مقالة منهجية

جمع Serum- وخالية من تغذية الفأر الجنينية الجذعية المتوسطة مكيفة الخليوي لنهج خالية من خلية

DOI:

10.3791/55035

⸱

يناير 8, 2017

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology and Smart-aging Convergence Research Center, College of Medicine, Yeungnam University, 2Physiology and Experimental Medicine Program, The Hospital for Sick Children Research Institute, 3Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر هذا البروتوكول طريقة لجمع الخلايا الجذعية الجنينية الماوس (مسك) المتوسطة -conditioned (مسك-CM) المستمدة من مصل الدم (مصل الجنين البقري، FBS) - والمغذية (الخلايا الليفية الجنينية الماوس، MEFS) شروط خالية للخلية نهج خالية. قد تكون قابلة للتطبيق لعلاج الشيخوخة والأمراض المرتبطة بالشيخوخة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فتحت قدرة الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs) والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) على توليد أنواع مختلفة من الخلايا آفاقا جديدة في مجال الطب التجديدي. ومع ذلك, على الرغم من فوائدها, كانت إمكانات الأورام من الخلايا الجذعية الكؤوعية وiPSCs منذ فترة طويلة عائقا أمام التطبيقات السريرية. ومن المثير للاهتمام, لقد ثبت أن الخلايا الجذعية الجذعية تنتج العديد من العوامل القابلة للذوبان التي يمكن أن تعزز تجديد الأنسجة وتأخير الشيخوخة الخلوية, مما يشير إلى أنه يمكن أيضا استخدام الخلايا الجذعية الجذعية والخلايا الجذعية والخلايا الجذعية الدماغية كطريقة تدخل خالية من الخلايا. لذلك ، فإن طريقة حصاد الخلايا الجذعية الجنينية للفأر (mESC) مع الحد الأدنى من التلوث لمكونات المصل (مصل الأبقار الجنينية ، FBS) والخلايا المغذية (الخلايا الليفية الجنينية ، MEFs) مطلوبة بشدة. هنا ، توضح الدراسة الحالية طريقة محسنة لجمع mESC-CM في ظل ظروف خالية من المصل والمغذي ولتوصيف mESC-CM باستخدام قراءات متعددة مرتبطة بالشيخوخة. سيوفر هذا البروتوكول طريقة لجمع العوامل الإفرازية النقية الخاصة ب mESC دون تلوث المصل والمغذي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والهدف من هذا البروتوكول هو جمع الماوس الجنينية الخلايا الجذعية (مسك) -conditioned المتوسطة (مسك-CM) من شروط الثقافة serum- وخالية من تغذية ولتوصيف الوظائف البيولوجية.

بشكل عام، والخلايا الجذعية الجنينية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية) لديها إمكانات كبيرة للطب التجديدي والعلاج بالخلايا نظرا لتعدد القدرات والقدرة على التجديد الذاتي 1-3. ومع ذلك، فإن زرع المباشر للخلايا الجذعية لديها العديد من القيود، مثل الرفض المناعي، وتشكيل الورم 4،5. ولذلك، فإن نهج خالية من الخلايا قد يقدم استراتيجية علاجية بديلة للطب التجديدي والتدخلات الشيخوخة 6،7.

وينظر الشيخوخة باعتبارها نظيره الخلوي إلى شيخوخة الأنسجة والأعضاء، وتتميز حالة دائمة من اعتقال النمو، علم وظائف الأعضاء خلية تغير، والسلوكيات. الشيخوخة هي عامل الخطر الرئيسي للأمراض السائدة بما في ذلك السرطان وأمراض القلب والأوعية الدموية، رYPE 2 من داء السكري، والتنكس العصبي 8. واحدة من خصائص واضحة من الشيخوخة هو انخفاض في القدرة على التجدد الأنسجة، الذي ينجم عن شيخوخة الخلايا الجذعية والإرهاق 9. وقد أظهرت العديد من الدراسات الهامة الجزيئات الدوائية، مثل rapamycin 9، ريسفيراترول 10، والميتفورمين 11، والعوامل النظامية التي تنتقل عن طريق الدم، وهي GDF11 12، التي لديها القدرة على تأخير الشيخوخة باستمرار وتمديد فترة الحياة.

