يسمح إنشاء أنظمة ثقافة لتوسيع الخلايا الجذعية العصبية البالغة (aNSCs) بفحص وتطبيق الخلايا الجذعية العصبية البالغة للعلاج. تم التعرف مؤخرا على المنطقة تحت الثفنسية (SCZ) كمنطقة جديدة لتكوين الخلايا العصبية في الفئران البالغة. هنا ، يتم وصف طرق عزل وتوسيع وتمايز SCZ-aNSCs.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
العزلة والثقافة من الخلايا الجذعية البالغة العصبية من المنطقة تحت الثفني ماوس
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يمكن استخدام
الخلايا الجذعية العصبية البالغة (aNSCs) لتجديد أنسجة المخ التالفة. تتمتع الخلايا العصبية العصبية بالقدرة على التمايز والتكاثر في ثلاثة أنواع من الخلايا: الخلايا العصبية والخلايا النجمية والخلايا الدبقية قليلة التغصن. يعد تحديد المناطق المشتقة من aNSC وتوصيف خصائص aNSC أمرا بالغ الأهمية للاستخدام المحتمل ل aNSCs ولتوضيح دورها في التجديد العصبي. تم الإبلاغ مؤخرا عن أن المنطقة تحت الثففية (SCZ) ، الواقعة بين المادة البيضاء والحصين ، تحتوي على الخلايا العصبية العصبية وتؤدي باستمرار إلى ظهور الخلايا العصبية. يتم تمييز نسبة منخفضة من aNSCs من SCZ إلى خلايا عصبية. يتم تمييز معظم الخلايا إلى خلايا دبقية ، مثل الخلايا الدبقية قليلة التغصن والخلايا النجمية. يقترح أن هذه الخلايا لديها إمكانات علاجية لإصابة القشرة الرضحية. يصف هذا البروتوكول بالتفصيل عملية إنشاء SCZ-aNSCs من دماغ فأر بالغ. يتم استخدام مصفوفة دماغية بفواصل زمنية 1 مم للحصول على الشرائح الإكليلية المحتوية على SCZ وتشريح SCZ بدقة من الدماغ بأكمله. تخضع أقسام SCZ في البداية لثقافة الغلاف العصبي. يسمح نظام الاستزراع المتطور بالتحقق من خصائصها ويمكن أن يزيد من البحث في NSCs. يوفر نظام ثقافة الغلاف العصبي أداة مفيدة لتحديد الانتشار وجمع NSCs الأصلية. الثقافة أحادية الطبقة هي أيضا نظام في المختبر لفحص الانتشار والتمايز. بشكل ملحوظ ، يوفر نظام الثقافة هذا بيئة أكثر تجانسا للخلايا العصبية من نظام ثقافة الغلاف العصبي. وبالتالي ، باستخدام منطقة دماغية منفصلة ، ستكون أنظمة الثقافة هذه مفيدة لتوسيع معرفتنا حول aNSCs وتطبيقاتها للاستخدامات العلاجية.
المقدمة
تتميز
NSCs بخصائص التجديد الذاتي والتمايز متعدد الأنسبات. لتأكيد هذه الخصائص ، تم استخدام نظام ثقافة الغلاف العصبي على نطاق واسع. تم تطوير نظام ثقافة الغلاف العصبي في أوائل التسعينيات وكان بمثابة نظام قياسي لزراعة الخلاياالجذعية 1. اعتمادا على فاعلية التجديد الذاتي ، تتكاثر الخلايا العصبية العصبية باستمرار وتولد كتلة خلوية في ثقافة التعليق. يعتبر عدد الخلايا وحجم الغلاف العصبي مرتبطين ارتباطا وثيقا بخصائص تكاثر الخلايا العصبية العصبية ، كما تستخدم الثقافات أحادية الطبقة على نطاق واسع للحفاظ على الخلايا العصبية وتمايزها. بالمقارنة مع ثقافة الغلاف العصبي ، يوفر نظام الثقافة أحادية الطبقة صيانة متجانسة أفضل وتوسعا لNSCs 2. ساهم هذان النظامان المتطوران للثقافة في توصيف aNSCs في المختبر.
