Research Article
Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
توضح هذه الدراسة القائم على التصوير مقايسة تحييد الدقيقة لتحليل العلاقات بين المستضدات الفيروسات. بروتوكول توظف الماسحة الضوئية المسطحة، ولها أربع خطوات، بما في ذلك المعايرة، الكميات المعايرة، تحييد، والكميات التعادل. الفحص يعمل بشكل جيد مع الحالي تعميم الأنفلونزا A (H1N1) pdm09، A (H3N2)، والفيروسات B.
اختبار التحييد الدقيق (MN) هو تقنية قياسية لقياس عدوى فيروس الأنفلونزا وتثبيط تكاثر الفيروس. في هذه الدراسة ، نقدم بروتوكول اختبار MN القائم على التصوير لتحديد العلاقات المستضدية الحقيقية بين الفيروسات. على عكس فحوصات تقليل البلاك النموذجية التي تعتمد على اللويحات المرئية ، فإن هذا الاختبار يحدد إجمالي عدد الخلايا المصابة لكل بئر. يطابق البروتوكول نوع الفيروس أو النوع الفرعي مع اختيار خطوط الخلايا لتحقيق أقصى قدر من العدوى، مما يعزز تباين العينة أثناء التصوير ومعالجة الصور. يحدد إدخال المعايرة بالتحليل الكمي كمية فيروسات الإدخال للتحييد ويتيح نتائج التجارب المختلفة من أن تكون قابلة للمقارنة. يجعل إعداد التصوير مع ماسح ضوئي مسطح وبرنامج مجاني قابل للتنزيل النهج إنتاجية عالية وفعالة من حيث التكلفة وسهلة الاستخدام وسهلة النشر في معظم المختبرات. توضح دراستنا أن مقايسة MN المحسنة تعمل بشكل جيد مع فيروسات الأنفلونزا A (H1N1) pdm09 و A (H3N2) و B المنتشرة الحالية ، دون أن تتأثر بشكل كبير ببدائل الأحماض الأمينية في النورامينيداز (NA) لفيروسات A (H3N2). إنه مفيد بشكل خاص لتوصيف الفيروسات التي تنمو إلى عيار منخفض HA و / أو تخضع لعدوى مجهضة تؤدي إلى عدم القدرة على تكوين لويحات في الخلايا المستزرعة.
وتستخدم الجزئي إبطال مفعول (MN) فحوصات في علم الفيروسات لتحديد الكميات من تحييد الأجسام المضادة والأنشطة المضادة للفيروسات. كبديل لتثبيط التراص (مرحبا) المقايسات، المقايسات MN يمكن التغلب على الآثار غير مولدة تتأثر بالتغيرات تقارب مستقبلات ملزم في فيروسات الأنفلونزا، والتي يمكن أن تعقد تفسير مرحبا النتائج 1،2،3. حتى وقت قريب، واستندت معظم فحوصات MN على آثار الاعتلال الخلوي (CPE) أو المقايسات المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) 4،5. وقد وضعت فحوصات MN على أساس التركيز والبلاك تخفيض في عام 1990 6،7،8. فحوصات للحد من اللطخ تعتمد على عد لويحات واضحة لتحديد العدوى. ومع ذلك، تعول البصرية تغطي سوى اللوحات الكبيرة التي هي للحل من قبل العين البشرية، على الرغم من أن الغالبية العظمى من لويحات صغيرة وغير مرئية للعديد من الفيروسات المنتشرة الحالية. هذه التغطية غير مكتملة يمكن أن يسبب تفاوتا واضحا بين الممتحنين وبين التجارب، مما يؤدي إلى iالنتائج ncomparable. ومن المستحيل أيضا استخدام الأسلوب عندما يظهر بعض الفيروسات العدوى فاشلة من الخلايا واحد أو لويحات صغيرة جدا.
ويمكن تحسين دقة العد الفقراء من خلال إدخال بروتوكول القائم على التصوير. مع التقدم في التكنولوجيا، والمجهر الضوئي والإنتاجية العالية يمكن للقراء جيدا لوحة توفر وسائل دقيقة لعدد الخلايا المصابة 9. تحت المجهر عبر مضاءة، الخلايا المصابة ذات الكلمات الدلالية مع بعض علامات يمكن تصور بواسطة امتصاص أو مضان المقابل لها في قرار الفرعية الخلوية. ومن ثم يمكن تحليلها عينة على شاشة الكمبيوتر.
