يعد تحديد انقسام الخلايا وتوسعها أمرا ذا أهمية حاسمة لفهم نمو النبات بالكامل. هنا ، نقدم بروتوكولا لحساب المعلمات الخلوية التي تحدد معدلات نمو أوراق الذرة وتسليط الضوء على استخدام هذه البيانات للتحقيق في الآليات التنظيمية للنمو الجزيئي من خلال توجيه استراتيجيات أخذ العينات الخاصة بمرحلة النمو.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحليل الحركية من انقسام الخلايا والتوسع: تحديد مقدار الأساس الخلوي للمناطق التنموية النمو وأخذ العينات في
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
غالبا ما تستخدم تحليلات النمو
في علوم النبات للتحقيق في الأنماط الجينية المتناقضة وتأثير الظروف البيئية. الجانب الخلوي لهذه التحليلات له أهمية حاسمة ، لأن النمو مدفوع بانقسام الخلايا واستطالة الخلية. يمثل التحليل الحركي منهجية لتحديد هاتين العمليتين. علاوة على ذلك ، هذه التقنية سهلة الاستخدام في المختبرات غير المتخصصة. هنا ، نقدم بروتوكولا لإجراء تحليل حركي في أوراق الذرة أحادية الفلقة (Zea mays). يتم تقديم جانبين: (1) القياس الكمي لمعلمات انقسام الخلية وتوسعها ، و (2) تحديد موقع مناطق التنمية. يمكن أن يكون هذا بمثابة أساس لتصميم أخذ العينات و / أو يمكن أن يكون مفيدا لتفسير بيانات القياسات البيوكيميائية والجزيئية ذات الدقة المكانية العالية في منطقة نمو الأوراق. يتم حصاد منطقة نمو أوراق الذرة أثناء نمو الحالة المستقرة. تستخدم الأوراق الفردية لتحديد طول النسيج الإنشائي باستخدام صبغة DAPI وملامح طول الخلية باستخدام الفحص المجهري DIC. البروتوكول مناسب للأوراق أحادية الفلقة الناشئة التي يتم حصادها أثناء نمو الحالة المستقرة ، مع مناطق نمو تمتد على الأقل عدة سنتيمترات. لتحسين فهم تنظيم نمو النبات ، يجب الجمع بين البيانات المتعلقة بالنمو والدراسات الجزيئية. لذلك ، فإن إحدى المزايا المهمة للتحليل الحركي هي إمكانية ربط التغييرات على المستوى الجزيئي بمراحل محددة جيدا من التطور الخلوي. علاوة على ذلك ، فإنه يسمح بأخذ عينات أكثر تركيزا من مراحل التطوير المحددة ، وهو أمر مفيد في حالة الميزانية أو الوقت المحدود.
المقدمة
يعتمد تحليل النمو على مجموعة من الأدوات التي تستخدم عادة من قبل علماء النبات لوصف النمط الجيني تحديد الاختلافات النمو و / أو ردود المظهري للعوامل البيئية. وتشمل الحجم والوزن قياسات للنبات كامل أو جهازا وحسابات معدلات النمو إلى استكشاف الآليات الكامنة وراء النمو. يتم تحديد نمو الجهاز عن طريق انقسام الخلايا والتوسع على المستوى الخلوي. لذلك، بما في ذلك تقدير حجم هاتين العمليتين في النمو يحلل هو المفتاح لفهم الاختلافات في نمو كامل الجهاز 1. ونتيجة لذلك، من الأهمية بمكان أن يكون هناك منهجية ملائمة لتحديد معايير النمو الخلوية التي هي سهلة نسبيا للاستخدام من قبل مختبرات غير المتخصصة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: بروتوكول التالي لتحليل الحركية هي صالحة فقط للأوراق خلال النمو المطرد للدولة. وهذا ينطوي على استقرار سعر ورقة استطالة والأنماط المكانية من طول الخلية والتوسع في ورقة خلال فترة تمتد لعدة أيام 6.
1. نمو النبات وقياسات ورقة الاستطالة معدل (لير)
- اختيار ورقة في النمو المطرد للدولة ومرحلة تنموية من الفائدة.