NSCs موجودة في مناطق مختلفة من الدماغ ، مثل المنطقة تحت البطينية (SVZ) للبطين الجانبي والمنطقة تحت الحبيبية (SGZ) للحصين3-5. يتم التعرف على المنطقة تحت الثففية (SCZ) للمادة البيضاء تحت القشرية الذيلية كمنطقة عصبية جديدة6-8. تم الإبلاغ مؤخرا عن أن SCZ-aNSCs لديها إمكانات علاجية في إصابات الدماغ الرضحية9. بالمقارنة مع المناطق العصبية الأخرى ، يقع SCZ على طول المادة البيضاء تحت القشرية. في الدماغ البشري ، تحتل المادة البيضاء تحت القشرية منطقة أكبر من دماغ الفأر10. لذلك ، فإن فهم خصائص SCZ-aNSCs باستخدام نظام الزراعة في المختبر أمر مهم من أجل تعزيز الاستخدام المحتمل لهذه الخلايا للتجديد العصبي. مطلوب تشريح دقيق لمنطقة الدماغ المرغوبة لاستبعاد التلوث المحتمل بالمناطق غير المرغوب فيها التي تحتوي على NSCs نشطة أو هادئة. على سبيل المثال ، يمكن تنشيط aNSCs في المناطق غير العصبية وإنتاج خلايا عصبية جديدة في الأدمغة المصابة أو أثناء الزراعة في المختبر 11. للحصول على الخلايا الجذعية العصبية من SCZ ، تم جمع الخلايا من شرائح الدماغ التي تحتوي على SCZ. بعد ذلك ، تم إجراء تشريح دقيق لمنطقة SCZ باستخدام إبرة دقيقة. لتوليد الغلاف العصبي من SCZ ، تم فصل قطع أنسجة SCZ التشريح الدقيق إلى خلايا مفردة ثم زراعتها كمعلق في وجود عامل نمو البشرة (EGF) وعامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF). بعد أن تشكل SCZ-aNSCs مجالات عصبية ، يمكن أيضا الحفاظ عليها كمجالات عصبية أو طبقات أحادية للتوسع. يوضح هذا الإجراء أيضا عمليات التلوين المناعي بعلامات مختلفة للكشف عن الخلايا العصبية العصبية وذريتها بعد توسعها وتمايزها في ثقافة أحادية الطبقة. هنا ، يتم تقديم بروتوكول مرئي لنظام ثقافة SCZ-aNSC. يحتوي هذا البروتوكول على تعليمات مفصلة للتشريح الدقيق لمنطقة SCZ ولصيانة الخلايا ومرورها.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد المواد والثقافة المتوسطة
- للتشريح والتفكك من SCZ، والتفاف مصفوفة الدماغ، ذو حدين شفرة حلاقة، وملقط مع رقائق الألومنيوم، ومن ثم تعقيم لهم من قبل التعقيم.
- تجهيز 50 مل من العازلة في برنامج تلفزيوني البارد لغسل دماغ الفأر كله.
- انشاء المجهر تشريح وإعداد الأدوات الجراحية اللازمة لتشريح الدماغ (مقص وملقط تعقيمها) وعزل (مل حقنة 1، 30 إبرة G، مصفوفة الدماغ، وملقط غرامة) SCZ.
- إعداد N2 المتوسطة:
- إعداد F-12 / DMEM (+ L-glutamin، + بيكربونات الصوديوم) متوسطة مع 2٪ B27، 1٪ المكملات N2، و 1٪ البنسلين، الستربتوميسين.
ملاحظة: يتكون متوسط النمو المتوسطة ونمو العوامل N2 (20 نانوغرام / مل عامل البشرة النقاء النمو (EGF) و 20 نانوغرام / مل عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF2)).
- إعداد F-12 / DMEM (+ L-glutamin، + بيكربونات الصوديوم) متوسطة مع 2٪ B27، 1٪ المكملات N2، و 1٪ البنسلين، الستربتوميسين.
- إعداد العازلة الهضم (40 وحدة / مل غراء، و 2.4 وحدة / مل dispasالبريد الثاني، و 2٪ في برنامج تلفزيوني الستربتومايسين البنسلين) لعملية الهضم الأنسجة.