للأسف، بسبب قيود في مجال الرؤية، يطلب أكثر من مائة الصور بالبلاط لتغطية بئر واحدة. ان تحليل لوحة مع 96 بئرا تتطلب التصوير وتجهيز حوالي عشرة آلاف من الصور. هذه العملية شاقة هي مضيعة للوقت ومكلفة، والقرار المكتسبة في أجناسل لا لزوم له لتوصيف روتينية من العدوى الفيروسية. مختبرات بميزانية محدودة قد تجد أن النهج تتمحور حول الماسحة الضوئية المسطحة يوفر، بديلا فعالا من حيث التكلفة الإنتاجية العالية.
في هذه الورقة، ونحن تصف تحسين الحد من الترسبات MN الفحص التي هي مناسبة لتوصيف الأنتيجين عدد كبير من الفيروسات ولقياس كميا الأنشطة المضادة للفيروسات والأجسام المضادة التعادل. فحص ديها العديد من المزايا: أولا، هو فحص القائم على التصوير التي هي قادرة على قياس العدوى بالفيروس على المستوى الخلوي، بغض النظر عن حجم اللوحة. عد مجموع السكان الخلية المصابة (ICP) داخل بئر يزيد من حساسية الكشف، مما يجعل من الممكن لتوصيف الفيروسات مع العدوى منخفض. ثانيا، يتم إدخال المعايرة الكمية أكثر دقة قبل تحييد لتحديد كمية الفيروس الإدخال. فيروس المدخلات الكمي يقلل بشكل ملحوظ من فاريانشوئها بين مختلف التجارب ويجعل النتائج أكثر قابلية للمقارنة بين المختبرات. ثالثا، التتر تحييد يمكن تحديد بشكل مباشر من خلال تحليل الصور، مما يجعل الكميات سريع وسهل الاستعمال. وأخيرا، يقدم بروتوكول بديلا فعالا من حيث التكلفة والإنتاجية العالية لهذا القرار المطلوبة والدقة. ويستند الكميات على الماسحة الضوئية المسطحة والبرمجيات الحرة معالجة البيانات. الإعداد كله لديه بصمة صغيرة وهو الانتشار في معظم المختبرات.
بروتوكول المعروضة في هذه الورقة يتكون من أربع خطوات رئيسية، بما في ذلك المعايرة فيروس، الكميات المعايرة، تحييد الفيروس، وتحديد الكميات التعادل. فيروس المعايرة هي تجربة إعداد الذي يحدد كمية الفيروسات المدخلات التي ستستخدم في التعادل. خلال المعايرة، يتم تطبيق عدد من تركيزات الفيروسية إلى الطبقات الوحيدة الخلية في لوحة 96-جيدا. ثم يتم quantitated الخلايا المصابة في القسم 2. dilu الفيروسينشوئها التي تنتج 20٪ -85٪ ICP وبدوره تطبق على الفيروسات مساهمة في تحييد المقابلة في القسم 3. كميا والتتر من بروتوكول تحييد باستخدام القسم 4. التجارب التي تلت يتم عرض البروتوكولات المذكورة أعلاه في ممثل النتائج. وقد تم اختبار فحص دقيق خلال العامين الماضيين مع معظم فيروسات الأنفلونزا المنتشرة الحالية، مثل A (H1N1) pdm09، A (H3N2)، والفيروسات B. وقد أدرجت نتائج توصيف فيروس الانفلونزا في التقارير عن الاجتماع التشاوري لمنظمة الصحة العالمية التي أعطت توصيات بشأن لقاحات الأنفلونزا للاستخدام في نصف الكرة الجنوبي في عام 2016 وفي نصف الكرة الشمالي في 2016-2017.
ملاحظة: مستوى السلامة الحيوية (بي إس إل) لبروتوكول التالية BSL 2 لفيروسات الأنفلونزا الموسمية وBSL 3+ لفيروسات الإنفلونزا الجائحة المحتملة. مطلوب المعايرة الفيروسية في وقت مبكر من تجربة تحييد لتحديد تركيز الفيروسي من السيطرة الفيروسية (VC).
1. الفيروسات المعايرة
ملاحظة: اعتمادا على عدد من الفيروسات وعدد من التكرارات، لوحة جيدا يمكن إعدادها مع المرونة التالية: (1) يمكن أن يكون ترتيب التخفيف الفيروسي على طول إما الصفوف أو الأعمدة (الشكل 1). كل فيروس يجب أن تحتل صف / عمود منفصل. (2) وتخفيف الزيادة الفيروسية مرنة، ولكن يجب أن تبدأ مع أعلى تركيز الفيروس في الزاوية العلوية اليسرى. (3) لا توجد قيود على عدد من التكرارات.
