يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

باستخدام سقالة الليبوزومات لإعادة تفاعلات البروتين البروتين، الدهون القريب في المختبر

8.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/54971

⸱

يناير 11, 2017

 , 
1Department of Pharmacology, Center for Mitochondrial Diseases, The Cleveland Center for Membrane and Structural Biology, Case Western Reserve University School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

تصف هذه الورقة طريقة لتقييم تفاعلات وتجميعات بروتينات الغشاء المتكاملة في المختبر مع عوامل شريكة مختلفة في بيئة شحمية قريبة.

الملخص

في كثير من الأحيان معقدة دراسات للبروتينات الغشاء لا يتجزأ في المختبر عن طريق وجود مجال الغشاء مسعور. يزيد من تعقيد هذه الدراسات، إعادة إدماجهم في الحياة من البروتينات الغشاء المنظفات بالفاعلات في الجسيمات الشحمية هي عملية العشوائية حيث طوبولوجيا البروتين من المستحيل تطبيقها. تقدم هذه الورقة طريقة بديلة لهذه التقنيات الصعبة التي تستخدم سقالة القائم على الحويصلية. ومما يعزز الذوبان البروتين عن طريق حذف المجال عبر الغشاء، ويتم استبدال هذه الأحماض الأمينية مع شاردة الربط، مثل صاحب العلامة. هذا الحبل يتفاعل مع مجموعة ترسيخ (ني 2+ بتنسيق من حمض nitrilotriacetic (NTA (ني 2+)) لصاحب الموسومة البروتينات)، التي تفرض طوبولوجيا البروتين موحد على سطح الجسيمات الشحمية. ويقدم مثالا حيث التفاعل بين ذات الصلة Dynamin بروتين 1 (Drp1) مع بروتين الغشاء لا يتجزأ، الميتوكوندريا الانشطار عامل (MFF)، وكان إنفيstigated استخدام هذا الأسلوب سقالة الحويصلية. في هذا العمل، لقد أثبتنا قدرة MFF لتجنيد بكفاءة Drp1 القابلة للذوبان على سطح الجسيمات الشحمية، الأمر الذي حفز النشاط GTPase لها. وعلاوة على ذلك، كانت قادرة على tubulate القالب الدهون زينت MFF في وجود الدهون محددة Drp1. يوضح هذا المثال فعالية الجسيمات الشحمية سقالة باستخدام فحوصات الهيكلية والوظيفية ويسلط الضوء على دور MFF في تنظيم النشاط Drp1.

المقدمة

دراسة تفاعلات البروتين البروتين غشاء الداني هو مسعى صعبة بسبب صعوبة تلخص البيئة الأصلية للبروتينات الغشاء لا يتجزأ المشاركة 1. ويرجع ذلك إلى ضرورة إذابة المنظفات والتوجه يتعارض البروتينات في proteoliposomes هذا. من أجل تجنب هذه القضايا، ونحن قد استخدمت استراتيجية حيث يتم التعبير عن المجالات القابلة للذوبان من بروتينات الغشاء لا يتجزأ كما بروتينات اندماج صاحب العلامة، وترتكز هذه الشظايا القابلة للذوبان في الجسيمات الشحمية سقالة عبر التفاعل مع الهيئة الوطنية للمواصلات (ني 2+) headgroups في الدهون سطح. باستخدام هذه الاطر، وتفاعلات البروتين الدهني الداني يمكن التحقيق على مجموعة من الدهون والبروتين التراكيب.