- إعداد لوحة طلاء وساترة:
- إعداد بولي-L-الأورنيثين (منظمة التحرير الفلسطينية، 0.01٪) و laminin (10 ميكروغرام / مل حل في DH 2 O). إلى معطف 6 لوحات جيدا للحفاظ على SCZ-aNSCs كما أحادي الطبقة أو 18 coverslips ملم لالمناعية، احتضان لهم مع منظمة التحرير الفلسطينية بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. ثم غسلها 3 مرات مع DH 2 O. السماح لوحات وcoverslips حتى يجف بعد الغسيل الماضي.
- بعد ذلك، احتضان لوحات مع laminin بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. ثم، غسلها 3 مرات مع DH 2 O.
تحذير: لا تجف في laminin، والتي سوف تؤثر على مرفق الخلية.
ملاحظة: حلول الطلاء يمكن إعادة استخدامها 3 مرات.
2. العزلة والتفكك من SCZ الكبار
- قبل إعداد والثقافة، ووضع مصفوفة الدماغ والحلاقة ذو حدين على الجليد.
ملاحظة: لا تجميد مصفوفة الدماغ، لأن رعين يمكن أن نعلق عليه. - تضحية الماوس (8 أسابيع من العمر) من خلال CO 2 الخنق أو خلع عنق الرحم.
- قطع الرأس مع مقص حاد بعد رش 70٪ من الإيثانول. لشل حركة الرأس، وعقد كلا جانبي الرأس بإحكام. قطع الجلد مع مقص في خط الوسط في اتجاه الذيلية منقاري. هذا يشجع على الإزالة الكاملة للجلد من الجمجمة.
- إزالة جزء الذيلية من الجمجمة (الخلفي لامدا) أولا، ومن ثم إدراج ملقط بين الجمجمة والدماغ في موقف ظهري خط الوسط. الاستيلاء على اليسار (أو اليمين) الجداري العظام وقشر بعناية تشغيله. كرر هذا الإجراء لإزالة العظم الجداري الآخرين.
ملاحظة: انقطاع العصب البصري وإزالة السحايا من الدماغ يجعل من الاسهل لفصل المخ من الجمجمة. - نقل الدماغ لالعازلة في برنامج تلفزيوني الباردة (25 مل)، وشطفه مرتين لإزالة الدم الزائد.
- وضع الدماغ في مصفوفة الدماغ على الجليد وأماهكه خفض الاكليلية للحصول على شرائح سميكة 1 مم. نقل شرائح الدماغ (1 مم) الذي يحتوي على مناطق SCZ التي تقع في الجزء الخلفي من الدماغ إلى برنامج تلفزيوني الباردة في 35 مم طبق بتري البلاستيكية.
تحذير: من أجل الحصول على طائرة موازية من أقسام الاكليلية، تأكد من أن الشق الدماغ يتم وضعها في خط الوسط من مصفوفة الدماغ. فمن الأهمية بمكان لتجنب الاختلافات التي لا داعي لها في الفروع.
ملاحظة: الحصول على شرائح الدماغ بمعدل 2-3 ملم الخلفي إلى bregma. وهذا يسمح للفصل SCZ من SVZ. - تحت المجهر تشريح مع تضخم منخفض، والصغرى تشريح SCZ من منطقة المادة البيضاء من القشرة والحصين مع عازمة 6،9 30G إبرة. ثم، وإزالة مناطق القشرة فوق SCZ. وضع المنطقة SCZ تشريح من شرائح إلى 35 مم طبق بتري البلاستيك على الجليد دون برنامج تلفزيوني الباردة.
ملاحظة: تلوث مناطق إضافية تحتوي على الخلايا العصبية الناضجة يمكن أن تؤثر على سلامة aNSCs وneurosphere تشكيل بecause أنها تخضع لموت الخلايا في ظروف ثقافة aNSC. - باستخدام عازمة 30 إبرة G، ختم على الفور الأنسجة تشريح الى قطع صغيرة.
ملاحظة: إذا كنت بحاجة لوقت أطول لتشريح الأنسجة SCZ، تزج الأنسجة تشريح في برنامج تلفزيوني الباردة قبل تقطيع. - اعادة تعليق الأنسجة المفروم مع 1 مل من العازلة الهضم، ونقل الأنسجة لأنبوب 15 مل تحتوي على 2 مل من العازلة الهضم، واحتضان لمدة 30 دقيقة في 37 ° C حمام الماء.
