discrimination. Bioinformatics. 25 (14), 1761-1767 (2009).
  29. Marsden, R. L., McGuffin, L. J., Jones, D. T. Rapid protein domain assignment from amino acid sequence using predicted secondary structure. Protein Sci. 11 (12), 2814-2824 (2002).
  30. Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nat Protoc. 10 (6), 845-858 (2015).
  31. Elsliger, M. A., et al. The JCSG high-throughput structural biology pipeline. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 66 (Pt 10), 1137-1142 (2010).
  32. Bach, H., et al. Escherichia coli maltose-binding protein as a molecular chaperone for recombinant intracellular cytoplasmic single-chain antibodies. J Mol Biol. 312 (1), 79-93 (2001).
  33. Strong, M., et al. Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8060-8065 (2006).
  34. Heras, B., Martin, J. L. Post-crystallization treatments for improving diffraction quality of protein crystals. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 9), 1173-1180 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Coiled coil ProteinsProtein CrystallizationDomain Boundary PredictionNickel Affinity PurificationLimited ProteolysisNative PAGE AnalysisSize Exclusion ChromatographyVapor Diffusion MethodCrystallization ScreeningRuby Tag Fusion

Related Articles