ملاحظة: هناك فرق بين النمو المطرد للدولة والنمو المتكررة، مما يعني الأنماط المكانية مماثلة على أوراق متتالية على نفس المحور. خلال المراحل....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
هنا، وتبين لنا المقارنة بين النباتات المروية جيدا (تحكم، و 54٪ المحتوى المائي للتربة، (SWC)) والنباتات تتعرض لظروف إجهاد الجفاف (الجفاف، و 34٪ SWC) من حيث النمو ورقة بها. وقد نمت جميع النباتات في غرفة النمو في ظل الظروف التي تسيطر عليها (16 ساعة يوم / ليلة 8 ساعة، 25 ° C / 18 ° C يوم / ليلة، 300-400 μEm -2 ثانية -1 الضوئي إشعاع نشط (PAR)، وظروف الجفاف أنشئت عن طريق حجب المياه حتى تم التوصل إلى SWC الصحيحة ومن ثم الحفاظ أبعد من.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تحليل الحركية الكاملة على أوراق الذرة يمكن تحديد الأساس الخلوي للنمو الأوراق ويسمح لتصميم استراتيجيات أخذ العينات فعالة. على الرغم من أن البروتوكول هو بسيط نسبيا، ينصح بعض الحذر في الخطوات الهامة التالية: (1) من المهم لفصل الأصغر سنا، ويترك المغلقة (خطوة 2.3) دون الإضرار النسيج الإنشائي، منذ تقرير طول النسيج الإنشائي (الخطوة 3) يتطلب كاملة النسيج الإنشائي ليكون حاضرا. بعض الممارسات مسبقا قد تكون هناك حاجة. (2) ويستند بارضي تقرير مطول على تفسير من الشخصيات الإنقسامية. ولذلك، فإننا .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل من قبل زمالة الدكتوراه من جامعة أنتويرب إلى VA. زمالة الدكتوراه من مؤسسة العلوم الفلمنكية (FWO، 11ZI916N) إلى KS. منح المشاريع من FWO (G0D0514N)؛ منحة بحثية النشاط البحثي متضافرة (غوا)، "علم الأحياء ونظم النهج من ورقة التشكل" من مجلس البحوث في جامعة أنتويرب. وبين الجامعات الجذب البولنديين (IUAP السابع / 29، MARS)، "الذرة ونبات الأرابيدوبسيس الجذر واطلاق النار على النمو" من المكتب البلجيكي الاتحادي العلوم السياسة (BELSPO) إلى GTSB هان Asard، Bulelani L. Sizani وحمادة عبد الجواد عن ساهمت في الفيديو .
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الأواني | أي | أي نستخدم | الأواني بالتدابير التالية ، ولكن يمكن أن تكون مختلفة اعتمادا على العلاج / الدراسة: القطر السفلي: 11 سم ، قطر الفتح: 15 سم ، الارتفاع: 12 سم. نزرع نبتة ذرة واحدة لكل وعاء. |
| زرع الركيزة | أي | أي | نستخدمها وسط تأصيص (جيفي ، هولندا) ، ولكن يمكن استخدام ركائز أخرى ، اعتمادا على العلاج / الدراسة. |
| المسطرة | أي | أي | مسطرة تمديد تغطي 1.5 متر على الأقل مطلوبة لقياس طول الورقة النهائي للنباتات. |
| البذور | يمكن طلب أي | NA | من المربي. |
| مشرط | أي | أي | يستخدم المشرط أثناء حصاد الأوراق لفصل الورقة محل الاهتمام عن الأوراق المحيطة بها وبعد الحصاد مباشرة لقطع عينة مناسبة لقياسات طول الخلية وطول النسيج الإنشائي |
| 15 مل أنابيب الصقر | أي | أي | تستخدم أنابيب الصقر سعة 15 مل لتخزين العينات المستخدمة لقياسات طول الخلية أثناء إزالة العينات باستخدام الإيثانول المطلق وحمض اللاكتيك. |
| أنابيب Eppendorf أي | أي | أنابيب eppendorf تستخدم لتخزين العينات المستخدمة لقياسات طول النسيج الإنشائي في محلول الإيثانول: حمض الأسيتيك 3: 1 (v: v). | |
