Method Article

الاستفادة المثلى من الكمية الصغيرة تحييد الفحص

DOI:

10.3791/54897

⸱

December 14th, 2016

 ,  , 
1Mill Hill Laboratory, The Francis Crick Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضح هذه الدراسة القائم على التصوير مقايسة تحييد الدقيقة لتحليل العلاقات بين المستضدات الفيروسات. بروتوكول توظف الماسحة الضوئية المسطحة، ولها أربع خطوات، بما في ذلك المعايرة، الكميات المعايرة، تحييد، والكميات التعادل. الفحص يعمل بشكل جيد مع الحالي تعميم الأنفلونزا A (H1N1) pdm09، A (H3N2)، والفيروسات B.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اختبار التحييد الدقيق (MN) هو تقنية قياسية لقياس عدوى فيروس الأنفلونزا وتثبيط تكاثر الفيروس. في هذه الدراسة ، نقدم بروتوكول اختبار MN القائم على التصوير لتحديد العلاقات المستضدية الحقيقية بين الفيروسات. على عكس فحوصات تقليل البلاك النموذجية التي تعتمد على اللويحات المرئية ، فإن هذا الاختبار يحدد إجمالي عدد الخلايا المصابة لكل بئر. يطابق البروتوكول نوع الفيروس أو النوع الفرعي مع اختيار خطوط الخلايا لتحقيق أقصى قدر من العدوى، مما يعزز تباين العينة أثناء التصوير ومعالجة الصور. يحدد إدخال المعايرة بالتحليل الكمي كمية فيروسات الإدخال للتحييد ويتيح نتائج التجارب المختلفة من أن تكون قابلة للمقارنة. يجعل إعداد التصوير مع ماسح ضوئي مسطح وبرنامج مجاني قابل للتنزيل النهج إنتاجية عالية وفعالة من حيث التكلفة وسهلة الاستخدام وسهلة النشر في معظم المختبرات. توضح دراستنا أن مقايسة MN المحسنة تعمل بشكل جيد مع فيروسات الأنفلونزا A (H1N1) pdm09 و A (H3N2) و B المنتشرة الحالية ، دون أن تتأثر بشكل كبير ببدائل الأحماض الأمينية في النورامينيداز (NA) لفيروسات A (H3N2). إنه مفيد بشكل خاص لتوصيف الفيروسات التي تنمو إلى عيار منخفض HA و / أو تخضع لعدوى مجهضة تؤدي إلى عدم القدرة على تكوين لويحات في الخلايا المستزرعة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتستخدم الجزئي إبطال مفعول (MN) فحوصات في علم الفيروسات لتحديد الكميات من تحييد الأجسام المضادة والأنشطة المضادة للفيروسات. كبديل لتثبيط التراص (مرحبا) المقايسات، المقايسات MN يمكن التغلب على الآثار غير مولدة تتأثر بالتغيرات تقارب مستقبلات ملزم في فيروسات الأنفلونزا، والتي يمكن أن تعقد تفسير مرحبا النتائج 1،2،3. حتى وقت قريب، واستندت معظم فحوصات MN على آثار الاعتلال الخلوي (CPE) أو المقايسات المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) 4،5. وقد وضعت فحوصات MN على أساس التركيز والبلاك تخفيض في عام 1990 6،7،8. فحوصات للحد من اللطخ تعتمد على عد لويحات واضحة لتحديد العدوى. ومع ذلك، تعول البصرية تغطي سوى اللوحات الكبيرة التي هي للحل من قبل العين البشرية، على الرغم من أن الغالبية العظمى من لويحات صغيرة وغير مرئية للعديد من الفيروسات المنتشرة الحالية. هذه التغطية غير مكتملة يمكن أن يسبب تفاوتا واضحا بين الممتحنين وبين التجارب، مما يؤدي إلى iالنتائج ncomparable. ومن المستحيل أيضا استخدام الأسلوب عندما يظهر بعض الفيروسات العدوى فاشلة من الخلايا واحد أو لويحات صغيرة جدا.

ويمكن تحسين دقة العد الفقراء من خلال إدخال بروتوكول القائم على التصوير. مع التقدم في التكنولوجيا، والمجهر الضوئي والإنتاجية العالية يمكن للقراء جيدا لوحة توفر وسائل دقيقة لعدد الخلايا المصابة 9. تحت المجهر عبر مضاءة، الخلايا المصابة ذات الكلمات الدلالية مع بعض علامات يمكن تصور بواسطة امتصاص أو مضان المقابل لها في قرار الفرعية الخلوية. ومن ثم يمكن تحليلها عينة على شاشة الكمبيوتر.

للأسف، بسبب قيود في مجال الرؤية، يطلب أكثر من مائة الصور بالبلاط لتغطية بئر واحدة. ان تحليل لوحة مع 96 بئرا تتطلب التصوير وتجهيز حوالي عشرة آلاف من الصور. هذه العملية شاقة هي مضيعة للوقت ومكلفة، والقرار المكتسبة في أجناسل لا لزوم له لتوصيف روتينية من العدوى الفيروسية. مختبرات بميزانية محدودة قد تجد أن النهج تتمحور حول الماسحة الضوئية المسطحة يوفر، بديلا فعالا من حيث التكلفة الإنتاجية العالية.