في هذه الدراسة، وقد تم حصادها مسك-CM دون المصل (الجنين المصل البقري، FBS) والتغذية (الماوس الجنينية الخلايا الليفية، MEFS) طبقات استبعاد التلوث من العوامل في الدم وعوامل إفرازية من MEFS. هذه الشروط السماح لCM serum- وخالية من التغذية التي بالتالي تمكين تحديد دقيق للعوامل إفرازية مسك محددة.

هذا البروتوكول المقترح كفاءة عالية، وتكلفة نسبيا فعالة، وسهلةليشغل. توفر هذه التقنية نظرة ثاقبة لتوصيف العوامل القابلة للذوبان المستمدة مسك التي يمكن أن توسط له تأثير مضاد للشيخوخة، والتي يمكن استخدامها لتطوير نهج علاجي آمن ويحتمل أن تكون مفيدة خالية من الخلايا تجاه التدخلات من أجل المرتبط بالشيخوخة الأمراض وغيرها من التجدد العلاجات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: التخطيطي لserum- وبروتوكول جمع سم الحرة المغذية هو مبين في الشكل 1.

1. المواد (إعداد MEFS والمتوسطة، لوحات، وحلول)

  1. إعداد 500 مل من المتوسط ​​لثقافة MEFS. تكملة Dulbecco لتعديل المتوسطة النسر (DMEM) مع 10٪ FBS (ESC الجودة) و 50 وحدة / مل البنسلين، و 50 ملغ / مل الستربتومايسين.
  2. عزل MEFS من الأجنة بعد بروتوكول روتيني إنشاء 13 والمحافظة عليها في المتوسط MEF.
  3. إعداد 500 مل من المتوسط ​​لثقافة mESCs. وتستكمل DMEM مع 15٪ FBS و 2 مم L-الجلوتامين، و 100 ميكرومتر الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA)، و 100 ميكرومتر β-المركابتويثانول، و 100 وحدة / مل عامل مثبط سرطان الدم (ليف) و 50 وحدة / البنسلين مل، و 50 ملغ / مل الستربتومايسين.
  4. إعداد لوحات مهيلم (5 لوحات مهيلم / 1 لوحة مسك) من خلال طلاء أطباق زراعة الخلايا 10 سم مع 5 مل من 0.1٪ محلول الجيلاتين. احتضان لمدة 10 دقيقة على الأقل بدرجة حرارة الغرفة.
  5. إعداد 500 مل من الدم انخفض متوسط ​​لحالة المصل خالية من mESCs. الملحق انخفاض المصل وسائل الإعلام مع 1.2 غرام من بيكربونات الصوديوم (7.0 درجة الحموضة). من خلال تصفية 0.2 ميكرومتر زجاجة أعلى التصفية.
  6. إعداد المرتبطة الشيخوخة β غالاكتوزيداز (SA β-غال) حل تلطيخ للكشف عن خلايا هرمة: 1 ملغ / مل X-غال (المنحلة في ثنائي ميثيل الفورماميد، DMF)، 40 ملم حمض الستريك / العازلة فوسفات الصوديوم (6.0 درجة الحموضة) و 5 ملي فيري سيانيد البوتاسيوم، 5 ملي فيرو سيانيد البوتاسيوم، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 2 ملي MgCl 2 14.
    تنبيه: (الخطرة) DMF هو الحل السامة والمسببة للتآكل. ارتداء ملابس الوقاية الشخصية (على سبيل المثال، النتريل قفازات اللاتكس أو، معطف المختبر، ونظارات واقية) عند التعامل مع الحل. استخدام غطاء الدخان.
  7. إعداد 500 مل من المتوسط ​​لثقافة الخلايا الليفية الجلدية الإنسان (HDFs، NHDF-AD-دير-الخلايا الليفية). تكملة DMEM مع FBS 10٪ و 100 وحدة / مل البنسلين و 100 ملغ / مل الستربتومايسين.
jove_title "> 2. الثقافة من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس (الشكل 1A و 2A)

ملاحظة: القيام بجميع الخطوات في ثقافة خلية غطاء السلامة البيولوجية.