ملاحظة: هز أنبوب كل 10 دقيقة لتخلط جيدا.
3. المستمدة المنطقة، تحت الثفني ثقافة الكبار الخلايا الجذعية العصبية
- الاستفادة من أنبوب أقل ما يقال لفصل الأنسجة هضمها، ثم الطرد المركزي الأنبوب في 145 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف، إعادة تعليق الأنسجة هضمها مع 1 مل من قبل حرارة متوسطة N2 لتغسل العازلة الهضم، والماصة بلطف محلول العينة بحد أقصى 5 مرات باستخدام ماصة P1000.
ملاحظة: أكثر من الطحن مع ضيقطرف الماصة يمكن أن يقلل من بقاء الخلية والنمو اللاحق. - أنبوب الطرد المركزي في 145 x ج لمدة 5 دقائق. بعد التخلص من طاف، وإعادة تعليق بيليه خلية في 1 مل من N2 المتوسطة.
- إعداد 1 مل من N2 المتوسطة في لوحة غير المغلفة 6 جيدا وإضافة 1 مل من الخلايا مع وقف التنفيذ لجعل الحجم النهائي من 2 مل.
- إضافة EGF (20 نانوغرام / مل)، وbFGF (20 نانوغرام / مل) في كل بئر. يهز بلطف طبق ثقافة 6 جيدا باليد لخلط عوامل النمو واضاف مع الخلايا مطلي. الحفاظ على لوحة 6 جيدا في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 الحاضنة.
- إضافة EGF (20 نانوغرام / مل)، وbFGF (20 نانوغرام / مل) لكل جيدا كل يوم لمدة 8 أيام. كل يوم الثالث على التوالي، إضافة 200 ميكرولتر من وسائل الإعلام N2 للحفاظ على وحدة التخزين 2 مل التقريبي المتوسط.
4. الركض من NSCs كما Neurospheres والثقافات أحادي الطبقة
- جمع neurospheres ونقلها إلى أنبوب جديد مخروطي 15 مل.
ملاحظة: عدد neurospheres (> 50 ميكرون قطر) بيوص جيدا من SCZ من الدماغ ماوس واحدة 64.3 ± 7.31، الذي كان أقل من ذلك من SVZ (190.5 ± 6.33) 9. - احتضان neurospheres مع 0.5 مل من العازلة تفارق لمدة 5 دقائق في 37 ° C حمام الماء لفصل وneurospheres إلى الخلايا وحيدة. يمكن فصلها neurospheres الأساسي في الخلايا واحدة وحافظت على العديد من المقاطع كما neurosphere أو أحادي الطبقة الثقافات.
ملاحظة: توسيع SCZ-aNSCs كما أحادي الطبقة متفوقة على neurospheres لSCZ-aNSCs يمكن passaged> 10 مرات في شكل ثقافة أحادي الطبقة، ولكن <5 مرات في شكل ثقافة neurosphere.
تحذير: SCZ-aNSCs يحمل تجميع قوي، وأنه من الصعب فصل تحويلها إلى خلايا واحدة. وبالتالي، لا ينصح شكل ثقافة neurosphere للتوسع الخلايا الروتينية. - الماصة بلطف محلول العينة صعودا وهبوطا مع ماصة P1000 أقل من 5 مرات وأجهزة الطرد المركزي الأنبوب في 145 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف وإعادة سوقضاء neurospheres مع 1 مل من N2 المتوسطة.
ملاحظة: أكثر من الطحن مع طرف ماصة ضيق يمكن أن تقلل بقاء الخلية والنمو اللاحق. - عد الخلايا، وجعل 1: 1 خليط من تعليق خلية (10 ميكرولتر) وبنسبة 0.4٪ التريبان حل الأزرق، ومن ثم حساب عدد الخلايا الحية على الكريات. بعد طلاء لوحة 6 جيدا مع منظمة التحرير الفلسطينية / laminin، لوحة الخلايا عند 2.5 × 10 5 خلية / مل مع 2 مل من المتوسط N2 لكل بئر.
ملاحظة: التغييرات في كثافة الخلايا يمكن أن تؤثر على حالتهم وإمكانية التمايز. - الحفاظ على SCZ-aNSCs مع العلاج يوميا من عوامل النمو (2 مل 20 نانوغرام / مل) لمدة 5 أيام، ومنها مرور لهم.
5. تمايز المستمدة المنطقة، تحت الثفني الخلايا الجذعية البالغة العصبية
- aNSCs لوحة الصعود إلى المغلفة Laminin ومنظمة التحرير الفلسطينية / ساترة 18 ملم مع 1 × 10 5 خلية / مل في 1 مل N2 مع عوامل النمو (20 نانوغرام / مل) للتمايز SCZ-aNSCs.
- اليوم المقبل،عندما يتم إرفاق الخلايا بقوة إلى ساترة، تبادل المتوسطة النمو مع N2 لإزالة عوامل النمو.
- بعد 6 أيام، وغسل خلايا متباينة مع 1 مل من برنامج تلفزيوني لإزالة الحطام الخلية ومعالجتها لالمناعية.
ملاحظة: يمكن إدراجها BrdU في الحمض النووي توليفها حديثا من الخلايا المتكاثرة. لذلك، إذا رغبت في ذلك، BrdU (10 ميكروغرام / مل) ويمكن أن يضاف للعيش الخلايا قبل التثبيت من الخلايا.
6. المناعية الكبار العصبية الخلايا الجذعية ومتباينة أسلاف
- لالمناعية، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني واصلاحها مع PFA 4٪ لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
تحذير: PFA شديدة السمية. تجنب الاتصال مع الجلد والعينين. - إزالة 4٪ PFA، وشطف الخلايا الثابتة مع برنامج تلفزيوني 3 مرات، ومن ثم تخزينها في 4 درجات Cuntil تكون هناك حاجة إليها لالمناعية.
- احتضان الخلايا على ساترة مع عرقلة الحل (3٪ ألبومين المصل البقري و 0.1٪ تريتون X-100 في 1X PBS) لمدة 30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد الأجسام المضادة الأولية في عرقلة الحل الطازجة واحتضان عينات بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- المناعية للaNSCs
- وصمة عار على aNSCs استخدام الألغام المضادة للNestin وأضداد BrdU. قبل التثبيت، وإضافة 20 ميكروغرام من BrdU إلى aNSCs واحتضان لهم لمدة 2 ساعة. تنفيذ الخطوة تغيير طبيعة باستخدام 2 N حمض الهيدروكلوريك لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة Cbefore أداء خطوة الحجب.
- المناعية الأسلاف متباينة:
- استخدام مكافحة O4، ومكافحة BIII تويولين، وأضداد الدبقية ييفي البروتين الحمضية (GFAP) لتسمية الأسلاف متباينة.
- المناعية للaNSCs
- غسل العينات مع PBS 3 مرات واحتضان لهم مع الأجسام المضادة الثانوية مترافق الأصباغ الفلورية (1: 500) في عرقلة الحل لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم، وغسل العينات 3 مرات مع برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: استخدام الأجسام المضادة الثانوية التي تتناسب مع المضيفين من المرحلة الابتدائيةالأجسام المضادة. يستخدم لتلطيخ النووي: Hoechest33343 (2000 1). - إضافة الحل المتصاعدة إلى الشريحة الزجاجية، والمضي قدما في تصاعد مستمر. مراقبة وصورة العينة على المجهر متحد البؤر في موجات متعددة: FITC (488 نانومتر)، و Cy3 (543 نانومتر)، Cy5 (647 نانومتر)، وHoechest33343 (405 نانومتر).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تحديد نظام للثقافة aNSCs من المنطقة العصبية غير معروفة من الضروري لفهم هذه الخلايا وتطوير استخدامها المحتمل في إصلاح الدماغ 12. ومن المعروف أن NSCs في مراحل تنموية مختلفة أو في مناطق مختلفة تتصرف بشكل مختلف 3،4. في الآونة الأخيرة، أفيد أن الخلايا المشتقة SCZ-يحمل إمكانات التفاضلية للتمايز الخلايا العصبية في الجسم الحي في المختبر بالمقارنة مع الخلايا المشتقة SVZ-7-9. لذلك، لعزل بالضبط كل منطقة العصب...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وتصف هذه الورقة بروتوكول مفصلة لتوليد NSCs من SCZ الماوس الكبار والمحافظة عليها لمختلف التطبيقات. هناك ثلاث خطوات حاسمة لإقامة المختبر في نظام الثقافة اللازمة لتنقية وتوسيع SCZ-NSCs. أولا، من المهم التأكد من أن المنطقة SCZ يتم تشريح بالضبط الخروج من المناطق العصبية المحتملة الأخرى (الشكل 1B). وقد تم الحصول على أبواب سميكة ودقيقة تحتوي على مناطق SCZ مع 1 مم الفاصلة مصفوفة الدماغ، ومن ثم تم استخدام إبرة دقيقة لتشريح الجزئي للSCZ من المناطق القشرية الأخرى
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل برنامج أبحاث الدماغ من خلال المؤسسة الوطنية للبحوث (NRF) ، بتمويل من وزارة العلوم الكورية وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات والتخطيط المستقبلي (Grants NRF-2015M3C7A1028790) ؛ وبمنحة من مشروع البحث والتطوير في مجال التكنولوجيا الصحية الكوري من خلال المعهد الكوري لتطوير الصناعة الصحية (KHIDI) ، بتمويل من وزارة الصحة والرفاهية ، جمهورية كوريا (HI14C3347).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <مكونات قوية > متوسطة < / قوية > | |||
| DMEM / F12 ؛ | Gibco | 11320-033 | + L-glutamin ، + قلم بيكربونات الصوديوم |
| / Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| مكمل N2 | Gibco | 17502-048 | |
| مكمل B27 | Gibco | 17504-044 | |
| <قوي>عامل النمو< / قوي > | |||
| bFGF | R & D | 233-FB | |
| EGF | Gibco | PHG0313 | |
| Buffer< / strong> | |||
| PBS (10x) | BIOSOLUTION | BP007a | 1x تخفيف |
| HBSS | Gibco | 14175-095 | |
| dissociattion buffer< / strong> | |||
| Dispase II | Roche | 04-942-078-001 | |
| بابين | ورثينجتون | 3126 | |
| Accutase | ICT | AT-104 | |
| Tool< / strong> | |||
| ملقط ناعم | WPI | 555229F | |
| مقص | Storz | E3321-C | |
| مصفوفة الدماغ (1 مم) | RWD | 68707 | |
| ماكينة حلاقة ذات حدين | DORCO | ST-300 | |
| 30 جرام إبرة | SUNGSHIM | N1300 | |
| <قوية>المواد< / قوية> | |||
| 15 مل أنابيب | SPL | 50015 | |
| 50 مل SPL | 50050 | ||
| 35 مم | طبق SPL | 10035 | بتري |
| 100 مم | طبق SPL | 10090 | طبق بتري |
| (18 مم) | Deckglaser | 111580 | |
| 12 طبق بئر | SPL | 32012 | غير مطلي |
| 6 طبق بئر | SPL | 32006 | غير مطلي |
| <قوي > مواد الطلاء < / قوي > | |||
| PLO | Sigma | P4957 | 0.01٪ |
| Laminin | Gibco | 23017-015 | 10 مجم / مل |
| <قوي>الأجسام المضادة الأولية < / قوي> | |||
| Nestin | Millipore | MAB353 | (1: 1،000) |
| أرنب EGFR | Abcam | ab2430 | (1: 1،000) DCX |
| سانتا كروز | SC8066 | الماعز (1: 500) أرنب | |
| Tuj1 | Sigma | T2200 | (1: 2،000) |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | فأر (1: 1،000) |
| O4 | ماوس Millipore | MAB345 | (1: 500) |
| BrdU | Abcam | ab6326 | Rat (1: 500) |
| <قوي > الأجسام المضادة الثانوية < / قوي > | |||
| مضاد للفأر 488 | Invitrogen | A21202 | 1: 500 |
| مضاد للفأر cy3 | جاكسون | 715-165-151 | |
| مضاد للفأر 647 | جاكسون | 715-606-150 | |
| مضاد للأرانب 488 | Alexa | A21206 | |
| مضاد للأرانب cy3 | جاكسون | 711-165-152 | |
| مضاد للأرانب 647 | جاكسون | 711-605-152 | |
| مضاد للماعز 488 | Alexa | A11055 | |
| مضاد للماعز cy3 | جاكسون | 705-165-147 | |
| مضاد للماعز 647 | Invitrogen | A21447 | |
| مضاد للجرذان 488 | Invitrogen | A21208 | |
| مضاد للجرذان cy3 | جاكسون | 712-166-150 | |
| مضاد للجرذان 647 | جاكسون | 712-605-153 | |
| <مواد تلطيخ مناعية قوية> < / قوي> | |||
| BSA | ميليبور | 82-100-6 | 3٪ BSA مع 0.1٪ Triton X-100 في PBS |
| Triton X-100 | USB | 22686 | |
| 4٪ PFA | Biosesang | P2031 | |
| Hoechest33342 | Life Technology | H3570 | صبغة لتلوين النوى |
المراجع
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Developmental biology. 175, 1-3 (1996).