| قفازات | أي | قفازات لاتكس ، والتي تحمي من الكواشف المسببة للتآكل. | |
| حمض الخليك | أي | أي | تحذير: تآكل للمعادن, الفئة 1 تآكل الجلد, الفئات 1A,1B,1C تلف خطير في العين, الفئة 1; السوائل القابلة للاشتعال ، الفئات 1،2،3 |
| الإيثانول المطلق | أي | تحذير | : خطير في حالة ملامسة الجلد (مهيج) ، ملامسة العين (مهيج) ، الاستنشاق. خطورة قليلا في حالة ملامسة الجلد (المخترق), من ابتلاع |
| حمض اللاكتيك >98٪ | أي | أي تحذير: تآكل للمعادن, الفئة 1 تآكل الجلد, الفئات 1A,1B,1C تلف خطير في العين, كلوريد الصوديوم من الفئة 1 | |
| (NaCl) | أي | أي | |
| حمض إيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA)أي | أي | تحذير: سمية حادة (عن طريق الفم ، الجلد ، الاستنشاق) ، الفئة 4 تهيج الجلد ، الفئة 2 تهيج العين ، الفئة 2 حساسية الجلد ، الفئة 1 سمية العضو المستهدف المحدد – التعرض الفردي ، الفئة 3 | |
| تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان هيدروكلوريد (تريس-حمض الهيدروكلوريد) أي | أي يمكن | أن تكون هذه المادة مهيجة ، يجب تجنب ملامسة العينين والجلد. قد يكون استنشاق الغبار مزعجا للجهاز التنفسي. | |
| 4 & prime ؛ 6-diamidine-2 & prime ؛ -phenylindole dihydrochloride (DAPI) أي | مسبار ربط أخدود فلوري ثانوي قابل للاختراق للخلية للحمض النووي. يسبب تهيج الجلد. قد يسبب رد فعل تحسسي للجلد. قد يسبب تهيج الجهاز التنفسي. | ||
| الجليد | أي | NA | يجب أن يبقى حل DAPI على الجليد. |
| المجهر الفلوري | AxioScope A1 أو Axiocam ICm1 من Zeiss أو غيرها | يمكن استخدام أي مجهر فلوري لتحديد طول النسيج الإنشائي | |
| شريحة مجهرية | أي | غطاء | |
| زجاجي | أي | ||
| مطلوبة لفتح ورقة الذرة المدرفلة مباشرة بعد الحصاد من أجل قطع عينة مناسبة لطول الخلية وقياسات طول النسيج الإنشائي | |||
| برنامج تحليل الصور | Axiovision (الإصدار 4.8) من Zeiss | NA | يمكن تنزيل البرنامج على: http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/axiovision.html. يمكن أيضا استخدام برامج أخرى مثل ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). |
| مجهر مجهز ب DIC | AxioScope A1 أو Axiocam ICm1 من Zeiss أو غيرها | استخدام أي مجهر مجهز بتباين التداخل التفاضلي (DIC) لقياس أطوال الخلايا. | |
| R التحليل الإحصائي البرمجيات | R Foundation for Statistical Computing | NA | مفتوح المصدر; يمكن تنزيلها على البرنامج |
| النصي https://www.r-project.org/ R | NA | NA نحن نستخدم وظيفة تجانس النواة locpoly لحزمة Kern Smooth (Wand MP ، Jones MC. & nbsp ؛ تنعيم النواة: تشابمان & أمبير Hall/CRC (1995)). البرنامج النصي متاح لنظامي التشغيل Mac و Windows عند الاستفسار من المؤلف المقابل. |
المراجع
- Fiorani, F., Beemster, G. T. S. Quantitative analyses of cell division in plants. Plant Mol. Biol. 60, 963-979 (2006).
- Silk, W. K., Erickson, R. O. Kinematics of Plant-Growth. J. Theor. Biol. 76, 481-501 (1979).
- Rymen, B., Coppens, F., Dhondt, S., Fiorani, F., Beemster, G. T. S. Kinematic Analysis ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
