هنا ، نقدم بروتوكولا لإدخال مجسات كيميائية على وجه التحديد في موقع في جزء من الجسم المضاد عن طريق دمج حمض أميني يحتوي على أزيد وراثيا ، وبالتالي اقتران الأزيد بمسبار كيميائي عن طريق إضافة أزيد الألكين الحلقية المعززة بالسلالة (SPAAC).
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
كفاءة والخاصة بالموقع الأجسام المضادة وصفها من قبل Cycloaddition-أزيد آلكاين-روجت سلالة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
هناك حاليا الكثير من الأدوات الكيميائية المتاحة لتقديم تحقيقات الكيميائية إلى بروتينات لدراسة بنيتها ووظيفتها. وهناك طريقة مفيدة هو بروتين الاقتران عن طريق إدخال وراثيا من الأحماض الأمينية غير طبيعي يحتوي على مجموعة وظيفية bioorthogonal. ويصف هذا التقرير بروتوكول مفصلة لجسم تصريف للموقع المحدد. ويتضمن البروتوكول تفاصيل التجريبية لدمج الجيني للحمض الأميني التي تحتوي على أزيد، ورد فعل الاقتران قبل cycloaddition-أزيد آلكاين-روجت سلالة (SPAAC). هذا رد فعل روجت سلالة العائدات عن طريق خلط بسيط من جزيئات التفاعل في درجة الحموضة الفسيولوجية ودرجة الحرارة، و لا يتطلب الكواشف إضافية مثل النحاس (I) أيونات وبروابط-مخلبية النحاس. ولذلك، فإن هذا الأسلوب سيكون مفيدا للاقتران البروتين العام وتطوير تقارن المخدرات الأجسام المضادة (ADCS).
المقدمة
منذ الابلاغ عن التأسيس الجيني لل-methoxyphenylalanine ص في القولونية، وأدرجت 1 أكثر من 100 الأحماض الأمينية غير طبيعية (UAAs) بنجاح في البروتينات المختلفة. 1-3 ومن بين هذه UAAs، والأحماض الأمينية التي تحتوي على المجموعات الوظيفية bioorthogonal وقد درس على نطاق واسع وتمثل النسبة الأكبر. وتشمل المجموعات الوظيفية bioorthogonal المستخدمة في UAAs كيتون، 4 أزيد، 5 آلكاين، 6 cyclooctyne، 7 tetrazine، 8 α، β-أميد غير المشبعة، 9 norbonene، 10 transcyclooctene و 11 و bicyclo [6.1.0] -nonyne. 11 على ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. البلازميد البناء
- بناء على التعبير البلازميد (pBAD-HerFab-L177TAG) التي من شأنها التعبير عن الجين الضد المستهدف (pBAD-HerFab-WT) مع صاحب 6 -tag، واستبدال رامزة لوسين-177 مع كودون العنبر (TAG) 27، وذلك باستخدام التقليدية تقنية الطفرات موقع الموجه.
انظر الجدول المواد. - بناء التعبير البلازميد آخر (pEVOL-AFRS) التي تحتوي على جينات الحمض الريبي النووي النقال صور تطورت وأمينوأسيل-الحمض الريبي النووي النقال مخلقة (AARS) زوج. استخدام ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في هذه الدراسة، كان جزء الأجسام المضادة مترافق مع fluorophore من خلال دمج الأحماض الأمينية التي تحتوي على أزيد في جزء والرد جزء الأجسام المضادة متحولة مع cyclooctyne متوترة على وجه التحديد الموقع (الشكل 1). وقد تم اختيار HerFab باعتبارها جزء الضد المستهدف إلى التي تأسست AF كما من الأحماض الأمينية التي تحتوي على أزيد. لاختيار بقايا في HerFab لاستبدال مع AF، تم تحليل التركيب البلوري للأشعة السينية من HerFab. وتشمل 30 المتط.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
إدراج الجيني للالأحماض الأمينية غير طبيعية في البروتينات ديها العديد من المزايا مقارنة مع الطرق الأخرى المستخدمة لتعديل البروتين. 1-3 احدة من المزايا الهامة هو تطبيق العام لأي نوع من البروتين. من حيث المبدأ، لا يوجد أي قيود في اختيار البروتين المستهدف والموقع المستهدف من البروتين. ومع ذلك، واستبدال بقايا أهمية هيكليا أو وظيفيا مع UAA قد يؤدي إلى تغيير بنية ووظيفة البروتين المستهدف. عموما، يتم اختيار المخلفات التي تتعرض لالمذيبات ولا تتفاعل مع المخلفات الأخرى لإدماج UAAs.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي>1. بناء البلازميد < / قوي | |||
