Method Article

تصميم وتنفيذ لإلقاء الضوء الآلي، التثقيف، ونظام أخذ العينات للتطبيقات الميكروبية علم البصريات الوراثي

DOI:

10.3791/54894

⸱

February 19th, 2017

 , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد قمنا بتصميم جهاز زراعة المستمر للاستخدام مع أنظمة علم البصريات الوراثي لتسليط الضوء على ثقافات الميكروبات والخلايا بانتظام صورة في النفايات السائلة مع مجهر مقلوب. ومؤتمتة للزراعة، وأخذ العينات، والتصوير، وتحليل الصور بشكل كامل بحيث يمكن قياس الاستجابات الحيوية إلى الإضاءة على مدى عدة أيام.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نظم علم البصريات الوراثي تستخدم البروتينات المشفرة وراثيا التي تغير التشكل ردا على موجات محددة من الضوء على تغيير العمليات الخلوية. هناك حاجة لزراعة وقياس الأنظمة التي تدمج برمجة الإضاءة والتحفيز من أنظمة علم البصريات الوراثي. نقدم بروتوكول لبناء واستخدام جهاز زراعة المستمر لتسليط الضوء على الخلايا الميكروبية بجرعات المبرمجة للضوء، وتلقائيا اكتساب وتحليل الصور من الخلايا في النفايات السائلة. تشغيل هذا الجهاز باعتباره ناظم كيميائي تسمح معدل النمو والبيئة الخلوية إلى أن رقابة مشددة. وأخذ عينات بانتظام النفايات السائلة للثقافة الخلية مستمرة ويتم تصوير الخلايا عن طريق قنوات متعددة المجهر. ومؤتمتة للزراعة، وأخذ العينات، والتصوير، وتحليل الصور بشكل كامل بحيث يتم قياس ردود ديناميكية في كثافة مضان والتشكل الخلوي للخلايا عينات من النفايات السائلة الثقافة على مدى عدة أيامدون تدخل من المستخدم. ونحن لشرح فائدة جهاز زراعة هذا عن طريق حفز إنتاج بروتين حيوي في سلالة من خميرة الخباز هندسيا مع نظام علم البصريات الوراثي الذي ينشط النسخ.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نظم علم البصريات الوراثي استخدام ضوء للتحكم في قائمة متزايدة من العمليات الخلوية بما في ذلك التعبير الجيني، 1، 2، 3، 4، 5 توطين البروتين، والنشاط 6 البروتين، 6، 7، 8 بروتين ملزمة و 8 و 9 و 10 و تدهور البروتين. 11 طريقة لزراعة الخلايا في بيئة تسيطر عليها مع التحفيز الضوئي المبرمج ولقياس رد فعلهم على امتداد فترات زمنية ذات الصلة بيولوجيا ضروري لاستغلال إمكانات هذه الأدوات للبحث في بيولوجيا الخلية والتكنولوجيا الحيوية. يأخذ طريقة لدينا ميزة chemostasis للحفاظ على معدل نمو الخلايا مستمر في إعادة خلط جيدا، عبد اللطيفمصنفة، والتحكم في درجة حرارته عاء زجاجي زراعة 12 و 13 التي تتعرض للإضاءة مبرمجة. نحن صورة الخلايا الفردية في النفايات السائلة الثقافة مع مجهر مقلوب لقياس استجابة للثقافة لإضاءة مبرمجة. هي الآلية للزراعة، وأخذ العينات، والتصوير، وتحليل الصور بشكل كامل بحيث يمكن قياس كثافة مضان والتشكل الخلوي للخلية ثقافة النفايات السائلة خلال عدة أيام دون تدخل من المستخدم.

هذا البروتوكول يمكن تنفيذها في معظم المختبرات مألوفة مع زراعة الخلايا النمو والفحص المجهري، وجهاز يستخدم غير مكلفة ومصنوعة من مكونات متوفرة بسهولة. يتم وضع السفينة زراعة شفافة فوق مصفوفة من الثنائيات الباعثة للضوء (المصابيح) قادرة على انبعاث 1 مللي واط / سم 2 -10 ميغاواط / سم 2 للضوء. تزرع الميكروبات في السفينة زراعة باستمرار؛ يستخدم مضخة تحوي واحدة لإضافة وسائل الإعلام فيمعدل التخفيف، يتم استخدام آخر لسحب الثقافة بمعدل أقل لالمجهر، والفرق يهرب من خلال منفذ تجاوز. تحتفظ وسادة التدفئة في درجات الحرارة. يتم ضخ الهواء باستمرار في الإناء زراعة للحفاظ على الضغط إيجابية، وكذلك لخلط وتهوية الثقافة. باستثناء مضخة الهواء، وينظم السلطة لهذه الأجهزة من قبل متحكم الذي يتلقى أيضا المدخلات من الحرارة وجهاز كمبيوتر سطح المكتب المتصل. يتم ضخ ثقافة الخلية النفايات السائلة إلى جهاز ميكروفلويديك على مرحلة مجهر مقلوب. واستحوذت غير الفلورسنت والصور الفلورسنت تلقائيا. وتتميز الخلايا في الصور عن طريق خوارزمية التي يقع كل خلية كمنطقة ذات الاهتمام (ROI) ويقيس خصائص كل العائد على الاستثمار.

لإثبات وجود تطبيق هذا البروتوكول، ونحن قياس استجابة لتفاوت شدة الضوء من خلايا خميرة الخباز هندسيا مع responsi زرقاء ضوءلقد نظام علم البصريات الوراثي التي تسيطر على نسخ من البروتين الفلوري. البيرة س، المعروف باسم خميرة الخباز تم اختيار، لأن النظم علم البصريات الوراثي متعددة للتحكم في التعبير الجيني في هذا النظام موجودة بالفعل 14، 15، 16. وعلاوة على ذلك، يتم استخدام هذا نموذج حي عادة للدراسات في نظم البيولوجيا 17 وكما هيكل لتطبيقات التكنولوجيا الحيوية 18، 19، 20. تظهر لنا نتائج ممثل أن هذا البروتوكول يمكن أن تستخدم للسيطرة النسخ ثقافة على مدى عدة أيام من خلال تغيير شدة الضوء المدخلات وقياس إنتاج مراسل الفلورسنت.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-protocol-1

الشكل 1: جهاز زراعة المستمر. ويبين هذا الرسم التخطيطي مبسطة كيف يجب أن يتم تجميعها الجهاز عند استخدامه للثقافة، يضيء، وقياس الخصائص البصرية للميكروبات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-protocol-2
الشكل 2: نظرة عامة على البروتوكول. يجب تكرار الخطوات الموجودة في المنطقة المظللة في كل مرة يتم استخدام البروتوكول. سيطرة حلقة مغلقة من الممكن 34، ولكن لم يتم تنفيذها في هذا البروتوكول.

1. تجميع ميزان الحرارة على حلبة المجلس

-page = "1"> figure-protocol-3
الرقم 3: اتصالات لقراءة القيم الحرارة. يوضح هذا الرسم البياني كيف يجب أن تكون متصلا ميزان الحرارة الرقمي للثنائي الفينيل متعدد الكلور بحيث متحكم يمكن الحصول على ردود فعل للسيطرة على درجة حرارة الثقافة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. لحام الأرضي، البيانات، وخطوط الجهد الإيجابية للميزان الحرارة الرقمي إلى كل منهم من خلال الثقوب التي تحمل العلامة "GD + V".
  2. مقطع من دبوس واحد من الإناث رأس 3-دبوس وتقليم دبابيس المتبقية 2 مع كليبرز الأسلاك، بحيث يمكن أن تندرج في اثنين من خلال الثقوب المسمى "R2" وليس عرقلة متحكم. لحام في هذا المكان. ربط اثنين من المسامير ملحوم عن طريق إدراج أوم المقاوم 4.7 في رأس دبوس.