- Babu, H., Cheung, G., Kettenmann, H., Palmer, T. D., Kempermann, G. Enriched monolayer precursor cell cultures from micro-dissected adult mouse dentate gyrus yield functional granule cell-like neurons. PloS one. 2, e388(2007).
- Alvarez-Buylla, A., Garcia-Verdugo, J. M. Neurogenesis in adult subventricular zone. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 629-634 (2002).
- Kempermann, G., Song, H., Gage, F. H. Neurogenesis in the Adult Hippocampus. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7, a018812(2015).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
- Seri, B., et al. Composition and organization of the SCZ: a large germinal layer containing neural stem cells in the adult mammalian brain. Cereb Cortex. 16 Suppl 1, i103-i111 (2006).
- Kim, W. R., et al. Evidence for the spontaneous production but massive programmed cell death of new neurons in the subcallosal zone of the postnatal mouse brain. The European journal of neuroscience. 33, 599-611 (2011).
- Kim, H. J., Kim, J. Y., Sun, W. Age-dependent changes in the subcallosal zone neurogenesis of mice. Neurochemistry international. 61, 879-884 (2012).
- Kim, J. Y., et al. Promotion of Cortical Neurogenesis from the Neural Stem Cells in the Adult Mouse Subcallosal Zone. Stem Cells. , (2015).
- Nunes, M. C., et al. Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain. Nature medicine. 9, 439-447 (2003).
- Gould, E. How widespread is adult neurogenesis in mammals? Nature reviews. Neuroscience. 8, 481-488 (2007).
- Gage, F. H., Temple, S. Neural stem cells: generating and regenerating the brain. Neuron. 80, 588-601 (2013).
- Shaker, M. R., Kim, J. Y., Kim, H., Sun, W. Identification and characterization of secondary neural tube-derived embryonic neural stem cells in vitro. Stem cells and development. 24, 1171-1181 (2015).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Molecular neurobiology. 34, 153-161 (2006).
- Suslov, O. N., Kukekov, V. G., Ignatova, T. N., Steindler, D. A. Neural stem cell heterogeneity demonstrated by molecular phenotyping of clonal neurospheres. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 14506-14511 (2002).
- Richards, L. J., Kilpatrick, T. J., Bartlett, P. F. De novo generation of neuronal cells from the adult mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 8591-8595 (1992).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Gritti, A., et al. Epidermal and fibroblast growth factors behave as mitogenic regulators for a single multipotent stem cell-like population from the subventricular region of the adult mouse forebrain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 19, 3287-3297 (1999).
- Wachs, F. P., et al. High efficacy of clonal growth and expansion of adult neural stem cells. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 83, 949-962 (2003).
- Xiong, F., et al. Optimal time for passaging neurospheres based on primary neural stem cell cultures. Cytotechnology. 63, 621-631 (2011).
- Lee, S. W., et al. Optimization of Matrigel-based culture for expansion of neural stem cells. Animal Cells and Systems. 19, 175-180 (2015).
- Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nature protocols. 7, 2005-2012 (2012).
- Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. JoVE (Journal of Visualized Experiments). , e51225(2014).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