  1. علاج MEFS مع 20 مل من المتوسط ​​MEF التي تحتوي على 10 ميكروغرام / مل من ميتوميسين مئوية في 15 سم طبق ثقافة الخلية. احتضان لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  2. نضح في المتوسط ​​من MEFS. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات. إضافة 3 مل من التربسين-EDTA (TE، 1X)، واحتضان لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. بعد 3 دقائق، تحييد TE مع 6 مل من المتوسط ​​MEF وأجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 300 × ز.
  3. resuspend في 5 مل من المتوسط ​​MEF. تحديد عدد الخلايا في تعليق الخلية الناتجة باستخدام تلطيخ التريبان الأزرق وعدادة الكريات. MEFS لوحة المعطل (تغذية) في مناطق ذات كثافة من 2 × 10 6 خلايا في 10 سم طبق ثقافة خلية في المتوسط MEF. احتضان لمدة 24 ساعة على 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  4. استبدال المتوسطة MEF مع مسك المتوسطة 24 ساعة بعد الطلاء وحدة التغذية (علىاليوم القادم).
  5. لوحة للmESCs (G4 F1 هجين خلية ES) في مناطق ذات كثافة من 2 × 10 6 الخلايا على وحدة التغذية مع مسك المتوسطة. احتضان لمدة 48 ساعة على 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
    ملاحظة: تأثير مضاد للشيخوخة مسك-CM هي على الأرجح أقوى عندما يتم استخدام عدد أقل مرور mESCs 15-17. حصلنا على خط G4 مسك من الدكتور اندراس ناجي في معهد Lunenfeld-تانينباوم بحوث، مستشفى جبل سيناء، 25 شارع أوردي، تورنتو، ON، M5T 3H7، كندا.
  6. إبقاء الخلايا في مناطق ذات كثافة عالية نسبيا والمرور في 70-80٪ حالة شبه متموجة. استبدال المتوسطة مع مسك الطازجة يوميا.

3. جمع من Serum- وخالية من الطاعم مشروطة المتوسطة (الشكل 1B و 2B)

ملاحظة: القيام بجميع الخطوات في ثقافة خلية غطاء السلامة البيولوجية.

  1. شطف لوحة مسك مع 5 مل من برنامج تلفزيوني. إضافة 1 مل من TE (2.5x و)، واحتضان لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. بعد 3 دقائق، تحييد TE مع 2 مل من مسك جامعة المدينة العالميةم وأجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 300 × ز.
  2. resuspend في 5 مل من مسك المتوسطة ولوحة 1 مل في كل طبق ثقافة المغلفة الجيلاتين (5 لوحات مهيلم / 1 لوحة مسك) في مسك المتوسطة. يتم التوصل إلى الثقافة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 حتى 80-85٪ confluency.
  3. غسل mESCs مع ما يكفي من برنامج تلفزيوني لتغطية الخلايا (8 مل لكل 10 سم لوحة) لمدة 10 دقيقة لكل غسل، أي ما مجموعه ثلاثة يغسل. احتضان في انخفاض المصل متوسطة لمدة 24 ساعة على 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
    ملاحظة: الخطوة غسل مهمة لمنع التلوث FBS. من المهم أن يتبع فترة حضانة 18،19.
  4. جمع مسك-CM إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 2500 ز س. جمع الحل طاف (CM) بعد الطرد المركزي. من خلال تصفية 0.2 ميكرومتر زجاجة أعلى التصفية.

4. آثار الفأر الجنينية الجذعية مكيفة خلية المتوسطة (مسك-CM)

ملاحظة: آثار مسك-CM تم التصديق عليها من قبل العديد من الطرق، مثلSA فحص β-غال، تحليل دورة الخلية، وQRT-PCR.