2. قم بتوصيل كون السلطةمكونات المحول المتعدد العادي لمجلس الدارة

figure-protocol-4
الشكل 4: اتصالات للسيطرة على السلطة للسادة التدفئة. يوضح هذا الرسم البياني كيف يجب أن يتم تجميعها ثنائي الفينيل متعدد الكلور والملحقات من أجل السيطرة على السلطة للسادة التدفئة. الأجزاء للسيطرة ترتبط مضخات تحوي بطريقة مماثلة. لاحظ أن مكونات ميزان الحرارة قد أزيلت عن الوضوح. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. تقليم قبالة 1 سم من دبابيس من خمسة رؤوس 3-دبوس الإناث. لحام هذه لمواقف على لوحة الدوائر المطبوعة (PCB) وضع علامة "# 1"، "رقم 2"، "رقم 3"، "رقم 4"، و "سي بي إي"
  2. تقليم قبالة 1 سم من دبابيس من الإناث 6 دبوس و 8 رأس دبوس. لحام هذه جنبا إلى جنب لعمود من خلال الثقوب وصفت K1 من خلال K14.
  3. ربط لوحة التدفئة لوحات الدوائر الالكترونية.
    1. إدراج نهايات المقاوم أوم 100 في K1 من خلال الثقوب وصفت وK2 على الكلور. اضافة الى وجود الترانزستور معدن أكسيد أشباه الموصلات مجال التأثير (MOSFET) في موقف ملحوظ رقم 1 على ثنائي الفينيل متعدد الكلور، مع تسمية MOSFET التوجه نحو K1 من خلال K14 من خلال الثقوب بحيث دبوس المصدر هو الأقرب إلى "# "التسمية، ودبوس هجرة هو أبعد من" التسمية # ".
    2. قطع الخط الأرضي من (DC) كابل التيار الكهربائي 5 فولت التيار المباشر وذلك لربط J2. ربط خط الأرضي من سادة التدفئة إلى J1. ربط K3 دبوس إلى 3 مع أوم المقاوم 1. يجب أن تتدفق الحالية الآن فقط من J1 إلى J2 عند تعيين دبوس 3 إلى + 5V.z
      ملاحظة: المقاوم / MOSFET مجموعة يعمل بمثابة المفتاح الذي يسمح لتدفق الحالية من J1 دبوس إلى J2 عند تعيين دبوس 3 من متحكم إلى +5 V.
  4. الاتصالمضخة تحوي بطيئة.
    1. إدراج نهايات المقاوم أوم 100 في K4 من خلال الثقوب وصفت وK5 على الكلور. إدراج MOSFET في موقف ملحوظ رقم 2 على ثنائي الفينيل متعدد الكلور، مع تسمية MOSFET التوجه نحو K1 من خلال K14 من خلال الثقوب بحيث دبوس المصدر هو الأقرب إلى التسمية "#"، ودبوس هجرة هو أبعد من "#" ضع الكلمة المناسبة.
    2. قطع الخط الأرضي من العاصمة كابل التيار الكهربائي 12 فولت مضخة تحوي بطيئة. توصيل مضخة تحوي تواجه حد لJ3 وثؤلول جدار تواجه حد لJ4. ربط K6 يعلقون 4 مع أوم المقاوم 1. يجب أن تتدفق الحالية الآن فقط من J3 إلى J4 عند تعيين دبوس 4-5 V.
  5. توصيل مضخة تحوي سريعة
    1. إدراج نهايات المقاوم أوم 100 في K7 من خلال الثقوب وصفت وK9 على الكلور. إدراج MOSFET في موقف ملحوظ رقم 3 على ثنائي الفينيل متعدد الكلور، مع تسمية MOSFET التوجه نحو K1 من خلال K14 من خلال ثقوب الصورة س أن دبوس المصدر هو الأقرب إلى التسمية "#"، ودبوس هجرة هو أبعد من علامة "#".
    2. قطع الخط الأرضي من العاصمة كابل التيار الكهربائي 12 فولت مضخة تحوي سريعة. توصيل مضخة تحوي تواجه حد لJ5 وثؤلول جدار تواجه حد لJ6. ربط K9 يعلقون 5 مع أوم المقاوم 1. يجب أن تتدفق الحالية الآن فقط من J5 إلى J6 عند تعيين دبوس 5-5 V.

3. ربط مصفوفة LED إلى حلبة المجلس

figure-protocol-5
الرقم 5: اتصالات للسيطرة على الصمام مصفوفة. يوضح هذا الرسم البياني كيف يجب أن تكون متصلا الصمام مصفوفة لثنائي الفينيل متعدد الكلور. كما تبين أن الكلور يمكن أن تكون مكدسة على متحكم. لاحظ أن مكونات ميزان الحرارة والتحكم في التيار المستمر إلى الأجهزة الأخرى قد أزيلت عن الوضوح.وفاق / ftp_upload / 54894 / 54894fig5large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. لحام 6 دبوس، 10-دبوس، واثنين من 8 دبوس رؤوس دبوس الإناث في الثقوب من خلال على الجانبين من الكلور بحيث يمكن أن تكون مكدسة على رأس متحكم.
  2. لحام 100 طراز NF والمكثفات μF 10 إلى مواقف ملحوظ على ثنائي الفينيل متعدد الكلور، مشيرا إلى أن السالب لل10 μF مكثف (الرصاص أقصر) يجب أن تكون متصلا من خلال حفرة ملحوظ مع علامة سلبية.
  3. لحام سائق الصمام إلى 2 من 12 مجموعة من خلال الثقوب، مع المسافة البادئة على السائق بعيدا عن طريق ثقوب محفوظة لالصمام مصفوفة.
  4. لحام 2 الأعمدة رؤوس دبوس الذكور إلى الثقوب من خلال وضع علامات لالصمام مصفوفة، وتقليم ينتهي من هذه تحت اللوح بحيث أنها لن تعرقل متحكم. ربط هذه إلى قطعتين 8-سلك من الأسلاك الطائر أنثى / أنثى. ربط مجموعة ثانية من الذكوررؤوس دبوس على الطرف الآخر من الأسلاك الطائر.
  5. إدراج الصمام مصفوفة على مدى متوسط ​​من اللوح، ومن ثم إدراج مجموعة ثانية من رؤوس دبوس إلى الأعمدة على جانبي المصفوفة. تأكد من أن التوصيلات الكهربائية هي نفسها كما لو كان الصمام مصفوفة قد ترتبط مباشرة إلى PCB مع الجانب المسمى المصفوفة الموافق العمود المسمى من خلال الثقوب.
  6. مقطع من دبوس واحد من الإناث رأس 3-دبوس وتقليم دبابيس المتبقية 2 مع كليبرز الأسلاك، بحيث يمكن أن تندرج في اثنين من خلال الثقوب المسمى "R1" وليس عرقلة متحكم. جندى هذا. ربط اثنين من المسامير ملحوم عن طريق إدراج أوم المقاوم 1 في رأس دبوس.
    ملاحظة: سيتم مكدسة السفينة زراعة فوق الصمام مصفوفة. إذا شرائط سلك تعرقل السفينة، ويقابل لهم من المصفوفة. ثم، استخدم سلك نواة صلبة من أجل سد الفجوة بين دبابيس مصفوفة والمسامير الأسلاك الشريط، مثل أن التوصيلات الكهربائية لا CHانجى.