ملاحظة: مدين داربي الكلى الكلاب (MDCK) وMDCK-SIAT1 تفضلت (SIAT) الخلايا عن طريق الدكتور محمد Matrosovich، ماربورغ، المانياالكثير 10. خلايا SIAT هي خلايا MDCK ستابلي مع الإنسان CMP-N-acetylneuraminate: الجين بيتا-غالاكتوزيد α-2،6-sialyltransferase لتعزيز التعبير عن الحامض اللعابي (SA) يغوساكاريدس α2-6Gal إنهاء.
2. المعايرة الكميات
3. الفيروسات تحييد
ملاحظة: احسب عدد من لوحات اللازمة لفحص التعادل. كل لوحة يمكن أن تستوعب فيروس واحد وعدد من أمصال مضادة.
ملاحظة: اعتمادا على عدد من أمصال مضادة وعدد من التكرارات، لوحة جيدا يمكن إعدادها مع الالبريد التالية المرونة: (1) وتخفيف المصل يمكن ترتيب على طول إما صف أو عمود (الشكل 4). كل مصل أن تحتل صف منفصل أو عمود. (2) زيادة من تخفيف المصل مرنة، ولكن يجب أن تبدأ مع أعلى تركيز مصل في الزاوية العلوية اليسرى من لوحة. (3) عدد التكرارات أرصدة عدد من أمصال مضادة. يمكن للمزيد من التكرارات تساعد على تذليل الاختلافات التجريبية. (4) عدد الرأسمالي وعدد من سيطرة خلية (CC) مكررة مرنة، ولكن ينبغي أيضا أن تكون في صفوف منفصلة أو الأعمدة. ومن المتوقع أن عدد التكرارات VC هو أكبر بكثير من أن من أمصال مضادة.
4. تحييد الكمي
وفقا للإجراءات المذكورة أعلاه، فإننا نقدم بعض النتائج من التجارب توصيف مولدة الأخيرة. وقد تم تصميم الإعداد المعايرة لدراسة ثمانية الفيروسات المدخلات، مع مكررة مزدوجة لكل التخفيف. تم اختبار التخفيفات الفيروسية بين 1.0 × 10 -1 و 1.0 X 1.0 -6 لتغطية الاختلافات بين الفيروسات. وقد تبين أن فيروسات اختبار من النوع الفرعي H3N2، بما في ذلك A / الكاميرون / 15V-3538/2015، A / فلاديفوستوك / 36/2015 A / موسكو / 103 / عام 2015، A / تومسك / 5/2015 /، A / موسكو / 101 / 2015، A / موسكو / 100/2015، A / موسكو / 133/2015، و A / براتيسلافا / 437/2015. وتعرض نتائج المعايرة في الشكل (5). يوضح الشكل 5D انخفاض مركزا آخر مع زيادة تخفيف الفيروس. وتم تطبيع منحنيات ضد مركزا آخر من نفس الفيروسات التي أسفرت عن إصابات في جميع الخلايا داخل بئر 12 (كما هو موضح ICP التشبع). إذا لم ICP تصل التشبع مع مرحباghest تركيز الفيروس، تم استخدام المتوسط برنامج المقارنات الدولية من التكرارات المقابلة بدلا من ذلك (A / موسكو / 103/2015 في الشكل 5D). وقد تم اختيار التخفيفات الفيروس الذي ينتج 30٪ من برنامج المقارنات الدولية التشبع مثل تخفيف فيروس مدخلات لتحييد (الجدول 3).
تحييد تهدف لفيروس مدخل واحد ضد خمسة أمصال مضادة، مع مكررة مزدوجة على كل لوحة. فيروس إشارة المعروض H3N2 A / ستوكهولم / 63/2015. وأمصال مضادة الخمسة هي A / هونج كونج 4801/14 البيض F12 / 15، A / هونج كونج 7295/14 MDCK F02 / 15، A / جنوب أفريقيا R2665 / 15 SIAT F50 / 15، A / السويسري 9715923/13 SIAT NIBF F18 / 15، و A / الهولندية 525/14 SIAT F23 / 15. وتعرض نتائج هذا التحييد في الشكل (6). ويبين الشكل 6D التقدم الإصابة مع زيادة تخفيف المصل. السكان إيجابي تطبيع على المحور الرأسي يمثل نسبة مركزا آخر من الاستجابة أمصال مضادة المقابلة ضد متوسط ICP الفيروس إشارة 12. تم طرح برنامج المقارنات الدولية خلفية من الضوابط الخلايا غير المصابة خلال التطبيع. تم تحديد التتر تحييد باسم مقلوب من التخفيفات مصل الموافق 50٪ تخفيض برنامج المقارنات الدولية (الجدول 4). وقد استخدم خطي الاستيفاء لتقدير التتر الوقوع بين اثنين من التخفيفات المصل المجاورة.