| > البلازميد pBAD_HerFab_L177TAG | اختياريا يحتوي على كودون الإيقاف الكهرماني (TAG) في الموضع المطلوب. Ko، W. et al.< / em> وضع العلامات على الأجسام المضادة الفعالة والخاصة بالموقع عن طريق إضافة Azide-Alkyne Cycloaddition التي يتم الترويج لها بالسلالة. BKCS.< / em> 36 (9) < / strong> ، 2352-2354 ، doi: 10.1002 / bkcs.10423 ، (2015) | ||
| البلازميد pEvol-AFRS | Young ، T. S. ، أحمد ، I. ، Yin ، JA ، و Schultz ، P. G. نظام محسن للطفرات غير الطبيعية في الأحماض الأمينية في E. coli.< / em> J. Mol. Biol.< / em> 395 (2) < / strong> ، 361-374 ، doi: 10.1016 / j.jmb.2009.10.030 ، (2010) | ||
| DH10B | Invitrogen | C6400-03 | Expression Host |
| Plasmid Mini-prep kit | Nucleogen | 5112 | 200 / pack |
| Agarose | Intron biotechnology | 32034 | 500 ز |
| بروميد الإيثيديوم | Alfa Aesar | L07482 | 1 جم |
| مرق LB | BD Difco | 244620 | 500 ؛ g |
| <قوي>2. إعداد الثقافة< / strong> | |||
| 2.1 التثقيب الكهربائي < / قوي > | |||
| نابض مايكرو | BIO-RAD | 165-2100 | |
| كوفيت نابض صغير | BIO-RAD | 165-2089 | 0.1 & nbsp ؛ فجوة القطب الكهربائي سم ، pkg. من 50 |
| أمبيسلين الصوديوم | واكو | 018-10372 | 25 جم |
| كلورامفينيكول | ألفا إيسار | B20841 | 25 جم |
| أجار | سامتشون | 214230 | 500 جم |
| SOC متوسط | سيجما | S1797 | 100 مل |
| 3.1 التعبير عن Herfab-L177AF< / strong> | |||
| p< / em>-azido-L-phenylalanine (AF) Bachem | F-3075.0001 | 1 g | |
| L (+) -أرابينوز ، 99٪ | أكروس | 104981000 | 100 جم |
| حمض الهيدروكلوريك ، 35 ~ 37٪ | SAMCHUN | H0256 | 500 مل |
| تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان ، 99٪ | SAMCHUN | T1351 | 500 جم |
| EDTA ثنائي هيدرات ملح ثنائي الصوديوم ، 99.5٪ | SAMCHUN | E0064 | 1 كجم |
| سكروز | سيجما | S9378 | 500 جم |
| ليزوزيم | سياكو | 126-0671 | 1 جم |
| راتنج Ni-NTA | QIAGEN | 30210 | 25 مل |
| عمود بولي بروبلين | QIAGEN | 34924 | 50 / حزمة ، سعة 1 مل |
| إيميدازول ، 99٪ | SAMCHUN | I0578 | 1 كجم |
| فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة ، 98٪ | SAMCHUN | S0919 | 1 كجم |
| كلوريد الصوديوم ، 99٪ | SAMCHUN | S2907 | 1 كجم |
| Cy5.5-ADIBO | FutureChem | FC-6119 | 1 ملغ |
| Amicon Ultra 0.5 مل | MILLIPORE | UFC500396 | 96 / حزمة ، 500 &# 956 ؛ L سعة |
| 1،4-Dithio-DL-threitol ، DTT ، 99.5٪ | Sigma | 10708984001 | 10 جم |
| NuPAGE LDS عينة عازلة ، 4x | Thermofisher | NP0007 | 10 مل |
| MES تشغيل عازلة | Thermofisher | NP0002 | 500 مل |
| Nupage Novex 4-12٪ SDS PAGE المواد الهلامية | Thermofisher | NO0321 | 12 بئر |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Wako | 031-17922 | 25 جم |
| Typhoon 9210 متغير الوضع التصوير | Amersham Biosciences |
المراجع
- Wang, L., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Angew. Chem. Int. Ed. 44 (1), 34-66 (2004).
- Wu, X., Schultz, P. G. Synthesis at the interface of chemistry and biology. J. Am. Chem. Soc. 131 (35), 12497-12515 (2009).
- Liu, C. C., Schultz, P. G.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