4. تثبيت البرامج والاتصال الأجهزة

  1. كومة من الكلور على متحكم.
  2. اتبع الروابط في قائمة المواد لتحميل بيئة التطوير المتكاملة (IDE) والتعليمات البرمجية المخصصة للمتحكم.
  3. ربط متحكم إلى الكمبيوتر المجهر عبر كابل AB الناقل التسلسلي العالمي (USB). تجميع وتحميل رمز مخصص لمتحكم.
  4. تحميل الصغرى مدير 21 و 22 و 23 في فيجي. تكوين الصغير مدير بمثابة المساعد فيجي عن طريق نسخ جميع ". DLL" الملفات، "mmplugins" الدليل، و "mmautofocus" الدليل من الدليل الذي تم تحميل الصغرى مدير في "Fiji.app" الدليل. أيضا، نسخ "الإضافات / مايكرو-مدير" الدليل في "Fiji.app/plugins" الدليل.
  5. تحميل "BioreactorController.jar" ملف كثافة العملياتس "Fiji.app/mmplugins" الدليل.
  6. فتح مايكرو-Manager من فيجي> ملحقات> الصغرى، مدير> الصغرى، مدير الاستوديو. استخدام معالج تكوين الأجهزة لتكوين برنامج لمراقبة المجهر. تشمل "FreeSerialPort" الجهاز في معالج مع التسمية من المنفذ الذي يتم توصيل كابل USB AB.

5. جعل وتميز ضميمة خفيفة مضادة للسفينة التثقيف

  1. كومة ثلاثة 8 دبوس مآخذ IC لبنات البناء على اللوح في كل ركن من أركان الصمام مصفوفة مثل أن السفينة زراعة يمكن أن يستريح عليها فوق المصفوفة.
  2. ربط جزء من ورقة نشرها تحت الطبقة العليا من مآخذ، بحيث ضوء ضرب السفينة زراعة من الصمام مصفوفة هو منتشر.
  3. قطع ثلاثة 8 "بنسبة 6" أجزاء من رغوة سوداء. قطع جزء هذا هو نفس حجم اللوح الالكتروني (2.3 "× 3.5") من داخل طوماس فيبس الأولس والجزء الذي هو حجم المستطيل الذي أحرزته مآخذ IC (0.9 "× 1.8") من داخل المركز الثالث. كومة هذه الطبقات على الصمام مصفوفة مثل أن الطبقة النهائية التي تحتوي على 0.9 "× 1.8" فتحة تكمن حتى مع الجزء العلوي من مآخذ IC، وتحيط الصمام مصفوفة.
  4. قطع ورقة إضافية من رغوة سوداء في نصف لجعل المستطيل 6 "24". لفة هذا في عمود أجوف من رغوة سوداء أن السفينة زراعة يمكن أن تندرج في غرفة مع الأنابيب والأسلاك، بحيث سوف حراريا وبصريا عزل السفينة زراعة.
  5. توسيط عمود أجوف من رغوة سوداء فوق الصمام مصفوفة، وترسيم الحدود من العمود على طبقة من رغوة سوداء تحتها. وهذه الحدود علامة حيث يجب أن تركز في المستقبل.
  6. قطع 3 "س 3" جزء من رغوة سوداء. استخدام هذا فيما بعد غطاء يمكن أن تكون مسجلة على الجزء العلوي من العمود لحجب الضوء الخارجي.
  7. ونعلق أجهزة الاستشعار السلطة الضوئي إلى th البريد زراعة غطاء السفينة مع الشريط، ونعلق الغطاء، وإدراج السفينة زراعة في العلبة.
  8. في الدقيقة مدير، انتقل إلى الإضافات> التحكم مفاعل حيوي. تعيين مصفوفة لإلقاء الضوء على مجموعة فرعية من مجموعة من شدة ممكنة في الصورة فترات 30.
  9. تسجيل شدة الضوء كما هو معروض على وحدة السلطة متر متصلا استشعار القوة. وهذه القياسات تمكين كثافة الفعلية للضوء أن تكون معروفة عندما تم تعيين عدد من المصابيح التي تضاء و(PWM) الحالي التضمين نبض عرض لتلك المصابيح.

6. إعداد سفينة التثقيف

figure-protocol-6
الشكل 6: اتصالات سفينة. يوضح هذا الرسم البياني كيف يجب أن تكون متصلا السفينة وأنابيب من الجهاز قبل أن يتم تعقيمها.على بياض "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. علامة ذروة المقابلة لكل 2 مل زيادة السائل في حدود 10 مل إلى 30 مل في وعاء زراعة. إدراج 10 مل من الماء منزوع الأيونات معقمة، بمناسبة منسوب المياه، إضافة 2 مل، بمناسبة منسوب المياه، وتكرار حتى يتم وضع علامة على مستوى 30 مل. تغطية علامات مع الشريط واضحة بحيث لا تتم إزالتها بسهولة، والتخلص من السائل.
  2. ضع نهاية فترة طويلة من ميناء الألومنيوم من خلال طوقا سيليكون، في الإناء زراعة. المسمار على الغطاء.
  3. تغطية واحد منفذ ميناء القصير الألومنيوم مع 1/16 "أنابيب السيليكون الهوية. قم بتوصيل النهاية البعيدة عن طريق إدخال قفل LUER الإناث ومن ثم توصيل LUER الذكور المكونات القفل. هذا هو منفذ التكميلي، ولن تستخدم (أنبوب 6 في الشكل (6) ).
  4. ربط جزأين قصيرة من 1/16 "أنابيب السيليكون معرف مع الذكور والإناث أقفال LUER بتوصيل أحد طرفي منفذ ميناء القصير الألومنيوم وتوصيل distaل نهاية مع LUER الذكور والإناث LUER المكونات القفل. سيتم تلقيح السفينة من خلال هذا الأنبوب (أنبوب 7 / 7.1 في الشكل 6).
  5. توصيل جهازي 1/16 "أنابيب الهوية لنهايات 1/16" أنابيب تحوي الرقم والموصلات. قم بتوصيل أحد إلى منفذ الألومنيوم قصيرة والمكونات الأخرى (أنبوب 4 في الشكل 6). وفي وقت لاحق، هذا وسيتم ربط إلى القارورة وسائل الإعلام.