ولقد طبق فعليا هذا الأسلوب لتحقيق تفاعلات البروتين البروتين الحرجة التي تحكم التجمع من مجمع الانشطار الميتوكوندريا ودراسة التفاعلات الدهون التي تعدل هذه العلاقات العامةocess 2. أثناء الانشطار الميتوكوندريا، وهو محفوظ البروتين غشاء إعادة عرض، ودعا المتعلقة Dynamin بروتين 1 (Drp1) 3، ويتم تجنيدهم للسطح الخارجي الميتوكوندريا غشاء (OMM) استجابة لإشارات الخلوية التي تنظم توازن الطاقة، مما يشير أفكارك، وعدد آخر عمليات الميتوكوندريا لا يتجزأ. يتم تجنيد هذا كبير، GTPase عصاري خلوي إلى السطح من الميتوكوندريا من خلال التفاعل مع بروتينات OMM لا يتجزأ 4-8. وقد كان دور واحد مثل البروتين، الميتوكوندريا الانشطار عامل (MFF)، من الصعب توضيح بسبب ضعف التفاعل الواضح مع Drp1 في المختبر. ومع ذلك، فقد أظهرت الدراسات الجينية بوضوح أن MFF أمر ضروري لنجاح 7،8 الانشطار الميتوكوندريا. وكان الأسلوب هو موضح في هذه المخطوطة قادرة على التغلب على أوجه القصور السابقة عن طريق إدخال التفاعلات الدهون المتزامنة التي تعزز التفاعلات Drp1-MFF. عموما، هذه الرواية فحص reveaأدت قوة أساسية تجميع المجمع الانشطار الميتوكوندريا توجيه وقدمت مرحلة جديدة للدراسات الهيكلية والوظيفية لهذه الآلة الجزيئية الأساسية.

حتى الآن، دراسة التفاعلات بين Drp1 وMFF وتعقدت من المرونة المتأصلة في MFF 9، عدم تجانس Drp1 البوليمرات 2،10، وصعوبة في تنقية وإعادة تشكيل كامل طول MFF مع مجال الغشاء سليمة 11. تناولنا هذه التحديات باستخدام الجسيمات الشحمية NTA (ني 2+) سقالة لإعادة صاحب الموسومة-MFF تفتقر نطاق الغشاء لها (MffΔTM-صاحب 6). وكانت هذه الاستراتيجية مفيدة لMffΔTM كان ذوبان للغاية عند الإفراط في المعبر عنها في البريد. القولونية، وهذا البروتين المعزول أعيد بسهولة على الجسيمات الشحمية سقالة. عندما المربوطة إلى هذه القوالب الدهون، يفترض MFF ومتطابقة، في مواجهة الخارج التوجه على سطح الغشاء.وبالإضافة إلى هذه المزايا، والدهون الميتوكوندريا، مثل كارديوليين، أضيفت إلى استقرار MFF قابلة للطي وبالتعاون مع غشاء 11. يتفاعل كارديوليين أيضا مع المجال متغير من Drp1 2،12 والتي قد استقرار هذه المنطقة المضطربة وتسهيل تجميع الآلات الانشطار.

هذه طريقة قوية غير قابلة للتطبيق على نطاق واسع للدراسات المستقبلية التي تسعى إلى تقييم تفاعلات البروتين غشاء الداني. من خلال استخدام التفاعلات إضافية الربط / تقارب، وتطور هذه الدراسات غشاء إعادة يمكن تعزيز لتقليد تعقيد إضافي وجدت على سطح الأغشية داخل الخلايا. في نفس الوقت، والتراكيب الدهون يمكن تعديلها لتحاكي بدقة أكثر البيئات المحلية من هذه المجمعات الجزيئات. وخلاصة القول، وهذه الطريقة توفر وسيلة لدراسة المساهمات النسبية للبروتينات والدهون في تشكيل الأشكال التضاريسية غشاء إليها أثناء بروك الخلوي حرجةesses.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد الحويصلية سقالة

ملاحظة: من الناحية المثالية، ينبغي أن التجارب الأولية استخدام سقالة بسيطة نسبيا وملامح و(تتألف من DOPC (1،2-dioleoyl- التعطيل -glycero-3-phosphocholine أو PC) وDGS-NTA (ني 2+) (1،2-dioleoyl - SN -glycero 3 - [(N - (5-أمينو-1-carboxypentyl) حمض iminodiacetic) succinyl]. (النيكل الملح)) بناء الخروج من هذه التجارب، تهمة الدهون، والمرونة، وانحناء كما يمكن ادخال العوامل الفردية مع القدرة على تغيير التفاعلات غشاء الداني. وهذه التغيرات يمكن أن يتحقق عن طريق إضافة كميات محددة من مكونات الدهون محددة، بما في ذلك فسفاتيديل أو كارديوليين (CL)، فسفاتيديل إيثانولامين (مخدر أو PE)، أو galactosyl (β) سيراميد.