في هذه الورقة، ونحن تصف تحسين الحد من الترسبات MN الفحص التي هي مناسبة لتوصيف الأنتيجين عدد كبير من الفيروسات ولقياس كميا الأنشطة المضادة للفيروسات والأجسام المضادة التعادل. فحص ديها العديد من المزايا: أولا، هو فحص القائم على التصوير التي هي قادرة على قياس العدوى بالفيروس على المستوى الخلوي، بغض النظر عن حجم اللوحة. عد مجموع السكان الخلية المصابة (ICP) داخل بئر يزيد من حساسية الكشف، مما يجعل من الممكن لتوصيف الفيروسات مع العدوى منخفض. ثانيا، يتم إدخال المعايرة الكمية أكثر دقة قبل تحييد لتحديد كمية الفيروس الإدخال. فيروس المدخلات الكمي يقلل بشكل ملحوظ من فاريانشوئها بين مختلف التجارب ويجعل النتائج أكثر قابلية للمقارنة بين المختبرات. ثالثا، التتر تحييد يمكن تحديد بشكل مباشر من خلال تحليل الصور، مما يجعل الكميات سريع وسهل الاستعمال. وأخيرا، يقدم بروتوكول بديلا فعالا من حيث التكلفة والإنتاجية العالية لهذا القرار المطلوبة والدقة. ويستند الكميات على الماسحة الضوئية المسطحة والبرمجيات الحرة معالجة البيانات. الإعداد كله لديه بصمة صغيرة وهو الانتشار في معظم المختبرات.

بروتوكول المعروضة في هذه الورقة يتكون من أربع خطوات رئيسية، بما في ذلك المعايرة فيروس، الكميات المعايرة، تحييد الفيروس، وتحديد الكميات التعادل. فيروس المعايرة هي تجربة إعداد الذي يحدد كمية الفيروسات المدخلات التي ستستخدم في التعادل. خلال المعايرة، يتم تطبيق عدد من تركيزات الفيروسية إلى الطبقات الوحيدة الخلية في لوحة 96-جيدا. ثم يتم quantitated الخلايا المصابة في القسم 2. dilu الفيروسينشوئها التي تنتج 20٪ -85٪ ICP وبدوره تطبق على الفيروسات مساهمة في تحييد المقابلة في القسم 3. كميا والتتر من بروتوكول تحييد باستخدام القسم 4. التجارب التي تلت يتم عرض البروتوكولات المذكورة أعلاه في ممثل النتائج. وقد تم اختبار فحص دقيق خلال العامين الماضيين مع معظم فيروسات الأنفلونزا المنتشرة الحالية، مثل A (H1N1) pdm09، A (H3N2)، والفيروسات B. وقد أدرجت نتائج توصيف فيروس الانفلونزا في التقارير عن الاجتماع التشاوري لمنظمة الصحة العالمية التي أعطت توصيات بشأن لقاحات الأنفلونزا للاستخدام في نصف الكرة الجنوبي في عام 2016 وفي نصف الكرة الشمالي في 2016-2017.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: مستوى السلامة الحيوية (بي إس إل) لبروتوكول التالية BSL 2 لفيروسات الأنفلونزا الموسمية وBSL 3+ لفيروسات الإنفلونزا الجائحة المحتملة. مطلوب المعايرة الفيروسية في وقت مبكر من تجربة تحييد لتحديد تركيز الفيروسي من السيطرة الفيروسية (VC).

1. الفيروسات المعايرة

ملاحظة: اعتمادا على عدد من الفيروسات وعدد من التكرارات، لوحة جيدا يمكن إعدادها مع المرونة التالية: (1) يمكن أن يكون ترتيب التخفيف الفيروسي على طول إما الصفوف أو الأعمدة (الشكل 1). كل فيروس يجب أن تحتل صف / عمود منفصل. (2) وتخفيف الزيادة الفيروسية مرنة، ولكن يجب أن تبدأ مع أعلى تركيز الفيروس في الزاوية العلوية اليسرى. (3) لا توجد قيود على عدد من التكرارات.

ملاحظة: مدين داربي الكلى الكلاب (MDCK) وMDCK-SIAT1 تفضلت (SIAT) الخلايا عن طريق الدكتور محمد Matrosovich، ماربورغ، المانياالكثير 10. خلايا SIAT هي خلايا MDCK ستابلي مع الإنسان CMP-N-acetylneuraminate: الجين بيتا-غالاكتوزيد α-2،6-sialyltransferase لتعزيز التعبير عن الحامض اللعابي (SA) يغوساكاريدس α2-6Gal إنهاء.