7. إعداد قارورة وسائل الإعلام

  1. توصيل "أنبوب قطره الداخلي (ID) سيليكون لأطول ميناء الألومنيوم. الأنبوب يجب أن تكون طويلة بما فيه الكفاية للوصول إلى قارورة سائل الإعلام. توصيل 1/8" 1/16 قفل LUER معرف الذكور إلى قطعة قصيرة من 1/16 " أنابيب الهوية، وربط هذه إلى أنبوب السابقة ،، ثم قم بإدراج هذا الجزء القصير في سدادة مطاطية على قارورة سائل الإعلام (أنبوب 3 في الشكل 6).
  2. المشبك أنبوب. هذا الصدد يسمح بتدفق الهواء من القارورة وسائل الإعلام إلى سفينة الثقافة. عندما يتم ضخ قارورة سائل الإعلام في وقت لاحق مع جو د هذا الأنبوب هو غير مثبت، وثقافة وسوف تكون مختلطة، تهوية، والاحتفاظ بها في ضغط إيجابي من قبل فقاعات واردة.
  3. إدراج "أنبوب معرف طويلة بما فيه الكفاية للوصول إلى قاع القارورة في سدادة، التي سيتم من خلالها نقل وسائل الإعلام. قم بتوصيل آخر 1/16" 1/16 أنبوب معرف لهذه واحدة، وبعد ذلك أنبوب 3/16 "معرف ل أن. هذه المكونات مع "معرف قفل LUER الإناث 3/16 وقابس قفل LUER الذكور (أنبوب 1 / 1.1 في الشكل 6).
  4. يجب ملء الحفرة الثالث في سدادة مع قطعة صغيرة من 1/16 "أنابيب الهوية، متصلة جزأين أخرى من الأنابيب بقطر المتوسط وتوصيله في النهاية البعيدة (أنبوب 2 / 2.1 في الشكل 6). وسيتم ربط هذه لمضخة الفراغ وفي وقت لاحق إلى مضخة ماء.
    ملاحظة: إذا كانت الأنابيب لا يمكن التوفيق بينها بسهولة من خلال الفتحات الموجودة في سدادة مطاطية، وقطع نهايات الأنابيب في الميل. ثم، في نهاية يميل التي دفعت من خلال ثقب يمكن أن تستخدم لسحب ما تبقى من خلال.

SS = "jove_title"> 8. إعداد مياه الصرف قارورة

  1. اضافة الى وجود قفل LUER الذكور في الشريحة من 1/16 "أنابيب السيليكون الهوية، ومن ثم إدراج بحزم 0.022" تترافلوروإيثيلين معرف (PTFE) أنابيب. بشكل منفصل، إرفاق قفل LUER الإناث إلى 1/16 "أنبوب الهوية. ثم، نهاية موضوع واحد على طول الأنبوب PTFE لربط الأقفال والآخر إلى منفذ الألومنيوم قصيرة (أنبوب 5 في الشكل 6).
  2. ربط يتعرض "أنبوب السيليكون معرف إلى 1/50" 1/50 أنبوب تحوي الرقم والموصلات. لهذا، ربط ثلاثة قطاعات من 1/50 "أنابيب الهوية وجزأين من 0.022" أنابيب PTFE الهوية، بالتناوب لهم. ربط هذا إلى قارورة مياه الصرف عبر 1/16 "أنابيب الهوية (أنبوب 5 في الشكل 6).
  3. ربط واحدة من نهاية أنبوب 1/16 "سيليكون معرف لثاني أطول أنبوب من ميناء الألومنيوم والطرف الآخر إلى قارورة مياه الصرف، وهذا أنبوب الألومنيوم يحدد حجم ثقافة، والثقافة الزائدة تجاوزات في وعاء النفايات السائلة (أنبوب 8 في
  4. الأوتوكلاف التجمع زراعة في 121 درجة مئوية و 15 رطل (التعقيم العام) لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: أنابيب من خلالها يتم تعبئة القارورة سائل الإعلام، والتي يتم من خلالها فراغ فضاء القارورة وسائل الإعلام، والتي يتم من خلالها تلقيح السفينة زراعة دينا شرائح متعددة من الأنابيب بحيث إذا ملوثة قطاع البعيدة، ويمكن إزالته لتكشف عن وجود عقيم قطعة.

9. إعداد قناة ميكروفلويديك

  1. مزيج ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS) وكيل علاج في 9: 1 نسبة. ديغا وتصب على قالب السيليكون الرئيسي.
  2. علاج PDMS لمدة 2 ساعة عند 65 درجة مئوية ثم تنخفض من قناع بشفرة حلاقة. خفض حول PDMS حتى تطلق من القالب. تجنب دفع إلى أسفل وكسر رقاقة الهش.
  3. استخدام 1.2 ملم معرف حفرة خزعة الناخس لكمة ثقوب في كلا طرفي القناة.
  4. السندات البلازما PDMS إلى غطاء زجاجي 24.
  5. الشريط الطويل ينتهي من الزجاج غطاء للدعم هيكل من الألومنيوم بحيث قناة PDMS يتركز على هيكل من الألومنيوم، ثم يخبز PDMS مرة أخرى لمدة 2 ساعة عند 65 درجة مئوية.

10. ملء قارورة وسائل الإعلام

figure-protocol-7
الرقم 7: إضافة وسائل الإعلام. يوضح هذا الرسم البياني كيف وسائل الإعلام يجب أن يكون الفراغ التي تمت تصفيتها في قارورة وسائل الإعلام. ومن يضمن أن وسائل الإعلام لا تزال عقيمة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. جعل وسائل الإعلام المناسبة. إذا كان سيتم تشغيلها على نظام زراعة المستمر باعتباره ناظم كيميائي، استخدام وسائل الإعلام تقتصر على المواد الغذائية المحددة.
    ملاحظة: أمثلة من تكوين وسائل الاعلام القياسية للدراسات مع البيرة س وقد نشرت سابقا 25،= "XREF"> 26، 27، 28، 29.
  2. نعلق مرشح فراغ زجاجة 100 مل، وإزالة الغطاء الحلمة، ثم إزالة المكونات الأبيض من الحلمة للمرشح الفراغ مع ملاقط معقمة.
  3. ربط أنبوب السيليكون 3/16 "معرف إلى الحلمة، أنبوب الحرة الأخرى قارورة سائل الإعلام إلى مضخة فراغ (أنابيب 1 و 2 في الشكل 7، على التوالي)، والتأكد من أن الأنبوب الذي يربط بين قارورة سائل الإعلام إلى السفينة زراعة يشد اغلاق (أنبوب 3 في الشكل 7).
  4. ملء فلتر مع وسائل الإعلام، بدوره على مضخة فراغ، ومن ثم تصفية بقية وسائل الإعلام. المشبك أنبوب السيليكون 1/16 "معرف متصلة الفراغ (أنبوب 2 في الشكل 7) وإيقاف مضخة فراغ.
  5. إزالة leurs من شريحة متوسطة من 1/16 "أنابيب معرف متصلة مضخة فراغ بحيث حدا غير ملوثة للأنبوب يمكن الوصول إليها. أدخل عشره نهاية الزرقاء العقيمة فلتر الهواء حقنة في هذا الأنبوب.
  6. المشبك أنابيب 3/16 "سيليكون معرف (أنبوب 1 في الشكل 7) وقطع بالتركيبة الذكور منه. افصل القابس من بالتركيبة الإناث من أنبوب مدخل وسائل الاعلام السفينة زراعة في بتوصيل هذه luers الذكور والإناث إلى تمكين وسائل الإعلام أن تكون ضخ السفينة زراعة.
  7. إزالة عامل التصفية فراغ ولحد مل زجاجة 100 من وسائل الإعلام التي كانت تعلق على فلتر فراغ.
  8. قبل يوم واحد سيتم تلقيح السفينة زراعة، تطعيم مستعمرة واحدة من الميكروب علم البصريات الوراثي في ​​أنبوب اختبار مع 4 مل من وسائل الإعلام التي تم جمعها في الخطوة السابقة، وتركها تنمو بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية أو أفضل درجة حرارة النمو في درجة الحرارة والثقافة في مع الإثارة.

11. تجميع جهاز حول مجهر

  1. تعيين التجمع زراعة المستمر بالقرب المجهر مع قارورة وسائل الإعلام أعلى من السفينة زراعة وeffluوالأنف والحنجرة قارورة أقل من السفينة زراعة، مثل أن أنبوب يتكون من شرائح 0.022 "أنابيب PTFE معرف (أنبوب 5 في الشكل 6) يمكن أن تصل إلى مرحلة المجهر. الشريط بشكل آمن أسفل سدادات المطاط على قارورة سائل الإعلام وحاويات النفايات السائلة.
  2. افصل طرفي "أنابيب PTFE معرف من 1/50" 0.022 أنبوب السيليكون معرف ربطها (أنبوب 5 في الشكل 6)، والمكونات هذه الغايات في مدخل ومخرج الجهاز ميكروفلويديك.
  3. قم بتوصيل الطرف البيضاء للفلتر الهواء المحقنة إلى مضخة ماء. وضغط الهواء دفع وسائل الاعلام الى السفينة زراعة.
  4. عندما يصل وسائل الإعلام على مستوى ميناء النفايات السائلة، والتفاف 1/16 "وسائل الاعلام معرف أنابيب مدخل والموصلات حول المضخة تحوي بطيئة (أنبوب 4 في الشكل 6) و1/50" معرف عينة منفذ الأنابيب والموصلات حول الصيام مضخة تحوي (أنبوب 5 في الشكل 6).
  5. تهوية وسائل الإعلام من قبل unclamping وتو الهواءما بين القارورة وسائل الإعلام وزراعة السفينة.
  6. الشريط لوحة التدفئة والحرارة إلى السفينة زراعة بحيث يمكن التحكم في درجة الحرارة. لفائف الأنابيب وسائل الإعلام حول السفينة زراعة حتى وسائل الإعلام الدخول سوف تكون على نفس درجة حرارة السفينة.
    ملاحظة: PWM الحالية إلى لوحة التدفئة ينظمها متحكم الذي يستخدم المدخلات من الحرارة للحفاظ على سفينة زراعة في درجة الحرارة المضبوطة مسبقا لها.
  7. إدراج السفينة زراعة في الضميمة رغوة سوداء فوق الصمام مصفوفة، والتأكد من أن الأنابيب لا مقروص.
  8. في الدقيقة مدير، انتقل إلى الإضافات> التحكم مفاعل حيوي. تعيين "نسبة الإعلام مضخة في" حقل إلى 0.1 و"نسبة مضخة عينة على" حقل إلى 0. ومعدل التدفق تكون منخفضة جدا، ولكن أكبر من معدل التبخر.
  9. المشبك أنبوب الهواء واردة بين القارورة وسائل الإعلام وزراعة السفينة. إزالة القابس من أنبوب التلقيح (أنبوب 7 في الشكل
  10. تغطية العلبة بحيث يدخل أي ضوء، والسماح للثقافة تنمو بين عشية وضحاها.

12. معايرة ومعدلات الضخ

  1. في الدقيقة مدير، انتقل إلى الإضافات> التحكم مفاعل حيوي. تعيين "نسبة ضخ وسائل الإعلام على" حقل إلى 0.5 و"نسبة مضخة عينة على" حقل إلى 0.
  2. قطع أنبوب الفائض من القارورة النفايات السائلة (أنبوب 8 في الشكل 6) وأنبوب أخذ العينات من القارورة النفايات السائلة (أنبوب 8 في الشكل 6) وجمع النفايات السائلة في الأوعية منفصلة. جمع النفايات السائلة لمدة 1 ساعة، ابتداء من بعد كانت مضخات لمدة 15 دقيقة.
  3. حساب معدل تدفق وسائل الاعلام في الإناء زراعة من حجم جمعها في وعاء على النحو التالي:
    figure-protocol-8
  4. ضبط قيمة "نسبة ضخ وسائل الإعلام حول" الميدانية التي قام بها هذا التقدير الخطي:
    figure-protocol-9
    أين
    figure-protocol-10
  5. تكرار خلال هذا الإجراء المعايرة حتى الفرق بين معدل التدفق المطلوب ومعدل التدفق قياسه هو <0.2 مل / ساعة، حيث بلغ متوسط ​​معدل التدفق خلال الفترة من 1 ساعة.
  6. زيادة قيمة "نسبة العينة على" حقل ومعايرة بطريقة مماثلة حتى يتم ضخ ما يقرب من 4/5 عشر من حجم مغادرة السفينة زراعة بها مضخة أخذ العينات وتقريبا 1/5 عشر من حجم يترك من خلال ميناء تجاوز.
  7. السماح للكثافة الثقافة في جهاز زراعة المستمر يوازن في ظل هذه الظروف بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: إذا لم يمكن الوصول إلى معدلات تدفق الهدف، وتغيرأنابيب مضخة تحوي. ويتم ضخ السائل بمعدل أعلى عند استخدام أكبر أنابيب قطرها. اتبع الخطوة 14 ثم العودة إلى الخطوة 8.4.

13. مجهر صور اجمع من الميكروبات مثقف

  1. ملء قائمة الوظيفة المرحلة في الدقيقة Manager مع مجموعة من المواقف غير متداخلة في الصور التي الخلايا ضخها في قناة ميكروفلويديك سيكون في المستوى البؤري.
  2. فتح "مفاعل حيوي وحدة تحكم" البرنامج المساعد. تحديد المطلوب بالطبع الصمام مرة المصفوفة، قنوات التصوير، وإعدادات تجريبية أخرى من المطالبات. جمع وتحليل الصور.
  3. أثناء تشغيل التجربة، تأكد من أن وسائل الإعلام في قارورة وسائل الإعلام لا يزال واضحا. إذا كان غائما، ثم تم ملوثة.

14. بعد التجربة

  1. التخلص من وسائل الإعلام، والثقافة الخلايا الزائدة والنفايات السائلة.
  2. إعادة ملء قارورة وسائل الاعلام مع 200 مل من 20٪ ETOH مختلطة مع الماء منزوع الأيونات. تشغيل ناظم كيميائي كما كان في السابقتم تشغيل خلال التجربة لتغسل الحطام الخلية وسائل الإعلام.
  3. عندما حل الكحول استنزفت من القارورة وسائل الإعلام، تفكيك ناظم كيميائي تماما.
  4. غسل الأواني الزجاجية والأنابيب بالماء الدافئ والمنظفات معتدل، وشطف جيدا بالماء منزوع الأيونات. تترك لتجف.
  5. فتح ملف "microcontrollerRecords.csv" لإعادة النظر في درجة الحرارة وحالة الصمام مصفوفة على مسار التجربة، وملف "Summary.csv" لاستعراض بيانات موجزة من كل مجموعة من الصور و"النتائج <ن> بتنسيق csv" ملفات لمراجعة البيانات التي تلخص كل العائد على الاستثمار من كل فترة زمنية، حيث n هو ن مجموعة البيانات عشر.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد استخدم هذا الجهاز لتحفيز ثقافة البيرة س التعبير عن بروتين فلوري أصفر (YFP) ردا على الأزرق الضوء عبر نظام النسخ علم البصريات الوراثي محرض على أساس البروتين زوج CRY2 / CIB1 30. وقد نمت الخلايا chemostatically في وسائل الإعلام محدودة الفوسفات بمتوسط ​​معدل التخفيف من 0.2 ± 0.008. يستخدم الحد الفوسفات عادة في S. تجارب ناظم كيميائي الخباز للسيطرة على معدل النمو وآثار الحد الفوسفات وتتميز أيضا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد قمنا بتصميم هذا الجهاز مع المرونة في الاعتبار. جميع الرموز المستخدمة مجاني ومفتوح المصدر. عملية تحليل الصورة الافتراضية إلى خلايا جزء بسيط ويعمل بسرعة. يمكن تنفيذ تحليل مخصصة عن طريق تسجيل مدخلات المستخدم أثناء تحليل صورة تمثيلية مع واجهة المستخدم الرسومية في فيجي، وتحويل المدخلات إلى برنامج نصي بيانشيل، ثم تعيين المساعد لاستدعاء النصي. عندما يطلق عليه، سيتم إرسال هذا السيناريو مجموعة سلسلة تسمى "الصور" التي تحتوي على مسارات الملفات لأحدث مجموعة من الصور، طرح الخلفية...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونود أن نعترف مولي لازار وفيرونيكا دلغادو للمساعدة في اختبار البروتوكول، كيران سويني لإجراء مناقشات مفيدة والتحرير، وتايلور سكوت يا أحد، adirekkun، وستيفاني جيلر لقراءة نقدية للمخطوطة. ميغان نيكول ماكلين، دكتوراه حاصل على جائزة شهادة في واجهة العلم من صندوق ويلكوم بوروز.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
دليل مختبر شاملGitHubNAيتوفر دليل مختبر شامل يتم تحديثه بانتظام في " ملفات العلاج الكيميائي البصري الوراثي" مستودع GitHub (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). يتضمن ذلك أيضا وصفا لقالب الموائع الدقيقة المستخدم لتوليد النتائج التمثيلية.
Fritzing Design ViewerFritzingNAيتوفر البرنامج المجاني مفتوح المصدر لعرض وتحرير تصميمات لوحات الدوائر من النوع .fzz في "http://fritzing.org/download/"
Arduino Uno R3 (Atmega328 - مجمع) Adafruit50Microcontroller. 1 مطلوب.
Arduino Stackable Header KitSparkFun Electronics10007رؤوس دبوس أنثى لتوصيل ثنائي الفينيل متعدد الكلور بوحدة التحكم الدقيقة. 1 مطلوب.
مكواة لحام قابلة للتعديل 30 واط 110 فولت - XY-258 110 فولتAdafruit180لإجراء التوصيلات الكهربائية بثنائي الفينيل متعدد الكلور. 1 المطلوب.
حامل لحام الحديدAdafruit150لإجراء التوصيلات الكهربائية بثنائي الفينيل متعدد الكلور. 1 المطلوب.
بكرة لحام صغيرة - 60/40 لحام صنوبري الرصاص 0.031 بوصة قطر - 100 جرامAdafruit145لإجراء التوصيلات الكهربائية بثنائي الفينيل متعدد الكلور. 1 مطلوب.
0.1 & مو F مكثفSparkFun ElectronicsCOM-08375يعمل على استقرار الجهد في ثنائي الفينيل متعدد الكلور. 1 مطلوب.
10 و مو ؛ F مكثفSparkFun ElectronicsCOM-00523يعمل على استقرار الجهد في ثنائي الفينيل متعدد الكلور. 1 مطلوب.
MAX7219CNG LED مصفوفة / برنامج تشغيل عرض رقمي - MAX7219مكسيمMAX7219CNGبرنامج تشغيل LED. 1 مطلوب.
8 دبوس IC مقبسالماوس الإلكترونيات575-14430816 مطلوب. سيتم تكديسها فوق بعضها البعض لدعم وعاء الاستزراع فوق مصفوفة LED.
24 دبوس IC مقبسMouser Electronics535-24-3518-10اختياري. استخدم هذا لتوصيل برنامج تشغيل MAXIM 7219CNG بثنائي الفينيل متعدد الكلور بشكل عكسي.
مقياس رقميمتعدد Adafruit2034لاستكشاف أخطاء الإلكترونيات وإصلاحها. 1 مطلوب.
رؤوس Break Away - ذكر 40 سنا (طويل المنتصف ، PTH ، 0.1 بوصة)SparkFun ElectronicsPRT-12693رؤوس دبوس ذكر لمصفوفة LED متصلة بلوحة الدوائر المطبوعة. يمكن قطع النهايات باستخدام قواطع الأسلاك. 1 مجموعة مطلوبة. 
قواطع الأسلاك القطرية المتدفقةAdafruit152لتقليم رؤوس الدبوس الطويلة وقطع كابلات الطاقة. 1 مطلوب.
أسلاك العبور الإناث / الإناث الممتازة - 40 × 12 بوصة (300 مم)Adafruit793لتوصيل اللوح بمصفوفة LED. يمكن توصيلها من طرف إلى طرف برؤوس دبوس ذكور لتكون أطول. 1 مطلوب.
لوح التجارب نصف الحجمAdafruit64ستتصل مصفوفة LED بهذا وستستقر وعاء الاستزراع فوقه.
ضوء مصفوفة LED أزرق 8 × 8مصغر. الطول الموجي السائد هو 470 نانومتر (أزرق). 1 مطلوب. تتوفر مصفوفات LED المصغرة البديلة من نفس البائع بأطوال موجية سائدة: 624 نانومتر (أحمر) ، 588 نانومتر (أصفر) ، 525 نانومتر (أخضر) ، 572 نانومتر (أصفر-أخضر) ، وأبيض.
قابل للتكديس - 3 دبوسSparkFun Electronics138758 مطلوب.
طقم المقاوم - 1/4 واط (إجمالي 500)SparkFun Electronics10969للإلكترونيات. 1 مطلوب.
  IRL520N MOSFETالدولي مقومIRL520Nمفتاح تنظيم الجهد للتحكم في تيار التيار المستمر. 4 المطلوب.
سلك التوصيل - تشكيلة (نواة صلبة ، 22 AWG)سلك SparkFun ElectronicsPRT 11367للإلكترونيات. 1 مطلوب.
مصدر طاقة تبديل 5 فولت 2 أمبير (2000 مللي أمبير) -Adafruit276لوسادة التدفئة و Arduino. 2 مطلوب.
محول طاقة التبديل المنظم 12 فولت تيار مستمر 1000 مللي أمبير - مدرج في قوائم ULAdafruit798للمضخات التمعجية. 2 مطلوب.
وسادة تسخين كهربائية - 10 سم × 5 سمAdafruit1481لتسخين المفاعل الحيوي. 1 مطلوب.
مضخة التمعجية متغيرة التدفق منخفضةالتدفق فيشر Scientific13-876-1لوسائط الضخ. 1 مطلوب
مضخة تمعجية متغيرة التدفق متوسطفيشر Scientific13-876-2لثقافة الضخ. 1 مطلوب.
محول طاقة التبديل المنظم 9 VDC 1000mA - مدرجفي قوائم UL Adafruit63لإمدادات الطاقة المتحكم الدقيق. الأمر 1.
مستشعر درجة حرارة رقمي مقاوم للماء DS18B20 درجة حرارة + إضافاتAdafruit642للمفاعل الحيوي. 1 مطلوب.
MicromanagerMicromanagerNAيتوفر برنامج التحكم المجهري المجاني مفتوح المصدر في "https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release"
FIJIImageJNAيتوفر برنامج تحليل الصور المجاني مفتوح المصدر في "http://fiji.sc/"
Arduino Integrated Development EnvironmentArduinoNAيتوفر IDE المجاني مفتوح المصدر في "https://www.arduino.cc/en/Main/Software"
الرمز المخصصGitHubNAيتوفر رمز المتحكم الدقيق المخصص والمكون الإضافي "Bioreactor Controller" في " ملفات العلاج الكيميائي البصري الوراثي" مستودع GitHub (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
كابل USB A إلى B - 6 أقدامSparkFun ElectronicsCAB-00512يستخدم لتنزيل البيانات إلى متحكم دقيق. 1 مطلوب.
bioreactorTimecourse_example.csvGitHubNAتتمثل ميزة تحميل قيم مصفوفة LED من ملف CSV في أنه يمكن استدعاء البرنامج بواسطة البرنامج الإضافي لتحديث هذه القيم بناء على نتائج تحليل الصور ، ويمكن إعادة تحميل هذه القيم إلى وحدة التحكم الدقيقة ، مما يتيح التحكم في التغذية الرجوعية. وهي متوفرة من " ملفات العلاج الكيميائي البصري الوراثي" مستودع GitHub (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
جل توتا فروست (ورق الانتشار)B& amp HB& H # LOFSFTL
MFR # T1-72		لمصفوفة LED. 1 مطلوب.
Kitting Sheet Crosslink 1 / 4x12x24inGrainger ، Inc20JL37رغوة سوداء لزراعة حاوية السفينة. 4 مطلوب.
مستشعر طاقة الصمام الثنائي الضوئي القياسي ، Si ، 200 - 1100 نانومتر ، 50 ميغاواط & nbsp ؛ThorlabsS120VCلقياس شدة الضوء. 1 مطلوب.
شريط الملصقاتفيشر Scientific159015Nلوضع العلامات وتأمين المكونات السائبة. 1 مطلوب.
وحدة تحكم مقياس الطاقة والطاقة المدمجة ، LCD رقمي مقاس 4 بوصاتThorlabsPM100Dلقياس شدة الضوء. 1 مطلوب.
زجاجة زجاجية تهجين 100 مل GL45Bellco Glass ، Inc.(7910-40150)وعاء المفاعل الحيوي. 1 مطلوب.
ستة منافذ تجميعBellco Glass، Inc.مخصص لوعاء المفاعل الحيوي. مواصفات الأنابيب: .125 "OD × .055" ID. المنفذ أ: 1.0 "طويل فوق سبيكة الغطاء وإلى أسفل الأنبوب. المنافذ B ، C ، E ، F: 1.0 بوصة فوق سبيكة الغطاء ، بطول 33 مم أدناه. المنفذ D: 1.0 بوصة بطول فوق سبيكة الغطاء ، 65 مم   ؛ بوقت طويل أدناه. 1 مطلوب. يتضمن غطاء لولبي مفتوح من مادة البولي بروبيلين بقطر 45 مم وحشية سيليكون بيضاء لضمان إحكام الإغلاق بين الغطاء والوعاء.
سكوتش ماجيك الشريط 3105 ، 3/4 × 300 بوصة ، عبوة من 3سكوتش شفافB0009F3P3Uأمازون. هذا متاح من العديد من البائعين الآخرين. يتم استخدامه لتغطية العلامات على وعاء الزراعة وتأمين الغطاء الزجاجي بقناة PDMS إلى إطار دعم الألومنيوم.
1/16 "معرف × 3/16" OD × 1/16 "جدار Tygon أنابيب سيليكون صحيةشركة الولايات المتحدة البلاستيكية.57288أنابيب. ~ 25 ' مطلوب.
سدادة مطاطية بيضاء من Cole-Parmer Twistit ، مقاس 10Cole-ParmerEW-62992-32سدادة قارورة وسائط وسدادة قارورة مياه الصرف الصحي. 2 مطلوب.
قارورة مختبر 2 لترPyrex4980قارورة وسائط وقارورة نفايات سائلة. 2 مطلوب.
يوم pinchcockفيشر Scientific5867لإغلاق أنابيب القرص. 3 مطلوب.
مجموعة الأنابيب البديلة 1/16 "معرفالمنتجات القابلة للتتبع3372تأتي المضخات التمعجية مع مجموعة من الأنابيب ، لكنها تبلى بعد أسابيع من الاستخدام.
مجموعة الأنابيب البديلة 1/50 "معرفالمنتجات القابلة للتتبع3371تأتي المضخات التمعجية مع مجموعة من الأنابيب ، لكنها تبلى بعد أسابيع من الاستخدام.
ذكر لور مع حلقة قفل × 1/16 "خرطوم شائكة ، نايلون ، 25 / pkCole-ParmerEW-45505-00موصلات. ~ 10 السور مطلوبة.
ذكر لور مع حلقة قفل × 1/8 "خرطوم شوكة ، نايلون ، 25 / pkCole-ParmerEW-45505-04موصلات. 5 مطلوبة ، واحدة لكل فتحة سدادة مطاطية لملء الأنابيب.
أنثى لور × 1/16 "خرطوم شوكة محول ، نايلون ، 25 / عبوةCole-ParmerEW-45502-00موصلات. ~ 10 السور المطلوبة.
أنثى لور × 3/16 "محول خرطوم شوكةموصلات Cole-ParmerEW-45502-08. ~ 10 luers المطلوبة.
ملحق Cole-Parmer Luer ، غطاء لوير أنثوي ، نايلون ، ملحق 25 / PkCole-ParmerSC-45502-28
Cole-Parmer Luer ، قابس قفل لور ذكر ، نايلون ، 25 / PkCole-ParmerEW-45505-56
Microjore PTFE Tubing ، 0.022 "ID × 0.042" OD ، 100 قدم / لفةCole-ParmerEW-06417-21أنابيب. 1 لفة مطلوبة.
أنابيب سيليكون معالجة بالبلاتين Masterflex ، L / S 13 ، أنابيبCole-ParmerEW-96410-1325 قدما. ~ 25 'مطلوب.
3/16 "معرف × 1/4" OD × 1/32 "جدار Tygon أنابيب سيليكون صحيةشركة الولايات المتحدة البلاستيكية.57293أنابيب. ~ 1 ' مطلوب.
فلتر فراغفيشر Scientific974107مرشح فراغ Nalgene لوسائط الترشيح المعقمة.
Aquel Oxy-Boost 200Rena Aquatic SupplyAP200مضخة هواء مزدوجة التدفق قابلة للتعديل للغشاء للتهوية وخلط الوسائط. 1 مطلوب.
0.2 & مرشح حقنة المسامm Corning International431229هذا يضمن أن الهواء من مضخة الحوض لا يلوث الجهاز. 1 المطلوب.
Slygard 184 سيليكون المطاط الصناعي كيتداو كورنينجسليجارد 184لجهاز الموائع الدقيقة. 1 مطلوب.
شفرات الحلاقة الأمريكية للسلامة GEM شفرات حلاقة علمية أحادية الحافةفيشر Scientific17989000لقطع الأنابيب و PDMS. 1 شفرة مطلوبة.
مثقاب ثقب هاريس أحادي النواة 1.2 مم معرفسيجما ألدريتشWHAWB100028 ALDRICHلثقب مدخل / مخرج في جهاز الموائع الدقيقة. 1 مطلوب.
غطاء المجهر الزجاجي 22x60-1.5فيشر Scientific12-544-Gلجهاز الموائع الدقيقة. 1 مطلوب.
إطار من الألومنيوم مستطيل مع نافذة مربعةمخصصمخصص لدعم قناة الموائع الدقيقة. الأبعاد الخارجية: 3 بوصات × 1.25 بوصة.
الأبعاد الداخلية (الجزء المقطوع): 7/8 بوصة × 7/8 بوصة
السماكة: ~ 1/32 بوصة
شريط سلكي مصدر رأس مصدر طاقة مدرج في قوائم UL ميزان حرارة شريط

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Motta-Mena, L. B., Reade, A., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature chemical biology. 10 (3), 196-202 (2014).
  2. Hughes, R. M., Bolger, S., Tapadia, H., Tucker, C. L. Light-mediated control of DNA transcription in yeast. Methods. 58 (4), 385-391 (2012).
  3. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).
  4. Polstein, L. R., Gersbach, C. a Light-inducible spatiotemporal control of gene activation by customizable zinc finger transcription factors. J Am Chem Soc. 134 (40), 16480-16483 (2012).
  5. Polstein, L. R., Gersbach, C. a A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation. Nature Chemical Biology. 11 (3), 198-200 (2015).
  6. Yang, X., Jost, A. P. T., Weiner, O. D., Tang, C. A light-inducible organelle-targeting system for dynamically activating and inactivating signaling in budding yeast. Molecular biology of the cell. 24 (15), 2419-2430 (2013).
  7. Lee, S., Park, H., et al. Reversible protein inactivation by optogenetic trapping in cells. Nature methods. 11 (6), 633-636 (2014).
  8. Kennedy, M. J., Hughes, R. M., Peteya, L. A., Schwartz, J. W., Ehlers, M. D., Tucker, C. L. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
  9. Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. Induction of protein-protein interactions in live cells using light. Nat Biotechnol. 27 (10), 941-945 (2009).
  10. Zoltowski, B. D., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. Blue light-induced dimerization of a bacterial LOV-HTH DNA-binding protein. Biochemistry. 52 (38), 6653-6661 (2013).
  11. Renicke, C., Schuster, D., Usherenko, S., Essen, L. O., Taxis, C. A LOV2 Domain-Based Optogenetic Tool to Control Protein Degradation and Cellular Function. Chemistry & Biology. 20 (4), 619-626 (2013).
  12. Novick, A., Szilard, L. Description of the chemostat. Science (New York, N.Y.). 112 (2920), 715-716 (1950).
  13. Monod, J. La technique de culture continue. Théorie et applications. Ann. Inst. Pasteur. 79 (4), 390-410 (1950).
  14. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature Biotechnology. 20, 1041-1044 (2002).
  15. Kennedy, M. J., Hughes, R. M., Peteya, L. A., Schwartz, J. W., Ehlers, M. D., Tucker, C. L. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7, 973-975 (2010).
  16. Olson, E. J., Tabor, J. J. Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology. Nature chemical biology. 10 (7), 502-511 (2014).
  17. Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: An experimental organism for 21st century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
  18. Galanie, S., Smolke, C. D. Optimization of yeast-based production of medicinal protoberberine alkaloids. Microbial cell factories. 14 (1), 144(2015).
  19. Gerngross, T. U. Advances in the production of human therapeutic proteins in yeasts and filamentous fungi. Nature biotechnology. 22 (11), 1409-1414 (2004).
  20. van Maris, A. J. A., Abbott, D. A., et al. Alcoholic fermentation of carbon sources in biomass hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae: current status. Antonie van Leeuwenhoek. 90 (4), 391-418 (2006).
  21. Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using µManager. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 14 (2010).
  22. Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of biological methods. 1 (2), (2014).
  23. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  24. Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
  25. Saldanha, A. J., Brauer, M. J., Botstein, D. Nutritional homeostasis in batch and steady-state culture of yeast. Molecular Biology of the Cell. 15, 4089-4104 (2004).
  26. Boer, V. M., Tai, S. L., et al. Transcriptional responses of Saccharomyces cerevisaie to preferred and nonpreferred nitrogen sources in glucose-limited chemostat cultures. FEMS Yeast Research. 7, 604-620 (2007).
  27. Boer, V. M., Amini, S., Botstein, D. Influence of genotype and nutrition on survival and metabolism of starving yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 6930-6935 (2008).
  28. Brauer, M. J., Huttenhower, C., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response and metabolic activity in yeast. Molecular Biology of the Cell. 19, 352-367 (2008).
  29. Gresham, D., Dunham, M. J. The enduring utility of continuous culturing in experimental evolution. Genomics. 104 (6), 399-405 (2014).
  30. Liu, H., Yu, X., et al. Photoexcited CRY2 interacts with CIB1 to regulate transcription and floral initiation in Arabidopsis. Science (New York, N.Y.). 322 (5907), 1535-1539 (2008).
  31. McIsaac, R. S., Oakes, B. L., Wang, X., Dummit, K. A., Botstein, D., Noyes, M. B. Synthetic gene expression perturbation systems with rapid, tunable, single-gene specificity in yeast. Nucleic Acids Research. 41 (4), 1-10 (2013).
  32. McIsaac, R. S., Petti, A. A., Bussemaker, H. J., Botstein, D. Perturbation-based analysis and modeling of combinatorial regulation in the yeast sulfur assimilation pathway. Molecular biology of the cell. 23 (15), 2993-3007 (2012).
  33. McIsaac, R. S., Silverman, S. J., et al. Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae. Molecular biology of the cell. 22 (22), 4447-4459 (2011).
  34. Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures. Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 6 (3), 366-372 (2014).
  35. Brauer, M. J., Huttenhower, C., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Molecular biology of the cell. 19 (1), 352-367 (2008).
  36. Boer, V. M., Crutchfield, C. A., Bradley, P. H., Botstein, D., Rabinowitz, J. D. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Molecular biology of the cell. 21 (1), 198-211 (2010).
  37. Markham, B. E., Byrne, W. J., Methods, E. Uptake, storage and utilization of phosphate by yeast. Journal of the Institute of Brewing. 73, 271-273 (1967).
  38. Kazemi Seresht, A., Palmqvist, E. A., Olsson, L. The impact of phosphate scarcity on pharmaceutical protein production in S. cerevisiae: linking transcriptomic insights to phenotypic responses. Microbial cell factories. 10 (1), 104(2011).
  39. Shimizu, K. Regulation Systems of Bacteria such as Escherichia coli in Response to Nutrient Limitation and Environmental Stresses. Metabolites. 4 (1), 1-35 (2013).
  40. Olson, E. J., Hartsough, L. A., Landry, B. P., Shroff, R., Tabor, J. J. Characterizing bacterial gene circuit dynamics with optically programmed gene expression signals. Nature methods. 11 (4), 449-455 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Optogenetic SystemsContinuous CulturingMicrobial CellsProgrammed IlluminationAutomated SamplingMulti channel MicroscopyChemostat OperationFluorescence IntensitySaccharomyces cerevisiaeOptogenetic Transcription

Related Articles