  1. SA β-غال الفحص (الشكل 3A)
    1. HDFs البذور في مناطق ذات كثافة من 2 × 10 4 خلايا لكل بئر في 6 لوحات جيدا في HDF المتوسطة. احتضان ليلا 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
    2. بعد الحضانة بين عشية وضحاها، نصف نبذ من المتوسط ​​HDF وإضافة مسك-CM والسيطرة المتوسطة. احتضان لمدة 72 ساعة على 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. مشتق المتوسطة التحكم من المصل خالية المتوسطة (خفضت المصل وسائل الإعلام) في طبق المغلفة الجيلاتين في غياب mESCs.
    3. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني كافية لتغطية الخلايا (2 مل لكل لوحة 6 جيدا) لمدة 30 ثانية في غسل، أي ما مجموعه اثنين من يغسل. إضافة 3.7٪ امتصاص العرق (PFA) لتثبيت. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      تنبيه: (الخطرة) لامتصاص العرق هو الحل السامة والمسببة للتآكل. ارتداء ملابس الوقاية الشخصية (على سبيل المثال، النتريل قفازات اللاتكس أو، معطف المختبر، ونظارات واقية) عند التعامل مع الحل.استخدام غطاء الدخان.
    4. نضح الحل التثبيت. غسل الخلايا الثابتة مع برنامج تلفزيوني مرتين، كما هو موضح في الخطوة 4.1.3.
    5. إضافة SA حل β-غال تلطيخ (1-2 مل لكل بئر في لوحة 6 جيدا). احتضان لمدة 17.5 ساعة على 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: لا ينبغي المحتضنة وفي حاضنة CO 2.
    6. نضح SA β-غال حل تلطيخ وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني مرتين، كما هو موضح في الخطوة 4.1.3.
    7. إضافة الحل يوزين لمكافحة تلطيخ. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني مرتين، كما هو موضح في الخطوة 4.1.3.
    8. خلايا الصورة في التكبير 100X باستخدام المجهر الضوئي والتقاط الصور باستخدام الكاميرا الرقمية المرفقة لتحليلها لاحقا.
      ملاحظة: العدد الكلي للخلايا يمكن الاعتماد بطريقة عمياء ويمكن حساب النسبة المئوية للSA β-غال الخلايا الزرقاء إيجابية.
  2. خلية تحليل دورة (الشكل 3B)
    1. HDFs البذور في مناطق ذات كثافة من8 × 10 4 خلايا لكل بئر في طبق خلية ثقافة 6 سم في HDF المتوسطة. احتضان ليلا 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
    2. بعد الحضانة بين عشية وضحاها، نصف نبذ من المتوسط ​​HDF وإضافة مسك-CM والسيطرة المتوسطة. احتضان لمدة 24 ساعة على 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
    3. يعرض للتريبسين الخلايا، كخطوة وصفها في 3.1، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 × ز. غسل الخلايا مع حل PBS الباردة (PBS مع 0.5 ملي CaCl 2 و 2٪ FBS، 1 مل لكل أنبوب 1.5 مل) مرتين وأجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 2500 ز س. resuspend في 100 ميكرولتر من محلول برنامج تلفزيوني الباردة.
    4. إصلاح الخلايا عن طريق إسقاط 200 ميكرولتر من الايثانول البارد في حين vortexing ل. تخزين عند 4 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 1 ساعة.
    5. غسل الخلايا مع الحل برنامج تلفزيوني الباردة مرتين، كما هو موضح في الخطوة 4.2.3.
    6. Resuspend الخلايا في 250 ميكرولتر من العازلة سيترات الصوديوم (1.12٪، ودرجة الحموضة 8.5) تحتوي على 50 ميكروغرام / مل ريبونوكلياز. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    7. إضافة 250 ميكرولتر من سيترات الصوديومالعازلة التي تحتوي على 50 ميكروغرام / مل يوديد propidium. احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    8. قياس الخلايا 10،000 في كل عينة باستخدام التدفق الخلوي 20.
  3. QRT-PCR (الشكل 3C)
    1. HDFs البذور وإضافة مسك-CM، كما هو موضح في الخطوات 4.1.1 و4.1.2.
    2. عزل الحمض النووي الريبي مجموع من HDFs باستخدام عدة استخراج الحمض النووي الريبي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. قياس الحمض النووي الريبي مجموع المستخرج باستخدام مطياف 21.
    3. توليف [كدنا بإضافة 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع إلى 20 ميكرولتر من خليط التفاعل التي تحتوي على جزئية (DT) الاشعال و M-MLV الناسخ العكسي، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة 20.
    4. قياس التضخيم من [كدنا مع الوقت الحقيقي آلة PCR، وذلك باستخدام مزيج الرئيسي الخضراء PCR والاشعال جينية معينة (الملحق الجدول 1). تطبيع البيانات مع التعبير GAPDH. استخدام بروتوكول PCR التالية: دي الأوليnaturation لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة 95 درجة مئوية؛ 45 دورات لمدة 15 ثانية في 95 درجة مئوية، و 20 ثانية في 55 درجة مئوية، و 35 ثانية في 72 درجة مئوية. والمرحلة منحنى ذوبان لمدة 15 ثانية في 95 درجة مئوية، 1 دقيقة في 60 درجة مئوية، و 30 ثانية في 95 درجة مئوية، و 5 ثانية في 60 ° C 15.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في الأصل، يتم الاحتفاظ mESCs على وحدة التغذية MEF في المتوسط مسك مع FBS وغيرها من الملاحق (الشكلان 1A و 2A). وقد تم جمع CM من mESCs في انخفاض المصل وسائل الإعلام دون طبقة وحدة التغذية، FBS، أو غيرها من الملاحق (أرقام 1B و 2B). هذا الشرط ثقافة تسمح لنا لجمع مسك محددة المتوسطة مكيفة دون تلوث محتمل من العوامل من وحدة التغذية، FBS، أو غيرها من الملاحق. جمعت المتوسطة السيطرة في ظل الظرو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لنجاح جمع serum- ومسك-CM خالية المغذية، ينبغي أن تؤخذ في الاقتراحات التالية بعين الاعتبار. العامل الأكثر أهمية هو استخدام mESCs مرور وقت مبكر لجمع مسك-CM. سابقا، وقد تبين أن مرور وقت مبكر مسك-CM له تأثيرات مضادة للشيخوخة أفضل مقارنة mESCs مرور في وقت متأخر. وقد تم الإبلاغ عن عدد مرور mESCs أن تؤثر على إمكانية تطورهم 16 وتعدد القدرات 17.