  1. قسامة خلايا كافية MDCK أو خلايا MDCK-SIAT 8 في لوحات 96-جيدا (200 ميكرولتر / جيد). احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة 2 أو 3 أيام للوصول إلى نقطة التقاء. نشر الخلايا في DMEM تستكمل مع الحرارة المعطل 10٪ مصل الجنين العجل (FCS) والمضادات الحيوية (100 U / البنسلين مل و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين). احتضان الخلايا SIAT عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 و 1 ملغ / مل كبريتات G418.
    ملاحظة: إن عامل التخفيف يعتمد على الخبرة وخط الخلية المستخدمة. يجب أن تكون متكدسة أحادي الطبقة الخلية (أي، لا جدار الخلية أو مخطط واضح للخلايا MDCK وتخطيط معبأة بإحكام للخلايا MDCK-SIAT1) في وقت التلقيح الفيروس. أمثلة من التخفيفات على أساسونظرا للثقافة فرعية قوارير متكدسة من خلايا MDCK أو MDCK-SIAT1 في الجدول 1.
  2. غسل الخلايا 3 مرات مع 200 ميكرولتر من متوسط ​​النمو فيروس (VGM) لكل بئر. تعقيم غسالة لوحة متعدد الطبقات مع 70٪ ETOH لمدة 30 دقيقة، ثم شطفه في العقيمة مخزنة المالحة الفوسفات (PBS) أو VGM قبل الغسيل.
  3. نضح VGM وعلى الفور إضافة 50 ميكرولتر من VGM إلى كل بئر.
  4. إضافة 900 ميكرولتر من VGM لكل من 6 أنابيب معقمة (أو أقل، تبعا لعدد من الفيروسات الاختبار ومكررة). ماصة 100 ميكرولتر من الفيروس في الأنبوب الأول، وتخلط جيدا، ومتسلسل تمييع، وتغيير نصائح بين كل تخفيف. كرر لكل فيروس أن معاير.
    ملاحظة: هذا سيعطي التخفيفات فيروس من 10 -1 إلى 10 -6.
  5. إضافة 50 ميكرولتر من كل تخفيف الفيروس، بدءا من أعلى تخفيف (1 × 10 -5 في الشكل 1)، إلى الآبار المكررة (الأعمدة 9 و 10 في الشكل رقم 1) من 9لوحة 6 جيدا.
  6. وضع لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 2-3 ساعة ليسمح للفيروس يصيب الخلايا.
    ملاحظة: حضانة 2-3 ساعة ضرورية لضمان أن الفيروسات في اللقاح لديها ما يكفي من الوقت للوصول إلى أحادي الطبقة.
  7. إعداد تراكب (10 مل / لوحة)
    ملاحظة: يتكون غطاء من 5 مل من 2X DMEM، التربسين (2 ميكروغرام / مل تركيز النهائي)، و 20 ميكرولتر من 1 ملغ / مل الأسهم، و 5 مل من نسالة القطن السليلوز (انظر قائمة المواد).
  8. إزالة اللقاح.
  9. إضافة تراكب (200 ميكرولتر من كل جانب). احتضان ليلا 37 درجة مئوية، ودون عائق.
    ملاحظة: مهدها فيروس يحدث بعد حوالي 4 ساعات، ولذلك فمن المهم أن لوحة غير منزعجة بعد هذا الوقت.
  10. نضح التراكب من الآبار.
  11. إضافة الثلج الباردة بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني ألف (200 ميكرولتر / جيد). وضعها في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أو في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
    ملاحظة: برنامج تلفزيوني (أ) هو الطبيعية الرقم الهيدروجيني الفوسفات مخزنة المالحة مع 10 الذهابو كلوريد الصوديوم، 0.25 غرام من بوكل، 1.437 غرام من نا 2 هبو 4، 0،25 غرام من KH 2 PO 4، و 1 لتر من الماء المقطر (انظر قائمة المواد).
    ملاحظة: لامتصاص العرق هو ضار عند استنشاقه ويمكن أن يسبب حروقا إذا ابتلع. وهناك أيضا أدلة محدودة من تأثير مسرطن، وأنها قد تسبب حساسية بعد ملامسة الجلد.
  12. نضح لامتصاص العرق وتغسل الصحون مرتين مع برنامج تلفزيوني ألف (200 ميكرولتر / جيد).
  13. تخزين لوحات في برنامج تلفزيوني وفي 4 درجات مئوية لاستخدامها في المستقبل، أو الاستمرار في الخطوات التالية.
  14. إضافة العازلة permeabilization (100 ميكرولتر / جيد). ترك في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  15. غسل لوحة مرتين مع برنامج تلفزيوني ألف (200 ميكرولتر / جيد).
  16. إضافة 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأول، ماب الماوس ضد نوع الأنفلونزا A (1: 1000 في ELISA العازلة)، لكل بئر. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة (أو 4 درجات مئوية خلال الليل)، مع اهتزاز.
  17. يغسل 3 مرات في 100 ميكرولتر من غسل العازلة (0.05٪ توين 80 في برنامج تلفزيوني A، / ت ت) صإيه جيدا. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق بين يغسل. بالتناوب، ويغسل 3 مرات دون حضانة باستخدام 300 ميكرولتر لكل بئر.
  18. إضافة 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثاني، الماعز المضادة للماوس مفتش (H + L) HRP المترافقة (1: 1000 في ELISA العازلة)، لكل بئر. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة، مع اهتزاز.
  19. يغسل 3 مرات كما هو موضح في الخطوة 1.17.
  20. إضافة الركيزة (50 ميكرولتر / جيد). احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة أو حتى وضع اللون الأزرق واضحة للعيان.
  21. لوقف رد الفعل، وغسل لوحة مرتين مع 200 ميكرولتر من الماء المقطر لكل بئر، تفرخ في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 -3 دقائق بين يغسل.
  22. الهواء الجاف لوحة وتخزينه في مكان مظلم (على سبيل المثال، ألفه في رقائق الألومنيوم).