  1. الجمع بين الدهون الذائبة في الكلوروفورم في أنبوب اختبار زجاجي نظيف. تتبخر المذيب مع غاز النيتروجين الجاف في حين تناوب أنبوب لتشكيل لفيلم الدهون رقيقة. إزالة المذيبات المتبقية مع centrifugaل المبخر لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: تستخدم مركبات الحويصلية مختلفة في البروتوكولات المذكورة أدناه: الجسيمات الشحمية سقالة (3.3 مول٪ DGS-NTA (ني 2+) / 96.7 مول٪ DOPC)، الجسيمات الشحمية سقالة مع كارديوليين (3.3 مول٪ DGS-NTA (ني 2+) / 10 مول٪ كارديوليين / 86.7 مول٪ DOPC)، الجسيمات الشحمية سقالة مرنة مع كارديوليين (3.3 مول٪ DGS-NTA (ني 2+) / 10 مول٪ كارديوليين / 35 مول٪ مخدر / 51.7 مول٪ DOPC)، وسقالة المخصب الجسيمات الشحمية (10٪ مول DGS-NTA (ني 2+) / 15 مول٪ كارديوليين / 35 مول٪ مخدر / 40 مول٪ DOPC).
  2. إضافة العازلة ألف (25 ملي HEPES (4- (2-هيدروكسي) حامض -1-piperazineethanesulfonic)، 150 ملي بوكل، ودرجة الحموضة تعديلها إلى 7.5 مع KOH) مسخن الى 37 درجة مئوية بحيث تركيز الدهون النهائي 1-2 ملم. احتضان 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع vortexing لعرضية ل resuspend تماما خليط الدهن (الشكل 1A).
  3. نقل إلى أنبوب اختبار البلاستيك، ووضع أنبوب في النيتروجين السائل حتى المجمدة تماما (ROUGHLY 30 ثانية)، ومكان في 37 ° C حمام الماء حتى إذابة تماما (حوالي 1-2 دقائق). تكرار لما مجموعه 4 دورات تجميد ذوبان الجليد (الشكل 1B).
  4. إعداد الطارد الدهون عن طريق نقع 4 يدعم مرشح ومرشح البولي في المخزن وتجميع الطارد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قذف الحل الدهون من خلال تصفية 21 مرة. استخدام لطيف، وضغط مستمر لضمان توزيع حجم متجانسة (الشكل 1C).
    ملاحظة: للحصول على جميع التجارب الموصوفة في هذا البروتوكول، تم استخدام فلتر 1.0 ميكرون البولي للقذف. التفاعل مع Drp1 الدهون أنيوني يمكن ملاحظة مع مجموعة متنوعة من أقطار الحويصلية تتراوح بين 50 نانومتر إلى 400 نانومتر 12 أو أكبر 13. وبالتالي، تم اختيار حجم مرشح من 1 ميكرون لتكون مثالية لكلا النشاط GTPase والمجهر الإلكتروني. وإذا رغبت أقطار الحويصلية الأخرى، وإعداد الحويصلات unilamellar العملاقة 14،15 (GUVs) أو unilamell صغيرةع الحويصلات 16 (سيارات الدفع الرباعي) يمكن استخدامها. تشتت الضوء الحيوي يمكن استخدامها لتقييم الحويصلية حجم التباين 13.
  5. تخزين الجسيمات الشحمية مقذوف في 4 درجات مئوية، وتجاهل بعد 3-5 د.

2. استخدام سقالة الليبوزومات للبروتين تحليل ملزم

  1. إعداد عينة
    1. احتضان صاحب الموسومة MffΔTM (5 ميكرومتر النهائي) مع الجسيمات الشحمية سقالة (40٪ مول PC / 35 مول٪ PE / 15 مول٪ CL / 10 مول٪ DGS-NTA (ني 2+)، و 50 ميكرومتر النهائي) لمدة 15 دقيقة على الأقل في RT في الواق A + BME (25 ملي HEPES، 150 ملي بوكل، 10 ملي β-المركابتويثانول (BME)، ودرجة الحموضة تعديلها إلى 7.5 مع KOH). لعنصر تحكم MFF خالية، واحتضان شحمية مع صاحب الموسومة بروتين السيطرة (مثل GFP) لربط ودرعا تتعرض الهيئة الوطنية للمواصلات (ني 2+).
      وأعرب عن MffΔTM وتنقيته كما هو موضح في دراسة سابقة 2: ملاحظة. تمت تنقية GFP بطريقة مماثلة، ولكن تم حذف الخطوة التبادل الأيوني. كان مطلوبا BME لهذه التجربهنهاية الخبر لأن Drp1 حساسة للأكسدة، والتي يمكن تغيير خصائص النشاط والتجميع.
    2. إضافة Drp1 (2 ميكرومتر النهائي)، واحتضان لمدة 1 ساعة على RT.
      وأعرب عن Drp1 وتنقيته كما هو موضح في دراسة سابقة 2: ملاحظة. بعد الحضانة مع Drp1، وتأثير النوكليوتيدات ملزمة للتشوه غشاء يمكن التحقيق التي يحتضنها ساعة إضافية واحدة مع 2 مم MgCl 2 وإما 1 ملي GTP، 1 ملم GMP-PCP، أو الواق A + أساسيات إدارة الأعمال.
  2. السلبي وصمة عار نقل المجهر الإلكتروني (EM) تحليل
    1. نقل 5 ميكرولتر من العينة إلى ورقة من فيلم المختبر، ووضع نحاس / ره شبكة الكربون المغلفة على العينة. احتضان دقيقة شبكة 1 على العينة، وصمة عار بعيدا السائل الزائد على ورق الترشيح، ونقل إلى انخفاض 2٪ خلات اليورانيل. احتضان 1 دقيقة، وصمة عار وصمة عار الزائدة على ورق الترشيح، ونقل إلى مربع الشبكة. مخزن تحت فراغ O / N لضمان جفاف الكامل.
    2. عينات صورة باستخدام microsc انتقال الإلكترونمكتب مستشار رئيس الوزراء في 18،500 - 30،000X التكبير لمراقبة التغيرات التركيبية في البروتين والحويصلية الأشكال التضاريسية 17.
      ملاحظة: يمكن قياس التغيرات التركيبية باستخدام صورة برامج التحليل، مثل يماغيج 13 (http://imagej.nih.gov/ij/). ويمكن قياس الديكور البروتين بالمقارنة مع قوالب الدهون المجردة. بالإضافة إلى ذلك، بأقطار من شرائح أنبوبي يمكن قياسها من الجزء الخارجي من التجمعات 13. يمكن إجراء تحليل أكثر تفصيلا باستخدام البرد الإلكترون المجهري 17. ويمكن استخدام هذه الطريقة لصورة أصلية المجالس البروتين الدهني في المذيبات دون استخدام البقع المعادن الثقيلة التي معطف العينة. وبهذه الطريقة، سمات هيكلية مفصلة يست واضحة في وصمة عار السلبية، بما في ذلك التغييرات في مورفولوجية الدهون الأساسية، يمكن دراستها وكميا.

3. استخدام سقالة الليبوزومات لالأنزيمية الفحص

ملاحظة: COLORIوقد استخدم المتري GTPase فحص 18 إلى قياس تحرير الفوسفات عن طريق التحلل GTP. 19 يوجد فحوصات GTPase البديلة ويمكن تنفيذها حسب الحاجة.

  1. احتضان صاحب الموسومة-MffΔTM (MFF)، Fis1ΔTM (Fis1)، أو GFP (5 ميكرومتر النهائي للجميع) مع الجسيمات الشحمية سقالة (150 ميكرومتر النهائي) لمدة 15 دقيقة في RT في الواق A + BME (حجم = 30 ميكرولتر). إضافة Drp1 (500 نيوتن متر نهائي)، واحتضان لمدة 15 دقيقة إضافية في RT (حجم = 80 ميكرولتر).
    تمت تنقية Fis1 بطريقة مشابهة لMFF 2، ولكن تم حذف الخطوة اللوني التبادل الأيوني: ملاحظة. والغرض من صاحب الموسومة-GFP هو درع الهيئة الوطنية للمواصلات (ني 2+) headgroups ومنع التفاعلات تهمة غير محددة مع بروتينات أخرى. إذا لوحظ أي تأثير في غياب GFP، ثم قد لا تكون هناك حاجة هذه السيطرة. البروتينات بديلة تسد (ذات الحجم المماثل للبروتين من الفائدة) يمكن أن تستخدم أيضا، ولكن GFP يسمح للرؤية مباشرة للتفاعلات مع المجلس العسكريأضعاف الجسيمات الشحمية.
  2. أنابيب نقل إلى thermocycler مجموعة إلى 37 درجة مئوية، والشروع ردود الفعل بإضافة GTP وMgCl 2 (1 ملم و 2 ملم النهائي، على التوالي؛ حجم = 120 ميكرولتر).
  3. في نقطة الوقت المطلوب (أي T = 5، 10، 20، 40، 60 دقيقة)، ونقل 20 ميكرولتر من رد فعل على الآبار لوحة microtiter تحتوي على 5 ميكرولتر من 0.5 M EDTA لخلابة المغنيسيوم 2+ ووقف رد فعل.
  4. إعداد مجموعة من المعايير الفوسفات عن طريق تمييع KH 2 PO 4 في الواق A + BME لمعايرة النتائج. مجموعة مفيدة من المعايير هو 100، 80، 60، 40، 20، 10، 5 و 0 ميكرومتر. إضافة 20 ميكرولتر من كل الآبار التي تحتوي على 5 ميكرولتر من 0.5 M EDTA.
  5. إضافة 150 ميكرولتر من الملكيت الاخضر كاشف (كربينول الأخضر 1 ملم المرمر، 10 ملي كربونات الأمونيوم tetrahydrate، و 1 N حمض الهيدروكلوريك) إلى كل بئر، وقراءة OD 650 5 دقائق بعد إضافة.
    ملاحظة: GTP هو حمض عطوب، وسوف يتحلل في وجود كاشف الأخضر المرمر. ضمان أن ركان الوقت بين إضافة كاشف المرمر وقراءة ثابتة لضمان تحقيق نتائج استنساخه.
  6. توليد منحنى القياسية بالتآمر OD 650 من المعايير بوصفها وظيفة من تركيز الفوسفات. استخدام الانحدار الخطي لتحديد العلاقة بين التطوير التنظيمي 650 و تركيز الفوسفات في عينة.
  7. باستخدام الانحدار الخطي، تحويل OD 650 من العينات رد فعل البروتين لميكرومتر الفوسفات. تحديد معدل توليد الفوسفات لكل خليط التفاعل بالتآمر تركيز الفوسفات بوصفها وظيفة من الزمن، وتحويل إلى k القط بقسمة سعر الفائدة من قبل تركيز Drp1 (0.5 ميكرومتر).
    ملاحظة: فقط معدل الخطية الأولي ينبغي أن تستخدم لتحديد معدل توليد الفوسفات، ويجب استخدام ما لا يقل عن 3 نقاط البيانات. إذا كان معدل رد فعل سريع بما فيه الكفاية أن أول ثلاث نقاط البيانات غير الخطية (أي ص 2 من نوبة الخطي هو أقل من 0.9) علامةيجب أن يتم تنفيذ أقصر ificantly دوام لا تقل عن 3 نقاط الوقت.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وفي الوقت الذي ظهر التفاعل بين Drp1 وMFF إلى أن تكون مهمة للانشطار الميتوكوندريا، وقد تم هذا التفاعل من الصعب أن ألخص في المختبر. وكان لدينا هدف لمحاكاة البيئة بشكل أفضل الخلوية حيث Drp1 وMFF التفاعل. تحقيقا لهذه الغاية، الجسيمات الشحمية التي تحتوي على تركيزات الحد من الهيئة الوطنية للمواصلات (ني 2+) headgroups تم بواسطة المضادة للجفاف فيلم الدهون كما هو موضح أعلاه أعدت. الحل الدهون تتكون في البداية من الحويصلات unilamellar والص...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يوفر هذا البروتوكول وسيلة لتحقيق البروتين البروتين التفاعلات التي تنطوي على بروتينات الغشاء لا يتجزأ. من خلال الاستفادة من سقالة الحويصلية وحدات، والمحققين قادرون على تقييم نشاط البروتينات واحد أو أكثر في بيئة الدهون القريب. وقد أظهرت دراسات سابقة طريقة مماثلة للأنزيمات مستقبلات غشاء البلازما 24-26. قمنا بتوسيع هذا الأسلوب لدمج العوامل المساعدة الدهون واستكشاف التفاعلات بين البروتينات التي تشكل جوهر mechanoenzymatic الآلية الانشطار الميتوكوندريا. <...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

يود المؤلفون الاعتراف بالتمويل الذي تلقاه من جمعية القلب الأمريكية (SDG12SDG9130039).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
فوسفاتيديل كولين (DOPC)أفانتي القطبية 850375
فوسفاتيديليثانولامين (DOPE)أفانتي القطبية للدهون850725
DGS-NTA (Ni2 + < / sup>)أفانتي القطبية790404
البقري كارديوليبين (CL)أفانتي القطبية الدهون840012
الكلوروفورمأكروس أورجانيكس268320010
الطارد الشحميأفانتي القطبيةالدهون 610023
شبكات البقع السلبية Cu / Rhتيد بيلا79712
أنبوب ميكروفوجبيكمان357448
GTPجينا بيوساينسزNU-1012
GMP-PCPSigma AldrichM3509
لوحةميكروتيتر469949
EDTAAcros Organics40993-0010
Instant Blue Coomassie DyeExpedeonISB1L
HEPESFisher ScientificBP310
BMESigma AldrichM6250
KClFisher ScientificP330
KOHFisher ScientificP250
كلوريد المغنيسيومAcros Organics223211000
4 - 20٪ SDS-PAGE جلBio Rad456-1096
4x Laemmli Loading DyeBio Rad161-0747
HCLFisher ScientificA144S
الملكيت الأخضر CarbinolSigma Aldrich229105
الأمونيوم موليبدات رباعي هيدراتسيجما ألدريتشA7302
فيلم مختبربارافيلمPM-996
يورانيل أسيتاتPolysciences21447
Tecnai T12 100 keV مجهرFEI
Optima MAXBeckman
TLA-55 RotorBeckman
المبردة CentriVap المكثفLabconico
Mastercycler Pro ThermocyclerEppendorf
VersaMax قارئ Microplateالجزيئية
الدهون القلب شرائط الحرارة العلمي الأجهزة

المراجع

  1. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  2. Clinton, R. W., Francy, C. A., Ramachandran, R., Qi, X., Mears, J. A. Dynamin-related Protein 1 Oligomerization in Solution Impairs Functional Interactions with Membrane-anchored Mitochondrial Fission Factor. J Biol Chem. 291 (1), 478-492 (2016).
  3. Chan, D. C. Mitochondrial Fusion and Fission in Mammals. Annual Review of Cell and Dev Biol. 22 (1), 79-99 (2006).
  4. Bui, H. T., Shaw, J. M. Dynamin Assembly Strategies and Adaptor Proteins in Mitochondrial Fission. Curr Biol. 23 (19), R891-R899 (2013).
  5. Elgass, K., Pakay, J., Ryan, M. T., Palmer, C. S. Recent advances into the understanding of mitochondrial fission. Biochim Biophys Acta (BBA) - Mol Cell Res. 1833 (1), 150-161 (2013).
  6. Losón, O. C., Song, Z., Chen, H., Chan, D. C. Fis1, Mff, MiD49, and MiD51 mediate Drp1 recruitment in mitochondrial fission. Mol Biol Cell. 24 (5), 659-667 (2013).
  7. Otera, H., Wang, C., et al. Mff is an essential factor for mitochondrial recruitment of Drp1 during mitochondrial fission in mammalian cells. J Cell Biol. 191 (6), 1141-1158 (2010).
  8. Gandre-Babbe, S., van der Bliek, A. M. The Novel Tail-anchored Membrane Protein Mff Controls Mitochondrial and Peroxisomal Fission in Mammalian Cells. Mol Biol Cell. 19 (6), 2402-2412 (2008).
  9. Koirala, S., Guo, Q., et al. Interchangeable adaptors regulate mitochondrial dynamin assembly for membrane scission. Proc Natl Acad Sci. 110 (15), E1342-E1351 (2013).
  10. Macdonald, P. J., Stepanyants, N., et al. A dimeric equilibrium intermediate nucleates Drp1 reassembly on mitochondrial membranes for fission. Mol Biol Cell. 25 (12), 1905-1915 (2014).
  11. Macdonald, P. J., Francy, C. A., et al. Distinct Splice Variants of Dynamin-related Protein 1 Differentially Utilize Mitochondrial Fission Factor as an Effector of Cooperative GTPase Activity. J Biol Chem. 291 (1), 493-507 (2016).
  12. Bustillo-Zabalbeitia, I., Montessuit, S., Raemy, E., Basañez, G., Terrones, O., Martinou, J. -C. Specific Interaction with Cardiolipin Triggers Functional Activation of Dynamin-Related Protein 1. PLoS ONE. 9 (7), (2014).
  13. Francy, C. A., Alvarez, F. J. D., Zhou, L., Ramachandran, R., Mears, J. A. The Mechanoenzymatic Core of Dynamin-Related Protein 1 Comprises the Minimal Machinery Required for Membrane Constriction. J Biol Chem. 290 (18), 11692-11703 (2015).
  14. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
  15. Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. Rapid preparation of giant unilamellar vesicles. Proc Natl Acad Sci. 93 (21), 11443-11447 (1996).
  16. Klingler, J., Vargas, C., Fiedler, S., Keller, S. Preparation of ready-to-use small unilamellar phospholipid vesicles by ultrasonication with a beaker resonator. Anal Biochem. 477, 10-12 (2015).
  17. Mears, J. A., Hinshaw, J. E. Chapter 13 Visualization of Dynamins. Methods Cell Biol. 88, 237-256 (2008).
  18. Leonard, M., Doo Song, B., Ramachandran, R., Schmid, S. L. Robust Colorimetric Assays for Dynamin's Basal and Stimulated GTPase Activities. Methods Enzymol. 404, 490-503 (2005).
  19. Ingerman, E., Perkins, E. M., et al. Dnm1 forms spirals that are structurally tailored to fit mitochondria. J Cell Biol. 170 (7), 1021-1027 (2005).
  20. Fröhlich, C., Grabiger, S., et al. Structural insights into oligomerization and mitochondrial remodelling of dynamin 1-like protein. EMBO J. 32 (9), 1280-1292 (2013).
  21. James, D. I., Parone, P. A., Mattenberger, Y., Martinou, J. -C. hFis1, a Novel Component of the Mammalian Mitochondrial Fission Machinery. J Biol Chem. 278 (38), 36373-36379 (2003).
  22. Yoon, Y., Krueger, E. W., Oswald, B. J., McNiven, M. A. The Mitochondrial Protein hFis1 Regulates Mitochondrial Fission in Mammalian Cells through an Interaction with the Dynamin-Like Protein DLP1. Mol Cell Biol. 23 (15), 5409-5420 (2003).
  23. Osellame, L. D., Singh, A. P., et al. Cooperative and independent roles of Drp1 adaptors Mff and MiD49/51 in mitochondrial fission. J Cell Sci. 129 (11), 2170-2181 (2016).
  24. Esposito, E. A., Shrout, A. L., Weis, R. M. Template-Directed Self-Assembly Enhances RTK Catalytic Domain Function. J Biomol Screen. 13 (8), 810-816 (2008).
  25. Shrout, A. L., Esposito, E. A., Weis, R. M. Template-directed Assembly of Signaling Proteins: A Novel Drug Screening and Research Tool. Chem Biol Drug Des. 71 (3), 278-281 (2008).
  26. Celia, H., Wilson-Kubalek, E., Milligan, R. A., Teyton, L. Structure and function of a membrane-bound murine MHC class I molecule. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 96 (10), 5634-5639 (1999).
  27. Li, E., Wimley, W. C., Hristova, K. Transmembrane helix dimerization: Beyond the search for sequence motifs. Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (2), 183-193 (2012).
  28. Zhang, F., Crise, B., Su, B., Hou, Y., Rose, J. K., Bothwell, A., Jacobson, K. Lateral diffusion of membrane-spanning and glycosylphosphatidylinositol- linked proteins: toward establishing rules governing the lateral mobility of membrane proteins. J Cell Biol. 115 (1), 75-84 (1991).
  29. Ramadurai, S., Holt, A., Krasnikov, V., van den Bogaart, G., Killian, J. A., Poolman, B. Lateral diffusion of membrane proteins. J Am Chem Soc. 131 (35), 12650-12656 (2009).
  30. Gambin, Y., Reffay, M., et al. Variation of the lateral mobility of transmembrane peptides with hydrophobic mismatch. J Phys Chem. B. 114 (10), 3559-3566 (2010).
  31. Wilson-Kubalek, E. M., Brown, R. E., Celia, H., Milligan, R. A. Lipid nanotubes as substrates for helical crystallization of macromolecules. Proc Natl Acad Sci. 95 (14), 8040-8045 (1998).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

1 GTPase His tag
باستخدام سقالة الليبوزومات لإعادة تفاعلات البروتين البروتين، الدهون القريب في المختبر
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.