بينما هناك حاجة إلى إجراء بحوث إضافية لتحليل العوامل ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا البحث من قبل برنامج العلوم الاساسية بحوث (2013R1A1A2060930) وبرنامج مركز الأبحاث الطبية (2015R1A5A2009124) من خلال مؤسسة البحوث الوطنية لكوريا (جبهة الخلاص الوطني)، بتمويل من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات، والتخطيط المستقبلي. ويدعم هذا البحث أيضا قبل البدء غرانت التشغيل من مستشفى الأطفال المرضى (هونج كونج سونغ). ونود أن نشكر لورا BARWELL وسارة شبيبة كيم لمساعدة ممتازة في تحرير هذه المخطوطة والدكتور اندراس ناجي عن توفير خط G4 مسك.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
DMEMInvitrogen# 11960-044
FBSInvitrogen# 3004433320٪ ، جودة الخلايا ES
البنسلين والستربتومايسينInvitrogen# 1514050 وحدة / مل البنسلين و 50 & nbsp ؛ ملغ / مل ستربتومايسين
L-glutamineInvitrogen# 250302   ؛ ميم
الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA)Invitrogen#11140100  ومايكرو. M
β-mercaptoethanol سيجما#M3148100  ومايكرو.
M عامل مثبط لسرطان الدم Millipore#ESG1107100 وحدة / مل
OPTI-MEMInvitrogen# 22600
X-gal   ؛سيجما#B42521 مجم / مل
بارافورمالدهيد (PFA)سيجماP61483.70٪
ثنائي ميثيل فورماميد (DMF)سيجما#D4551
فيريسيانيد البوتاسيومألدريتش# 4559465 ملي مولار
فيروسيانيد البوتاسيومألدريتش# 4559895 ملي
كلوريد الصوديومسيجما#S7653150 ملي
MgCl2Sigma#M23932 ملي
ميتومايسين سيسيجما#M428710  ومايكرو. جم / مل
يوديد البروبيديوم   ؛سيجما#P417050  ومايكرو. ز / مل
TRIzolAmbion# 15596018
M-MLV عكس النسخ - tasePromega#M170B
Power SYBR الأخضر PCR ماستر ميكس   ؛الأنظمة الحيوية التطبيقية# 4367659
HDFs ، NHDF-Ad-Der-Fibroblast   ؛LONZA#CC-2511
مرشح أعلى زجاجةCorning# 4305130.2 & م