2. المعايرة الكميات

  1. وضع لوحة جيدا في مجال مسح والماسحة الضوئية المسطحة، كما هو مبين في الشكل 2A. استخدام الحد موقف L-شكل لضمان مكان التصوير الأمثل وتكرار.
    ملاحظة: من الممكن صورة اثنين من لوحات جيدة في مسح واحد.
  2. مسح صورة.
    ملاحظة: يتم عرض الإعدادات في الجدول 2.
  3. تشغيل "Wellplate قارئ" برنامج لحساب تركيز الفيروس المطلوبة (الشكل 3).
    1. انقر على زر "تحميل الصورة" لتحميل صورة. حرك شريط أحمر في الرسم البياني لل"عتبة العالمية" علامة التبويب لضبط عتبة أخذ العينات. انقر على زر "تحديث" لفحص تأثير على الصورة.
    2. وضع علامة في مربع "حساب تحييد / المعايرة". انقر على زر "أخذ العينات" لتحديد برنامج المقارنات الدولية. انقر على زر "حفظ" لحفظ نتائج العينات عند المطالبة.
      ملاحظة: بعد عملية أخذ العينات، نافذة جديدة تسمى "تحييد والمعايرة حساب" يبدو تلقائيا إذا تم تكتك مربع "حساب تحييد / المعايرة".
    3. تحميل أو إدخال خريطة تعريف جيدا لوحة. تشير إلى عتبة (على سبيل المثال، 30٪) في "المعايرة: السكان الفيروسات الأمثل (٪)". حدد "المعايرة عملية" علامة التبويب لحساب نتائج المعايرة. تحقق نتائج المعايرة. انقر على زر "حفظ وإغلاق" لحفظ نتائج المعايرة.
      ملاحظة: يرجى الرجوع إلى التكميلية S1 لتعليمات أكثر تفصيلا على البرنامج. نسخة من برنامج مفصل متاحة عند الطلب.
      ملاحظة: عادة ما يكون أفضل التخفيف الفيروس لعائدات فحص الحد من الترسبات حوالي 50٪ (20-85٪) من إجمالي ICP الخلايا داخل كل بئر 11.

3. الفيروسات تحييد

ملاحظة: احسب عدد من لوحات اللازمة لفحص التعادل. كل لوحة يمكن أن تستوعب فيروس واحد وعدد من أمصال مضادة.

ملاحظة: اعتمادا على عدد من أمصال مضادة وعدد من التكرارات، لوحة جيدا يمكن إعدادها مع الالبريد التالية المرونة: (1) وتخفيف المصل يمكن ترتيب على طول إما صف أو عمود (الشكل 4). كل مصل أن تحتل صف منفصل أو عمود. (2) زيادة من تخفيف المصل مرنة، ولكن يجب أن تبدأ مع أعلى تركيز مصل في الزاوية العلوية اليسرى من لوحة. (3) عدد التكرارات أرصدة عدد من أمصال مضادة. يمكن للمزيد من التكرارات تساعد على تذليل الاختلافات التجريبية. (4) عدد الرأسمالي وعدد من سيطرة خلية (CC) مكررة مرنة، ولكن ينبغي أيضا أن تكون في صفوف منفصلة أو الأعمدة. ومن المتوقع أن عدد التكرارات VC هو أكبر بكثير من أن من أمصال مضادة.

  1. إعداد أحادي الطبقة الخلية، كما هو الحال في الخطوات 1،1-1،3، 2 أو 3 أيام مقدما.
  2. إضافة 50 ميكرولتر من VGM إلى كل بئر من لوحة.
  3. استخدام الأعمدة 11 و 12 للVC وCC، على التوالي. إضافة 50 ميكرولتر aliquots من 1:20 انزيم تدمير مستقبلات (RDE) مصل المعالجة بالإثير إلى الصف الأول (أ) من كولومNS 1-10.
    ملاحظة: للحصول على كل تركيبة الفيروس والمصل، يتم إجراء الفحص في نسختين، لذلك قد لوحة واحدة، على سبيل المثال، تحتوي على فيروس واحد اختبار ضد خمسة أمصال مضادة.
  4. أداء 2 أضعاف التخفيفات المسلسل من خلال نقل 50 ميكرولتر من صف أ إلى صف H (أعمدة 1-10 في الشكل 4) ورميه 50 ميكرولتر من الصف H.
  5. إضافة 50 ميكرولتر من مخفف على كل جانب من العمود CC (العمود 12 في الشكل 4).
  6. إضافة 50 ميكرولتر من الفيروس في كل بئر من لوحة، عدا العمود CC (أعمدة 11/01، الصفوف ه في الشكل 4).
  7. احتضان ذلك عند 37 درجة مئوية لمدة 2-3 ساعة. إزالة اللقاح. إضافة تراكب (200 ميكرولتر) إلى كل بئر. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، ودون عائق. إصلاح وصمة عار لوحات أما المعايرة فيروس (الخطوات 1،11-1،22).

4. تحييد الكمي

  1. وضع لوحة جيدا في مجال مسح والماسحة الضوئية المسطحة، كما هو مبين في فيقوإعادة 2A. استخدام الحد موقف L-شكل لضمان مكان التصوير الأمثل وتكرار.
    ملاحظة: من الممكن صورة اثنين من لوحات جيدة في مسح واحد.
  2. مسح لوحة، كما هو موضح في الخطوة 2.2.
  3. تشغيل "Wellplate قارئ" برنامج لحساب التتر الفيروسية المطلوبة (الشكل 3، الخطوة 2.3).
    1. انقر على زر "تحميل الصورة" لتحميل صورة. حرك شريط أحمر في "عتبة العالمية" لضبط عتبة أخذ العينات. انقر على زر "تحديث" لدراسة تأثير.
    2. وضع علامة في مربع "حساب تحييد / المعايرة". انقر على زر "أخذ العينات" لتحديد برنامج المقارنات الدولية. انقر على زر "حفظ" لحفظ نتائج العينات عند المطالبة.
      ملاحظة: بعد عملية أخذ العينات، نافذة جديدة تسمى "تحييد والمعايرة حساب" يبدو تلقائيا إذا تم تكتك مربع "حساب تحييد / المعايرة".
    3. تحميل أو إدخال ف جيداأواخر خريطة. تشير إلى عتبة (على سبيل المثال، 50٪) في "تحييد: خصم العدوى (٪)."
    4. حدد "عملية تحييد" لحساب التتر. تحقق التتر وانقر على زر "حفظ وإغلاق" لحفظ النتائج التعادل.
      وتفيد التقارير تحييد كما مقلوب أعلى التخفيف من المصل مع تخفيض محدد مسبقا برنامج المقارنات الدولية (مثل 50٪ أو 80٪) مقابل VC (الوسط من العمود 11 في الشكل 4): ملاحظة. تم استخدام الحد ICP 50٪ في نتائج التمثيلية.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وفقا للإجراءات المذكورة أعلاه، فإننا نقدم بعض النتائج من التجارب توصيف مولدة الأخيرة. وقد تم تصميم الإعداد المعايرة لدراسة ثمانية الفيروسات المدخلات، مع مكررة مزدوجة لكل التخفيف. تم اختبار التخفيفات الفيروسية بين 1.0 × 10 -1 و 1.0 X 1.0 -6 لتغطية الاختلافات بين الفيروسات. وقد تبين أن فيروسات اختبار من النوع الفرعي H3N2، بما في ذلك A / الكاميرون / 15V-3538/2015، A / فلاديفوستوك / 36/2015 A / موسكو / 103 / عام 2015، A / تومسك / 5/2015 /، A / موسكو / 101 / 2015، A / موسكو / 100/2015، A / موسكو / 133/2015، و A / براتيسلافا / 437/2015. وتعرض نتائج المعايرة في الشكل (5). يوضح الشكل 5D انخفاض مركزا آخر مع زيادة تخفيف الفيروس. وتم تطبيع منحنيات ضد مركزا آخر من نفس الفيروسات التي أسفرت عن إصابات في جميع الخلايا داخل بئر 12 (كما هو موضح ICP التشبع). إذا لم ICP تصل التشبع مع مرحباghest تركيز الفيروس، تم استخدام المتوسط برنامج المقارنات الدولية من التكرارات المقابلة بدلا من ذلك (A / موسكو / 103/2015 في الشكل 5D). وقد تم اختيار التخفيفات الفيروس الذي ينتج 30٪ من برنامج المقارنات الدولية التشبع مثل تخفيف فيروس مدخلات لتحييد (الجدول 3).

تحييد تهدف لفيروس مدخل واحد ضد خمسة أمصال مضادة، مع مكررة مزدوجة على كل لوحة. فيروس إشارة المعروض H3N2 A / ستوكهولم / 63/2015. وأمصال مضادة الخمسة هي A / هونج كونج 4801/14 البيض F12 / 15، A / هونج كونج 7295/14 MDCK F02 / 15، A / جنوب أفريقيا R2665 / 15 SIAT F50 / 15، A / السويسري 9715923/13 SIAT NIBF F18 / 15، و A / الهولندية 525/14 SIAT F23 / 15. وتعرض نتائج هذا التحييد في الشكل (6). ويبين الشكل 6D التقدم الإصابة مع زيادة تخفيف المصل. السكان إيجابي تطبيع على المحور الرأسي يمثل نسبة مركزا آخر من الاستجابة أمصال مضادة المقابلة ضد متوسط ​​ICP الفيروس إشارة 12. تم طرح برنامج المقارنات الدولية خلفية من الضوابط الخلايا غير المصابة خلال التطبيع. تم تحديد التتر تحييد باسم مقلوب من التخفيفات مصل الموافق 50٪ تخفيض برنامج المقارنات الدولية (الجدول 4). وقد استخدم خطي الاستيفاء لتقدير التتر الوقوع بين اثنين من التخفيفات المصل المجاورة.

figure-results-1
الشكل 1: مثال على الإعداد بشكل جيد لوحة في تجربة المعايرة الفيروس. يتم تعيين الفيروسات اختبار لصفوف منفصلة (A إلى H). تم تصميم الأعمدة لمختلف التخفيفات الفيروسية (1-12). واستخدمت عمودين كما التكرارات لكل التخفيف الفيروسي. شريط النطاق = 10 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ف together.within الصفحات = "1"> figure-results-2
الشكل 2: الخطط نظام عينة المسح. (أ) لوحة 96 جيدا على الموقف التصوير من الماسحة الضوئية المسطحة (نشرها من مرجع 11 بإذن من السيفير BV)، و (ب) أبعاد الحد موقف L-الشكل المبين في الفقرة (أ). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل (3): مخطط سطح المكتب من "Wellplate قارئ" البرمجيات الكميات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: مثال على الإعداد جيدا وحة في التجربة التعادل. يتم تعيين كل مصل مضاد لعمودين مع التكرارات (1-10). تم تصميم صفوف لمختلف التخفيفات المصل (A إلى H). يأخذ السيطرة فيروس العمود 11، وثمانية تكرارات (A11 إلى H11). سيطرة الخلية في العمود 12، مع ثمانية تكرارات (A12 إلى H12). شريط النطاق = 10 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الرقم 5: نتائج تجربة المعايرة. (أ) الإعداد جيدا لوحة، (ب) تفحص جيدا لوحة صورة، (ج) التوضيحمن ترميز اللون، quantitated، السكان الخلية المصابة بالفيروسات، و (د) تطبيع السكان الخلية المصابة بالفيروسات ضد التخفيفات الفيروس. تم استخدام 30٪ ICP كما العتبة. أشرطة الخطأ في الفقرة (د) هي الانحرافات المعيارية (SD) من الازدواجية العينة (± 1 SD). الحانات النطاق في (ب) و (ج) = 10 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6
الشكل 6: نتائج تجربة التعادل. (أ) الإعداد جيدا لوحة، (ب) الصورة الممسوحة ضوئيا بشكل جيد لوحة، (ج) توضيح ل، السكان الخلية المصابة بالفيروس quantitated، و(د) تطبيع السكان الخلية المصابة بالفيروسات ضد تمييع الدم. في السادس المدخلاتروس (VC) هو A / ستوكهولم / 63/2015. تم استخدام 50٪ ICP لحساب التتر. أشرطة الخطأ في الفقرة (د) هي الانحرافات المعيارية (SD) من الازدواجية العينة (± 1 SD). الحانات النطاق في (ب) و (ج) = 10 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

S1 التكميلية: يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

تخفيف نموذجي
خلايا MDCK خلايا MDCK-SIAT1
2 أيام 1: 5 (1 + 4) 01:10 (1 + 9)
3 أيام 01:20 (1 + 19)
عدد نموذجي من الخلايا لكل مل
خلايا MDCK خلايا MDCK-SIAT1
2 أيام 2 × 10 5 1 × 10 5
3 أيام 1 × 10 5 5 × 10 4
01:10 (1 + 9)

الجدول 1: التخفيفات النموذجية على ثقافة فرعية قوارير متكدسة من خلايا MDCK أو MDCK-SIAT1.

طريقة الوضع المهني
نوع الوثيقة فيلم (مع دليل مساحة فيلم)
نوع التعرض للسيارات صورة فوتوغرافية
ايمنوع السن 24 بت لون
قرار 1200 نقطة في البوصة
تنسيق الصورة المحفوظة شجار

الجدول 2: إعداد نموذجي من الماسحة الضوئية المسطحة.

صف فيروس التخفيف الموصى بها
ا A / كاميرون / 15V-3538/2016 1.0 × 10 -2
ب A / فلاديفوستوك / 36/2015 1.0 × 10 -3
C A / موسكو / 103/2015 1.1 × 10 -1
د A / تومسك / 5/2015 5.9 × 10 -1
ه A / موسكو / 101/2015 8.3 × 10 -1
F A / موسكو / 100/2015 1.4 × 10 -2
G A / موسكو / 133/2015 1.3 × 10 -2
H A / براتيسلافا / 437/2015 1.3 X 10 -4

الجدول 3: التخفيفات الفيروسية تحسب من عدد سكانها 30٪ لبرنامج المقارنات الدولية.

عمود أمصال مضادة عيار الموصى بها
1-2 A / HK4801 / 2014 110
3-4 A / HK7295 / 2014 213.3
A / جنوب افريقيا / R2665 / 2015 2155.8
7-8 A / سويسرا / 9715293/2013 89.4
9-10 A / هولندا / 525/2014 78.6

الجدول 4: التتر بنسبة 50٪ لبرنامج المقارنات الدولية من A / ستوكهولم / 63/2015 ضد أمصال مضادة.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الدراسة، وصفنا لMN فحص القائم على التصوير لتحديد العلاقات مولدة الحقيقية بين الفيروسات. مقارنة مع فحوصات أخرى للحد من اللوحة، وطريقة تؤكد قياس برنامج المقارنات الدولية من بئر بأكمله، وضمان تغطية كاملة من السكان عدوى. استقلالها من تشكيل الترسبات أيضا يوسع تطبيق الفحص للفيروسات التي يمكن أن تشكل ويحات صغيرة أساسا غير مرئية أو التي يمكن أن تدير فقط إصابة وحيدة الخلية. ولذلك، فإن الاختبار هو قادرة على فحص المزيد من الفيروسات وآثار مجموعة واسعة من الأجسام المضادة من مرحبا، وأنه يساعد على التفكير بشكل أكثر شمولية أوجه التشابه المستضدات أو الاختلافات بين الفيروسات 12. على سبيل المثال، عندما يتم تضمين الكربوكسيل الدواء، وفحص MN هو أقل تأثرا NA-تعتمد ملزمة، مما يعكس الاختلافات مولدة بشكل أكثر دقة. خلال تطوير الفحص، وقد بذلت جهود كبيرة لتعزيز تجربة الاتساق، والسرعة، وكشفحساسية، بما في ذلك عن طريق التحكم في مدخلات الفيروسات من خلال المعايرة quantitated، والتصوير في إنتاجية عالية والماسحة الضوئية المسطحة، وتنفيذ تجهيز منصة البيانات سهل الاستعمال. وكانت النتائج دائما ما تتفق مع وأكدت تلك مرحبا. والجدير بالذكر، كما كشفت نتائج الخلافات المستضدات بين المتغيرات الانجراف مولدة من نوع A و قاح B الفيروسات الأخيرة، فضلا عن التغيرات المستضدات التي تسببها التغيرات مختارة ثقافة أو متفرقة، مثل استبدال G155E في HA1 بعض A (H1N1) فيروسات pdm09 12.

بروتوكول مطابقة لنوع الفيروس أو سلالة مع اختيار خطوط الخلايا التي أعطت أقوى عدوى، مما ساهم كثيرا في إشارة التصوير. وقد مهد الاختلاف تجريبية مع تصميم التكرارات التي متوازنة مع عدد من أمصال مضادة اختبارها. يمكن الشكوك تأتي أيضا من جودة الصورة، والتي أثرت بشكل رئيسي من قبل جهاز التصوير. ولائق اللون مسطحة الماسح الضوئي يمكن جوهريficantly تحسين تباين الصورة والحد من الضوضاء. كمية الفيروس مساهمة في تحييد يجب أن يتم تحديدها كميا مقدما من المعايرة المقابلة في حين أن الفيروسات لا تزال تحافظ على حكمهم. خلال تحييد، واستجابة مصل مضاد للعدوى هي تطبيع ضد الفرق بين الفيروس المرجعية (VC) ومستوى الخلفية (CC). قياسات دقيقة من VC وCC ضرورية لتجربة التعادل. ينصح المزيد من التكرارات (استخدمت ثمانية تكرارات في ممثل النتائج). وأخيرا، فهم البرنامج هو أمر حيوي لنجاح التجربة. وقد تم اختبار البرنامج لتوصيف فيروس روتيني في مركز الإنفلونزا منظمة الصحة العالمية، المملكة المتحدة لأكثر من عامين. وتقدم الإرشادات التفصيلية للتعامل مع مختلف الحالات في S1 التكميلية.

هذا الاختبار MN غير مناسبة للتطبيقات حيث تغطي عينات من تحويلةحقل كبير remely نظر ولكن فقط يتطلب القرار التصوير المعتدل. تكلفة منخفضة والإعداد بسيطة تجعل من نظام متاحة بسهولة في معظم المختبرات وعلم الفيروسات. وكان الاختلاف في القياسات لنفس العينة أقل من 3٪، والذي يحدد ما يقرب من حالة عدم اليقين التي قدمت خلال المسح 11. هذا التكاثر غير كافية في العديد من الدراسات الفيروسية ويمكن لمزيد من التقليص عن طريق حساب متوسط ​​الصور من مسح متعددة.

في الختام، توضح هذه الدراسة فحص MN القوي التي يمكن استخدامها بشكل روتيني في دراسة مستضدية ودعم البيانات مرحبا في تحليلات مفصلة لعرضه-فيروسات الإنفلونزا، لا سيما لاختيار نصف سنوية من الفيروسات لإدراجها في لقاحات الأنفلونزا البشرية.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون الدكتور M. Matrosovich على توفير خطوط الخلايا MDCK و MDCK-SIAT1 الأصلية و Roche Pharmaceuticals لتزويد كربوكسيل أوسيلتاميفير. كما نقدر الدكتورة آن ويستون لاقتراحاتها القيمة حول المخطوطة. واعتمدت هذه الدراسة على التعاون القيم بين مراكز الأنفلونزا الوطنية التابعة لمنظمة الصحة العالمية ومراكز النزلة الوافدة التابعة لمنظمة الصحة العالمية داخل نظام المعلومات الجغرافية العالمي لمنظمة الصحة العالمية، التي قدمت فيروسات الأنفلونزا المستخدمة. تم تمويل هذا العمل من قبل مجلس البحوث الطبية من خلال البرنامج U117512723.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
VGMSigmaD6429 ، P0781500 مل DMEM + 5 مل قلم / Strep < sup > b < / sup>
PBS Aطبيعة درجة الحموضة محلول ملحي مخزن بالفوسفات: كلوريد الصوديوم 10 & nbsp ؛ ز ، KCl 0.25   ؛ (ز)، Na2HPO4 1,437 g, KH2PO4 0,25 g, وDist. Water 1 L.
أفيسيلFMCRC-581F2.4 جم في 100 مل من الماء المقطر المذاب عن طريق التقليب على محرك مغناطيسي لمدة 1 ساعة.
2x DMEMGibco 21935-028
تراكب التربسينسيجماT1426
(10 مل / لوحة):5 مل 2x DMEM ، التربسين 2   ؛ مو جم / مل التركيز النهائي ، Avicell 5 & nbsp ؛ مل
Triton X- 100eSigma المخزن المؤقت للنفاذية T8787: 0.2٪ في PBS A (v / v)
Tween 80SigmaP5188Wash Buffer: 0.05٪ Tween 80 in PBS A (v / v)
مصل الحصانPAA Labs LtdB15-021ELISA Buffer: 10٪ في PBS A (v / v) + 0.1٪ Tween 80
Mouse MAb ضد الأنفلونزا من النوع ABioradMCA 4001st< / sup> الأجسام المضادة: 1: 1,000 في ELISA Buffer
Goat المضاد للفأر IgG (H + L) HRP المترافقBiorad172-10112nd< / sup> الجسم المضاد: 1: 1,000 في ELISA Buffer
True Blu peroxidase الركيزةKPL & nbsp ؛50-78-02الركيزة: أزرق حقيقي + 0.03٪ H2< / sub>O2< / sub>g< / sup> (1: 1،000 من محلول 30٪) 96
جيدا ألواح ميكروتيتر مسطحةالقاع Costar & nbsp ؛3596
قنوات غسالة متعددة الجدران ومشعبSigmaM2656
Perfection Plate ScannerEpsonV750 Proيمكن تنزيل برنامج التصوير بحرية من http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134& infoType=التنزيلات.
بيئة تشغيل البرمجيات: نافذة LabVIEWNational Instruments Corporationالمستندة إلى NIVision builder الإصدار: LabVIEW2012 أو أعلى
8

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Walker, D. L., Horsfall, F. L. Lack of identity in neutralizing and hemagglutination-inhibiting antibodies against influenza viruses. J Exp Med. 91, 65-86 (1950).
  2. Medeiros, R., Escriou, N., Naffakh, N., Manuguerra, J. C., van der Werf, S. Hemagglutinin residues of recent human A(H3N2) influenza viruses that contribute to the inability to agglutinate chicken erythrocytes. Virology. 289, 74-85 (2001).
  3. Lin, Y. P., et al. Neuraminidase receptor binding variants of human influenza A(H3N2) viruses resulting from substitution of aspartic acid 151 in the catalytic site: a role in virus attachment. J Virol. 84, 6769-6781 (2010).
  4. Harmon, M. W., Rota, P. A., Walls, H. H., Kendal, A. P. Antibody response in humans to influenza virus type B host-cell-derived variants after vaccination with standard (egg-derived) vaccine or natural infection. J Clin Microbiol. 26, 333-337 (1988).
  5. Rowe, T., Abernathy, R. A., Hu-Primmer, J., Thompson, W. W., Lu, X., Lim, W., et al. Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays. J Clin Microbiol.37. 37, 937-943 (1999).
  6. Okuno, Y., Tanaka, K., Baba, K., Maeda, A., Kunita, N., Ueda, S. Rapid focus reduction neutralization test of influenza A and B viruses in microtiter system. J Clin Microbiol. 28, 1308-1313 (1990).
  7. Bachmann, M. F., Ecabert, B., Kopf, M. Influenza virus: a novel method to assess viral and neutralizing antibody titers in vitro. J Immunol Methods. 225, 105-111 (1999).
  8. Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virol J. 3, 63-70 (2006).
  9. Comley, J. High content screening - Emerging importance of novel reagents/probes and pathway analysis. Drug Discovery World Summer 2005. , 31-53 (2005).
  10. Matrosovich, M., Matrosovich, T., Carr, J., Roberts, N. A., Klenk, H. D. Overexpression of the alpha-2, 6-sialyltransferase in MDCK cells increases influenza virus sensitivity to neuraminidase inhibitors. J. Virol. 77, 8418-8425 (2003).
  11. Sullivan, K., et al. High throughput virus plaque quantitation using a flatbed scanner. J Virol Methods. 179, 81-89 (2012).
  12. Lin, Y. P., et al. Optimization of a micro-neutralization assay and its application in antigenic characterization of influenza viruses. Influenza Other Respir Viruses. 9, 331-340 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Micro neutralization AssayInfluenza VirusVirus TitrationAntibody NeutralizationAntiviral ActivityFlatbed Scanner ImagingHigh throughput ImagingViral Antigenic StudiesVirus DilutionInfected Cell Population

Related Articles