الشكل 1: مثال على الإعداد بشكل جيد لوحة في تجربة المعايرة الفيروس. يتم تعيين الفيروسات اختبار لصفوف منفصلة (A إلى H). تم تصميم الأعمدة لمختلف التخفيفات الفيروسية (1-12). واستخدمت عمودين كما التكرارات لكل التخفيف الفيروسي. شريط النطاق = 10 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ف together.within الصفحات = "1"> 
الشكل 2: الخطط نظام عينة المسح. (أ) لوحة 96 جيدا على الموقف التصوير من الماسحة الضوئية المسطحة (نشرها من مرجع 11 بإذن من السيفير BV)، و (ب) أبعاد الحد موقف L-الشكل المبين في الفقرة (أ). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): مخطط سطح المكتب من "Wellplate قارئ" البرمجيات الكميات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5: نتائج تجربة المعايرة. (أ) الإعداد جيدا لوحة، (ب) تفحص جيدا لوحة صورة، (ج) التوضيحمن ترميز اللون، quantitated، السكان الخلية المصابة بالفيروسات، و (د) تطبيع السكان الخلية المصابة بالفيروسات ضد التخفيفات الفيروس. تم استخدام 30٪ ICP كما العتبة. أشرطة الخطأ في الفقرة (د) هي الانحرافات المعيارية (SD) من الازدواجية العينة (± 1 SD). الحانات النطاق في (ب) و (ج) = 10 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: نتائج تجربة التعادل. (أ) الإعداد جيدا لوحة، (ب) الصورة الممسوحة ضوئيا بشكل جيد لوحة، (ج) توضيح ل، السكان الخلية المصابة بالفيروس quantitated، و(د) تطبيع السكان الخلية المصابة بالفيروسات ضد تمييع الدم. في السادس المدخلاتروس (VC) هو A / ستوكهولم / 63/2015. تم استخدام 50٪ ICP لحساب التتر. أشرطة الخطأ في الفقرة (د) هي الانحرافات المعيارية (SD) من الازدواجية العينة (± 1 SD). الحانات النطاق في (ب) و (ج) = 10 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
S1 التكميلية: يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.
| تخفيف نموذجي | ||
| خلايا MDCK | خلايا MDCK-SIAT1 | |
| 2 أيام | 1: 5 (1 + 4) | 01:10 (1 + 9) |
| 3 أيام | 01:10 (1 + 9)01:20 (1 + 19) | |
| عدد نموذجي من الخلايا لكل مل | ||
| خلايا MDCK | خلايا MDCK-SIAT1 | |
| 2 أيام | 2 × 10 5 | 1 × 10 5 |
| 3 أيام | 1 × 10 5 | 5 × 10 4 |
الجدول 1: التخفيفات النموذجية على ثقافة فرعية قوارير متكدسة من خلايا MDCK أو MDCK-SIAT1.
| طريقة | الوضع المهني |
| نوع الوثيقة | فيلم (مع دليل مساحة فيلم) |
| نوع التعرض للسيارات | صورة فوتوغرافية |
| ايمنوع السن | 24 بت لون |
| قرار | 1200 نقطة في البوصة |
| تنسيق الصورة المحفوظة | شجار |
الجدول 2: إعداد نموذجي من الماسحة الضوئية المسطحة.
| صف | فيروس | التخفيف الموصى بها |
| ا | A / كاميرون / 15V-3538/2016 | 1.0 × 10 -2 |
| ب | A / فلاديفوستوك / 36/2015 | 1.0 × 10 -3 |
| C | A / موسكو / 103/2015 | 1.1 × 10 -1 |
| د | A / تومسك / 5/2015 | 5.9 × 10 -1 |
| ه | A / موسكو / 101/2015 | 8.3 × 10 -1 |
| F | A / موسكو / 100/2015 | 1.4 × 10 -2 |
| G | A / موسكو / 133/2015 | 1.3 × 10 -2 |
| H | A / براتيسلافا / 437/2015 | 1.3 X 10 -4 |
الجدول 3: التخفيفات الفيروسية تحسب من عدد سكانها 30٪ لبرنامج المقارنات الدولية.
| عمود | أمصال مضادة | عيار الموصى بها |
| 1-2 | A / HK4801 / 2014 | 110 |
| 3-4 | A / HK7295 / 2014 | 213.3 |
| A / جنوب افريقيا / R2665 / 2015 | 2155.8 | |
| 7-8 | A / سويسرا / 9715293/2013 | 89.4 |
| 9-10 | A / هولندا / 525/2014 | 78.6 |
الجدول 4: التتر بنسبة 50٪ لبرنامج المقارنات الدولية من A / ستوكهولم / 63/2015 ضد أمصال مضادة.
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
توضح هذه الدراسة القائم على التصوير مقايسة تحييد الدقيقة لتحليل العلاقات بين المستضدات الفيروسات. بروتوكول توظف الماسحة الضوئية المسطحة، ولها أربع خطوات، بما في ذلك المعايرة، الكميات المعايرة، تحييد، والكميات التعادل. الفحص يعمل بشكل جيد مع الحالي تعميم الأنفلونزا A (H1N1) pdm09، A (H3N2)، والفيروسات B.
يشكر المؤلفون الدكتور M. Matrosovich على توفير خطوط الخلايا MDCK و MDCK-SIAT1 الأصلية و Roche Pharmaceuticals لتزويد كربوكسيل أوسيلتاميفير. كما نقدر الدكتورة آن ويستون لاقتراحاتها القيمة حول المخطوطة. واعتمدت هذه الدراسة على التعاون القيم بين مراكز الأنفلونزا الوطنية التابعة لمنظمة الصحة العالمية ومراكز النزلة الوافدة التابعة لمنظمة الصحة العالمية داخل نظام المعلومات الجغرافية العالمي لمنظمة الصحة العالمية، التي قدمت فيروسات الأنفلونزا المستخدمة. تم تمويل هذا العمل من قبل مجلس البحوث الطبية من خلال البرنامج U117512723.
| VGM | Sigma | D6429 ، P0781 | 500 مل DMEM + 5 مل قلم / Strep < sup > b < / sup> |
| PBS A | طبيعة درجة الحموضة محلول ملحي مخزن بالفوسفات: كلوريد الصوديوم 10 & nbsp ؛ ز ، KCl 0.25 ؛ (ز)، Na2HPO4 1,437 g, KH2PO4 0,25 g, وDist. Water 1 L. | ||
| أفيسيل | FMC | RC-581F | 2.4 جم في 100 مل من الماء المقطر المذاب عن طريق التقليب على محرك مغناطيسي لمدة 1 ساعة. |
| 2x DMEM | Gibco | 21935-028 | |
| تراكب التربسين | سيجما | T1426 | |
| (10 مل / لوحة): | 5 مل 2x DMEM ، التربسين 2 ؛ مو جم / مل التركيز النهائي ، Avicell 5 & nbsp ؛ مل | ||
| Triton X- 100e | Sigma | المخزن المؤقت للنفاذية T8787: 0.2٪ في PBS A (v / v) | |
| Tween 80 | Sigma | P5188 | Wash Buffer: 0.05٪ Tween 80 in PBS A (v / v) |
| مصل الحصان | PAA Labs Ltd | B15-021 | ELISA Buffer: 10٪ في PBS A (v / v) + 0.1٪ Tween 80 |
| Mouse MAb ضد الأنفلونزا من النوع A | Biorad | MCA 400 | 1st< / sup> الأجسام المضادة: 1: 1,000 في ELISA Buffer |
| Goat المضاد للفأر IgG (H + L) HRP المترافق | Biorad | 172-1011 | 2nd< / sup> الجسم المضاد: 1: 1,000 في ELISA Buffer |
| True Blu peroxidase الركيزة | KPL & nbsp ؛ | 50-78-02 | الركيزة: أزرق حقيقي + 0.03٪ H2< / sub>O2< / sub>g< / sup> (1: 1،000 من محلول 30٪) 96 |
| جيدا ألواح ميكروتيتر مسطحة | القاع Costar & nbsp ؛ | 3596 | |
| قنوات غسالة متعددة الجدران ومشعب | Sigma | M2656 | |
| Perfection Plate Scanner | Epson | V750 Pro | يمكن تنزيل برنامج التصوير بحرية من http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134& infoType=التنزيلات. |
| بيئة تشغيل البرمجيات: نافذة LabVIEW | National Instruments Corporation | المستندة إلى NI | Vision builder الإصدار: LabVIEW2012 أو أعلى |