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  2. Lavasani, M., et al. Muscle-derived stem/progenitor cell dysfunction limits healthspan and lifespan in a murine progeria model. Nat Commun. 3, 608(2012).
  3. Woo, D. H., et al. Direct and indirect contribution of human embryonic stem cell-derived hepatocyte-like cells to liver repair in mice. Gastroenterology. 142, 602-611 (2012).
  4. Lee, A. S., Tang, C., Rao, M. S., Weissman, I. L., Wu, J. C. Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies. Nat Med. 19, 998-1004 (2013).
  5. Moon, S. H., et al. A system for treating ischemic disease using human embryonic stem cell-derived endothelial cells without direct incorporation. Biomaterials. 32, 6445-6455 (2011).
  6. Tongers, J., Roncalli, J. G., Losordo, D. W. Therapeutic angiogenesis for critical limb ischemia: microvascular therapies coming of age. Circulation. 118, 9-16 (2008).
  7. Lazarous, D. F., et al. Basic fibroblast growth factor in patients with intermittent claudication: results of a phase I trial. J Am Coll Cardiol. 36, 1239-1244 (2000).
  8. Adams, P. D. Healing and hurting: molecular mechanisms, functions, and pathologies of cellular senescence. Mol Cell. 36, 2-14 (2009).
  9. Harrison, D. E., et al. Rapamycin fed late in life extends lifespan in genetically heterogeneous mice. Nature. 460, 392-395 (2009).
  10. Baur, J. A., Ungvari, Z., Minor, R. K., Le Couteur, D. G., de Cabo, R. Are sirtuins viable targets for improving healthspan and lifespan. Nat Rev Drug Discov. 11, 443-461 (2012).
  11. Martin-Montalvo, A., et al. Metformin improves healthspan and lifespan in mice. Nat Commun. 4, 2192(2013).
  12. Loffredo, F. S., et al. Growth differentiation factor 11 is a circulating factor that reverses age-related cardiac hypertrophy. Cell. 153, 828-839 (2013).
  13. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. , (2012).
  14. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).
  15. Bae, Y. U., Choi, J. H., Nagy, A., Sung, H. K., Kim, J. R. Antisenescence effect of mouse embryonic stem cell conditioned medium through a PDGF/FGF pathway. FASEB J. 30, 1276-1286 (2016).
  16. Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 8424-8428 (1993).
  17. Li, X. Y., et al. Passage number affects the pluripotency of mouse embryonic stem cells as judged by tetraploid embryo aggregation. Cell Tissue Res. 327, 607-614 (2007).
  18. Mbeunkui, F., Fodstad, O., Pannell, L. K. Secretory protein enrichment and analysis: an optimized approach applied on cancer cell lines using 2D LC-MS/MS. J Proteome Res. 5, 899-906 (2006).
  19. Makridakis, M., Vlahou, A. Secretome proteomics for discovery of cancer biomarkers. J Proteomics. 73, 2291-2305 (2010).
  20. Kim, K. S., et al. Regulation of replicative senescence by insulin-like growth factor-binding protein 3 in human umbilical vein endothelial cells. Aging Cell. 6, 535-545 (2007).
  21. Kim, K. S., et al. Induction of cellular senescence by insulin-like growth factor binding protein-5 through a p53-dependent mechanism. Mol Biol Cell. 18, 4543-4552 (2007).
  22. Eiselleova, L., et al. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int J Dev Biol. 52, 353-363 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة