مقالة منهجية

استخدام الوحيدات أحادي الطبقة الفحص لتقييم البلعمة بوساطة مستقبلات Fcγ

19.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/55039

⸱

يناير 2, 2017

 , 
1Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 2Centre for Innovation, Canadian Blood Services

في هذه المقالة

ملخص

مقايسة أحادية الطبقة أحادية الخلية (MMA) هي اختبار في المختبر يستخدم الخلايا الوحيدة الأولية المعزولة التي تم الحصول عليها من الدم الكامل المحيطي للثدييات لتقييم البلعمة بوساطة مستقبلات Fcγ (FcγR).

الملخص

على الرغم من أنه تم تطويره في الأصل للتنبؤ بنتائج نقل الدم غير المتوافق مع المصل ، إلا أن مقايسة أحادية الطبقة أحادية الخلية (MMA) هي اختبار متعدد الاستخدامات في المختبر يمكن تعديله لفحص جوانب مختلفة من البلعمة بوساطة الأجسام المضادة ومستقبلات Fcγ (FcγR) في كل من البيئات البحثية والسريرية. يستخدم الاختبار الخلايا الوحيدة الملتصقة من خلايا الدم المحيطية أحادية النواة المعزولة من الدم الكامل للثدييات. تم وصف MMA للاستخدام في كل من التحقيقات البشرية والفئران. تعبر هذه الخلايا الوحيدة عن FcγRs (على سبيل المثال ، FcγRI و FcγRIA و FcγRIIB و FcγRIIIA) التي تشارك في الاستجابات المناعية. يستغل MMA آلية التفاعلات بوساطة FcγR ، البلعمة على وجه الخصوص ، حيث تلتصق خلايا الدم الحمراء الحساسة بالأجسام المضادة (RBCs) و / أو تنشطها و / أو تنشطها FcγRs ثم يتم البلعمة لاحقا بواسطة الخلايا الوحيدة. في الجسم الحي ، تقوم البلاعم النسيجية الموجودة في الطحال والكبد بشكل أساسي بإجراء البلعمة بوساطة FcγR لكرات الدم الحمراء المضادة للأجسام المضادة ، مما يتسبب في انحلال الدم خارج الأوعية الدموية. من خلال تقييم مستوى البلعمة باستخدام MMA ، يمكن التحقيق في جوانب مختلفة من العملية بوساطة FcγR في الجسم الحي. تتضمن بعض تطبيقات MMA التنبؤ بالأهمية السريرية للأجسام المضادة الذاتية أو الذاتية في بيئة نقل الدم ، وتقييم الأدوية المرشحة التي تعزز أو تمنع البلعمة ، والجمع بين الفحص والفحص المجهري الفلوري أو النشاف المناعي الغربي التقليدي للتحقيق في تأثيرات الإشارات النهائية للأدوية أو الأجسام المضادة التي تشارك FcγR. تشمل بعض القيود صعوبة هذه التقنية ، والتي تستغرق يوما كاملا من البداية إلى النهاية ، ومتطلبات الموافقة على أخلاقيات البحث من أجل العمل مع دم الثدييات. ومع ذلك ، من خلال الاجتهاد والتدريب الكافي ، يمكن الحصول على نتائج MMA في غضون 24 ساعة من وقت الدوران.

المقدمة

مقايسة أحادية الطبقة أحادية الخلية (MMA) هي اختبار في المختبر تم تطويره في الأصل للتنبؤ بشكل أفضل بنتائج نقل الدم في المرضى الذين يعانون من الأجسام المضادة الذاتية أو الخيفية لخلايا الدم الحمراء (RBCs) 1-5. من خلال تقييم تأثير الأجسام المضادة لكرات الدم الحمراء في التوسط في البلعمة بوساطة مستقبلات Fcγ (FcγR) باستخدام هذا الفحص في المختبر ، من الممكن التنبؤ بالنتيجة السريرية في الجسم الحي. في الواقع ، تم استخدام MMA بنجاح لتجنب التدمير المناعي لكرات الدم الحمراء المرتبطة بالأجسام المضادة ، على الرغم من نقل الدم غير المتوافق مع المصل5. يتضمن الإجراء النموذجي قبل نقل الدم لاختبار التوافق ، والذي يطلق عليه أيضا المطابقة المتبادلة ، طرقا مصلية تشمل كتابة دم المريض بحثا عن مستضدات ABO و Rh وفحص وجود الأجسام المضادة لكرات الدم الحمراء في المريض6. يتم اختيار الدم المطابق ل ABO / Rh ، وإذا كانت الأجسام المضادة موجودة ، يتم إجراء محاولة للتعرف عليها بحيث يمكن اختيار الدم لنقل الدم لتجنب هذه المستضدات. تحدث نتيجة التطابق المتبادل المثالية عندما يكون دم المتبرع متوافقا مصلية مع دم المريض ، مما يقلل من خطر انحلال الدم بعد نقلالدم 7. ومع ذلك ، فإن هذا النظام يقصر بالنسبة للمجموعة الصغيرة من المرضى الذين أصبحوا محصنين عند نقل الدم أو الحمل المتكرر. ينتج هؤلاء المرضى أجساما مضادة ضد مستضدات كرات الدم الحمراء المحددة. ينتج البعض أجساما مضادة للمستضدات ذات التردد العالي جدا في عامة السكان ، وبالتالي يصبح من الصعب تدريجيا مطابقة8،9. إضافة إلى التعقيد ، ليست كل الأجسام المضادة ذات أهمية سريريا. بمعنى آخر ، فإن ارتباط الجسم المضاد الخيفي بكرات الدم الحمراء التي تم اكتشافها بواسطة اختبار المصل لا يؤدي بالضرورة إلى انحلال الدم عند نقل الدم الإيجابي وغير المتوافق. تم تطوير MMA في الأصل لتقييم الأهمية السريرية المحتملة للدم غير المتوافق مصلية في بيئة نقلالدم 1-5.

نظرا لأنه من المعروف أن انحلال الدم خارج الأوعية الدموية لكرات الدم الحمراء المرتبطة بالأجسام المضادة يتم بوساطته بواسطة نظام البلعمة أحادية النواة ، يتم استخدام الخلايا الوحيدة / الضامة الأولية في تطوير المقايسات التشخيصية. تم نشر الاختبار الأول لدراسة تفاعل الخلايا الوحيدة وكرات الدم الحمراء والأجسام المضادة في عام 1975 ، لكن الظروف دون المستوى الأمثل المستخدمة أدت فقط إلى تكوين وردة (ارتباط كرات الدم الحمراء بمحيط الخلية الوحيدة) ، ولم يلاحظ أي بلعمة10. تم إجراء تعديلات كبيرة على الفحص من قبل عدة مجموعات ، مما أدى إلى اختبار يمكن من خلاله ربط مستوى البلعمة لكرات الدم الحمراء المرتبطة بالأجسام المضادة بالنتيجة السريرية لانحلال الدم1-5. في الآونة الأخيرة ، تم فحص ظروف التخزين المثلى للعينات السريرية ومزيد من التحسين لظروف الفحص لتعزيز فائدة المباراة المتبادلة السريرية MMA باستخدام عينات المرضى الذاتية11.

< p class = 'jove_content'>تم استخدام ثلاث تقنيات تشخيصية أخرى بالإضافة إلى MMA في التنبؤ بنتائج نقل الدم: اختبار إطلاق 51Cr ، واختبار الوردة ، واختبار التلألؤ الكيميائي (CLT). في اختبار إطلاق 51Cr ، يتم حقن المريض ب 51كرات الدم الحمراء المانحة المسماة Cr ، ويتم مراقبة عمر النصف لكرات الدم الحمراء المصنفة وهي تنبؤية بالبقاء على قيد الحياة بعد نقل الدم أو التصفية12،13. نظرا لأن هذه الطريقة تستخدم مواد مشعة ، نادرا ما يتم إجراؤها بعد الآن. يتضمن اختبار الوردة خلط واحتضان الخلايا الوحيدة مع كرات الدم الحمراء وتحديد مستوى تكوين الوردة (بدون البلعمة)14. تتضمن الأهمية السريرية للأجسام المضادة في الجسم الحي البلعمة النشطة بواسطة البلاعم الموجودة في الطحال و / أو الكبد. وبالتالي ، فإن هذه الطريقة لا توفر قراءة ذات صلة بالبلعمة. يستخدم CLT اللومينول لمراقبة الانفجار التأكسدي أثناء البلعمة أحادية الخلية لكرات الدم الحمراء ، حيث يتألق اللومينول باللون الأزرق عند تأكسده في البلعمة15. هذه الطريقة جيدة ، لكن التلوث بالعدلات يمكن أن يربك القراءة. تم إجراء مقارنات متوازية لتقييم الحساسية والتطبيق العملي وقابلية التكاثر للطرق الأربع المتاحة ، وتم تصنيف كل من CLT و MMA في مرتبة16. ومع ذلك ، فقد تم استخدام CLT بشكل أساسي في تقييم مرض انحلال الدم للجنين وحديثي الولادة (HDFN) ، وقد يضر الرقم الهيدروجيني الأمثل للفحص البالغ 8.0 بمستوى البلعمة11.

بالإضافة إلى فائدته التشخيصية والسريرية ، تم تعديل MMA لأغراض بحثية أخرى. في الواقع ، لا يمكن أن يكون MMA بمثابة اختبار وظيفي لمعالجة التناقضات بين علم الأمصال والبيولوجيا فحسب ، بل تم استخدامه أيضا للتحقيق بأثر رجعي في سبب انحلال الدم بعد العلاج بالغلوبولين المناعي الوريدي (IVIG)17. كما تم استخدامه لفحص بنية وظيفة المثبطات الكيميائية للبلعمة بوساطة FcγR18-20 ولدراسة الإشارات النهائية للبلعمة بوساطة FcγR21. في مختبرنا ، بالإضافة إلى استخدام MMA البشري ، نقوم بتطوير MMA للفئران باستخدام الخلايا أحادية النواة للدم المحيطي للفأر (PBMCs) وكرات الدم الحمراء الذاتية. الأساس المنطقي هو فحص الأجسام المضادة التي يمكن أن تحفز البلعمة بوساطة FcγR كوسيط لتطوير نموذج فأر فقر الدم الانحلالي المناعي الذاتي في الجسم الحي (AIHA) (بيانات غير منشورة). تركز التعديلات المختلفة على جوانب مختلفة من الجسم المضاد IgG وتفاعل FcγR الذي يحفز البلعمة.

البروتوكول

الحصول على موافقة لاستخدام العينات البشرية من قبل المجلس / مجلس المراجعة المؤسسية أخلاقيات البحث، والحصول على موافقة موقعة من جميع الجهات المانحة الإنسان. مجلس العمل المتحد ويمكن أيضا أن يقوم باستخدام PBMCs الماوس بطريقة مماثلة لفحص البشري، بعد موافقة أخلاقيات استخدام الحيوانات. مجلس العمل المتحد تستخدم تقنيات زراعة الأنسجة العقيم.

ملاحظة: انظر الشكل 1.

ملاحظة: على الرغم من أننا نوصي استخدام الاحتواء البيولوجي مجلس الوزراء مستوى 2 خلال فحص للحفاظ على تقنية العقيم، كأسلوب ليست سوى "على المدى القصير" طريقة والثقافة، وليس هناك وقت حقا ما يكفي للبكتيريا لتلويث الفحص. ولذلك، إذا لم يكن موجودا الاحتواء البيولوجي مجلس الوزراء مستوى 2، بدلا من شراء واحدة فقط لهذا الفحص، يمكن إجراء فحص خارج مجلس الوزراء الاحتواء البيولوجي، على مقاعد البدلاء مفتوحة. استخدام الحاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2، ومع ذلك، ليس خيارا، ويجب أن تستخدم لالنتائج المثلى.

1. الدم المحيطي وحيدات النوى عزل الخلايا

  1. الحصول على الدم الكامل البشري من متبرع سليم أو المريض عن طريق بزل الوريد باستخدام vacutainers التي تحتوي على حمض سترات الدكستروز (ACD) تخثر (الأصفر أعلى أنابيب).
    ملاحظة: الدم كله يمكن تخزينها في حوار التعاون الآسيوي في درجة حرارة الغرفة (18-22 درجة مئوية) لمدة تصل إلى 36 ساعة قبل الانتقال إلى الخطوة التالية (11). عادة، 1-2 10 مل أنابيب vacutainer من الدم الكامل كافية للفحص.
  2. تمييع الدم الكامل 1: 1 ت / ت في حارة كاملة المتوسطة RPMI (RPMI-1640 تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني، 20 ملي HEPES، و 0.01 ملغ / مل الجنتاميسين).
  3. عزل الخلايا الطرفية وحيدة النواة في الدم (PBMCs) من الدم الكامل المخفف باستخدام الكثافة الطرد المركزي التدرج، على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة (انظر قائمة من المواد). طبقة من الدم المخفف ببطء شديد على مدى التدرج الكثافة (درجة حرارة لدرجة حرارة الغرفة، 18-22 درجة مئوية).
    ملاحظة: تقليل كمية للانترنتنانوغرام في واجهة لفصل الأمثل من الدم عن طريق طبقات بعناية الخليط الدم بطريقة قطرة قطرة أو باستخدام ماصة.
    1. السماح للخليط الدم إلى طبقة ببطء فوق الجزء العلوي من التدرج الكثافة عن طريق وضع طرف الماصة على مقربة من التدرج الكثافة ومن خلال تمكين خليط الدم لتشغيل أسفل الجانب من الأنبوب ببطء شديد.
    2. اعتمادا على حجم التجربة، طبقة 10 مل من خليط الدم على رأس 3 مل من درجة الكثافة (في أنبوب 15 مل) أو طبقة 35 مل من خليط الدم على رأس 15 مل من درجة الكثافة (في 50 مل أنبوب). عادة، 10 مل من الدم الكامل ينتج 10 ملايين PBMCs، مع بعض الاختلاف المانحة إلى الجهات المانحة.
      ملاحظة: من المهم جدا أن يكون هناك أي اختلاط الخليط الدم مع التدرج الكثافة. يجب أن طبقة الخليط الدم خلال التدرج كثافة وترتفع ببطء حتى كل الدم على أعلى درجة الكثافة.
    3. أجهزة الطرد المركزي الخليط الطبقات في 700 x ج لمدة 30 دقيقة دون فرامل. والطرد المركزييجب فصل خليط ifuged إلى 5 طبقات (من الأعلى إلى الأسفل): البلازما، ومعطف بافي (التي تحتوي على PBMCs)، كثافة المواد التدرج، المحببة، وكرات الدم الحمراء.
    4. إزالة والتخلص من غالبية البلازما واسترداد بعناية محتوى معطف الشهباء (PBMC) في أنبوب 15 مل جديد باستخدام ماصة باستور ولمبة الشفط.
      ملاحظة: إزالة طبقة معطف الشهباء يتم ذلك على نحو فعال من خلال تطبيق الشفط على ماصة باستور أثناء أداء حركة دائرية حول الجزء الخارجي من طبقة، مع غيض من ماصة ضد الأنبوب.
  4. غسل PBMCs معزولة ثلاث مرات في درجة الحموضة 7.3 الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) بواسطة الطرد المركزي في 350 x ج لمدة 10 دقيقة (مع الفرامل كاملة) بين يغسل. إعادة بيليه PBMC في المتوسط ​​RPMI كاملة. اعتمادا على حجم بيليه، 3-7 مل من المتوسط ​​غير كافية.
  5. عد PBMC باستخدام التريبان الأزرق وعدادة الكريات. الاعتماد فقط تلك الخلايا التي لم يتم الملون بالأزرق التريبان. Reconstitutه على PBMCs إلى 1،750،000 خلية / مل في المتوسط ​​RPMI كاملة.
  6. البذور 400 ميكرولتر (700،000 خلايا) في كل بئر من الشريحة 8 الغرفة. احتضان الشريحة في 37 درجة مئوية، ترطيب تماما نسيج الثقافة الحاضنة (تستكمل مع 5٪ CO 2) لمدة 1 ساعة للسماح للالوحيدات / الضامة على الانضمام.

2. المعالجة المسبقة للالالتزام وحيدات

ملاحظة: هذه الخطوة الضرورية فقط إذا كنت تبحث عن سبل لمنع أو تعزيز البلعمة.

  1. انضمت قبل علاج حيدات مع أي دواء (ق) أو مركب (ق) من الفائدة. إعادة تشكيل المخدرات (ق) أو غيرها من المواد اختبار للتركيز المطلوب باستخدام المتوسطة RPMI كاملة.
    ملاحظة: على سبيل المثال، عادة ما تستخدم 200 ميكروغرام / مل من IVIG أن تسفر عن تثبيط 95-100٪ من البلعمة عند استخدام حيدات الإنسان.
  2. نضح وتجاهل طاف تحتوي على أي خلايا غير ملتصقة من الشريحة 8 الغرفة بعد حضانة 1-ساعة (بعد الخطوة 1.6). استبدله 400ميكرولتر من دواء أو علاج آخر واحتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    1. عندما الشفط واستبدال الحلول في الشريحة 8 الغرفة، تأكد للسيطرة على تدفق السوائل بحيث خلايا الالتزام ضعيف لا يقلع. أيضا، والعمل مع فقط 2-3 الآبار فارغة في وقت وتجنب تجفيف الآبار.
      ملاحظة: عادة، يتم تنفيذ كل معاملة في يثلث التقنية.

3. طهاية من R 2 R 2 خلايا الدم الحمراء

ملاحظة: R 2 R 2 المستخدمة هنا هي الحصول عليها من مركز جمع الدم (الكندية خدمات الدم)، وإنما هي أيضا متاحة تجاريا. تستخدم Opsonized R 2 R 2 كرات الدم الحمراء كما تحكم إيجابية لالبلعمة بوساطة FcγR. السذاجة R 2 R 2 يجب أن يتم تخزينها في حل Alsever في (لإطالة العمر الافتراضي) في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 في الشهر. يتم حل Alsever لفي المنزل ويتكون من 0.8٪ ث / ت سترات الصوديوم (ثنائي الهيدرات)، 1.9٪ ث / ت سكر العنب، 0.42٪ ث / ت كلوريد الصوديوم، و 0.05٪ ث / ت حمض الستريك (الهيدرات). إذا R 2 R 2 خلايا غير متوفرة، وغيرها من الخلايا phenotyped الصحة الإنجابية، مثل R 1 R 2، R 1 R 1، R 1 ص، أو R 2 ص، ويمكن استخدامها.

  1. غسل R 2 R 2 (الرفيق / الرفيق) خلايا الدم الحمراء في برنامج تلفزيوني ما مجموعه ثلاث مرات باستخدام الطرد المركزي في 350 x ج لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    ملاحظة: كمية كرات الدم الحمراء اللازمة يعتمد على حجم التجريبية ويمكن أن يكون حساب العودة. غسل دائما كمية كبيرة من كرات الدم الحمراء، حيث يتم فقدان كرات الدم الحمراء خلال كل غسل بسبب تحلل أو أثناء إزالة طاف. على سبيل المثال، في تجربة مع 5 العلاجات و2 الضوابط، كل أجريت في يثلث التقنية، هناك ما مجموعه 21 بئرا. 21 بئرا مع 400 ميكرولتر / بئر 1.25٪ RBC الخليط إلى أن 105 ميكرولتر من معبأة، opsonized هناك حاجة إلى ربك. 200 ميكرولتر من RBC يجب غسلها في البداية و 150 & #يجب opsonized L لضمان وجود كمية كافية من كرات الدم الحمراء للخطوة البلعمة، 181.
  2. يستطهي غسلها R 2 R 2 بيليه مع 1: 1 ت / ت بولكلونل أضداد-D من مصل الدم البشري واحتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية، مع الخلط على فترات متقطعة.
    ملاحظة: إذا بولكلونل أضداد-D غير متوفرة، فمن الممكن استخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المضادة للD، وهي متوافرة تجاريا، أو مكافحة-D الذي يستخدم عادة لره الوقاية المناعي، والتي يمكن الحصول عليها من بنوك الدم أو نقل خدمات. وينبغي إجراء الاختبار الأمثل في البداية، عند إعداد مقايسة، وكلما تبديل الكثير من الأجسام المضادة، titered الامم المتحدة أو التحول إلى الأجسام المضادة وحيدة النسيلة. هذا هو تحديد تركيز الأمثل أو حجم المضادة للD المطلوبة لاختبار أضداد الغلوبولين (IAT) نتيجة بين 3+ و 4+ والبلعمة نتيجة بين 70-90 كرات الدم الحمراء المبتلعة في 100 حيدات فرزها.
  3. غسل يستطهيد R 2 R 2 ما مجموعه ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني باستخدام الطرد المركزي في 350 x ج لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    ملاحظة: طهاية بنجاح R 2 R 2 ويمكن التأكد عن طريق إجراء IAT غير مباشر. لفترة وجيزة، وأضاف الأجسام المضادة الثانوية مكافحة الإنسان لربط الأجسام المضادة opsonizing الأولية على الأسطح RBC، وإشارة تضخيمها بحيث يمكن ملاحظتها في شكل التراص. ويمكن الاطلاع على بروتوكول الشركة المصنعة مفصل في ملف المواد التكميلية.
  4. إعادة غسلها R 2 R 2 بيليه إلى 1.25٪ ت / ت باستخدام المتوسطة RPMI كاملة.
    ملاحظة: الزائد R opsonized 2 R 2 يمكن تخزينها في حل Alsever لفي 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع.

4. البلعمة بوساطة مستقبلات-FC

  1. نضح المخدرات أو طاف المتوسط من الشريحة 8 الغرفة وإضافة 400 ميكرولتر من 1.25٪ ت / ت R 2 R 2 الخليط. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
  2. الخلفإيه 2 ساعة من الحضانة، وإزالة الدوائر باستخدام محولات الشركة المصنعة. ربت قبالة الزائد R 2 R 2 على منشفة ورقية. تأكد من أن شريحة لا تجف.
  3. ملء كوب 100 مل مع برنامج تلفزيوني. غمر وغسل الشريحة التي تتحرك ببطء الشريحة ذهابا وإيابا (حوالي 30-40 السكتات الدماغية) لإزالة غالبية-المبتلعة الامم المتحدة R 2 R 2.
  4. إزالة الشريحة من برنامج تلفزيوني. ربت قبالة الزائد PBS باستخدام منشفة ورقية أو الأنسجة والهواء الجاف الشريحة.
  5. إصلاح الشريحة المجفف في الهواء في الميثانول بنسبة 100٪ لمدة 45 ثانية. ثم، والهواء الجاف الشريحة الثابتة.
    ملاحظة: يمكن ان تكون ثابتة الشرائح باستخدام طريقة أخرى التي هي أكثر توافقا لتلطيخ المصب، مثل وصمة عار جرونوالد بالغيمزا 21 أو وصمة عار رايت بالغيمزا 22.
  6. جبل الشريحة باستخدام في صنع منزل تصاعد elvanol المتوسطة (أو المتوسطة المتزايدة المتاحة تجاريا آخر) وإضافة coverslips.
    يتكون Elvanol المتوسطة المتزايدة من 15٪ ث / ت ص: ملاحظةlyvinyl الراتنج الكحول و 30٪ ت / ت الجلسرين في برنامج تلفزيوني. ويسخن المزيج حتى يذوب كل الراتنج والجليسرين مختلطة متجانس. يمكن استبدال هذا مع تصاعد المتوسط ​​الأخرى المتاحة تجاريا.
  7. السماح للجبل لتجف بين عشية وضحاها قبل الكمي.

5. الكمي من البلعمة

  1. باستخدام المجهر المرحلة على النقيض من و40X عدسة الهدف، تحديد يدويا كمية من الأحداث أكلة عن طريق العد لا يقل عن 200 حيدات وعدد من المبتلعة R 2 R 2 ضمن هذه حيدات. هل لديك عداد واحد في كل يد لتحديد وقت واحد وعدد من وحيدات وعدد من المبتلعة R 2 R 2.
  2. الحصول على متوسط مؤشر أكلة بقسمة عدد من المبتلعة R 2 R 2 من قبل عدد من وحيدات ضرب من قبل 100. اكسبريس البيانات كما المتوسط (متوسط مؤشر البلعمة) ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM).

النتائج

باتباع الخطوات الحاسمة في الشكل (1) والإجراءات الموضحة أعلاه، مجلس العمل المتحد لا يمكن أن يؤديها بتكاثر. وقد استخدم IVIG كمثال لتثبيط البلعمة في الشكل 2. ومن المعروف IVIG لربط ومنع المستقبلات التيسير، مما يحول دون نتائج المصب البلعمة. بواسطة المعايرة كمية IVIG المستخدمة، لوحظ تثبيط تعتمد على الجرعة، التي تركيزات أعلى من 200 ميكروغرام أسفرت / مل في ما يقرب من 100٪ تثبيط وتركيزات أقل من 0.5 ميكروغرام / مل لم تمنع على الإطلاق (الشكل 2A). عندما تتحول المؤشرات أكلة وتطبيع للمراقبة إيجابية R 2 R 2 ك 0٪ كبت، منحنى تثبيط مع IC 50 من 3 ميكروغرام يمكن تحديد / مل (الشكل 2B).

بالإضافة إلى إجراء فحص على الدوام، quantificaنشوئها الفحص يمكن أن يكون صعبا في بعض الأحيان. الشكل (3) عبارة عن مجموعة من المرحلة على النقيض من الصور المجهري مختلف الشرائح MMA. مع خبرة المجهر، يمكن للمرء أن يميز الوحيدات من RBC تلوث (الشكل 3D)، أو فجوة من RBC المبتلعة (الشكل 3B). وينبغي تجنب التجمعات الكثيفة للخلايا و / أو الحطام خلال الكمي (أرقام 3E و F). أيضا، ينبغي للمرء تجنب الإفراط في opsonizing آر 2 R 2 RBC، التي من شأنها أن تؤدي إلى البلعمة الكبيرة التي يمكن overcrowds الداخلية الوحيدات ويتداخل مع التقدير الدقيق (الشكل 3C).

figure-results-1
الشكل 1. رسم تخطيطي من مجلس العمل المتحد. ووصف خطوة بخطوة من خطوات حاسمة في مجلس العمل المتحد: عزل PBMC من الدم الكامل، وإطعام monocyt الالتزاموفاق مع opsonized R 2 R 2، وغسل الشرائح غرفة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2. الوريد مفتش (IVIG) يمنع البلعمة في المختبر باستخدام MMA. ومن المعروف IVIG لمنع البلعمة، ويستخدم كعنصر تحكم تثبيط في MMA البشري. (A) المعايرة من IVIG أدى إلى تثبيط تعتمد على الجرعة البلعمة بالمقارنة مع غير المعالجة R 2 R 2 السيطرة. وأظهرت النتائج أن متوسط ​​± الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM) ن = 3 تجارب. وقد أجري التحليل الإحصائي باستخدام الطلاب ر -test: ** P≤0.01 و*** P≤0.001. (ب) منحنى تثبيط IVIG مع IC 50 سو 3 ميكروغرام / مل (الخط المنقط). وتشير نتائج البيانات تطبيع لR غير المعالجة 2 R 2 (0٪ تثبيط)؛ يعني ± SEM من ن = 3 تجارب. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3. المرحلة على النقيض الصور المجهر الشرائح العينة تحت 40X التكبير. (A) الشريحة مثالية فيه حيدات المبتلعة 1-2 R 2 R 2 في المتوسط (السهام السوداء مع توهج هالة مميزة)، مع عدد قليل جدا من تلويث، برنامج الأمم المتحدة للالمبتلعة R 2 R 2 في الخلفية (السهام البيضاء). فجوات (B) كما هو مبين في هذه الشريحة، وحيدات في بعض الأحيان قد الموسع (السهام البيضاء)، والتي يمكن أن يكون مخطئا لالمبتلعة R 2 R 2. (C </ قوي>) عندما يكون R 2 R 2 الإفراط في opsonized، أكثر من 4-5 المبتلعة R 2 R 2 في الوحيدات (الأسهم السوداء) تجعل عد دقيقة صعبة، منذ R 2 R 2 تزدحم داخل الوحيدات وخلية متميزة لا يمكن تمييزها الحدود. (D) غسل عدم كفاية الشريحة يؤدي إلى وفرة R 2 R 2 تلوث (السهام البيضاء)، والتي يمكن أن يكون مخطئا لكرات الدم الحمراء الالتزام. (E) في بعض الأحيان، وحيدات وكرات الدم الحمراء تلويث قد شكل مجموعات. تشير مجموعات أيضا التلوث الجرثومي، والتي ينبغي تجنبها. (F) وحيدات قد تشكل المجاميع الكبيرة، التي يجب تجنبها أثناء الكمي. عن طريق اختيار عشوائي من الحقول لعرض، لوحة (أ) هو ما لوحظ عادة إذا كان قد تم إجراء MMA بشكل صحيح. شريط النطاق هو 20 ميكرون. الرجاء الضغط هنالعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

مجلس العمل المتحد هو أسلوب شاقة تتطلب الخبرة في كل من زراعة الأنسجة والفحص المجهري. هناك العديد من الخطوات الهامة لضمان النجاح: 1) جيل من أحادي الطبقة الوحيدات. 2) طهاية من كرات الدم الحمراء، و 3) الكمي اليدوي. لا تلتزم أحادي الطبقة الوحيدات بقوة إلى الشريحة الغرفة، لذلك يجب المحافظة على درجة الحموضة الفسيولوجية في جميع أنحاء فحص 11، وينبغي أن المصنف وجود عدد كاف من PBMCs. pipetting لقوي، والتي قد تعكر صفو خلايا الالتزام، ينبغي تجنبها. نهج واحد هو إزالة دائما وإضافة حلول من نفس زاوية الغرفة والتأكد من أن الحركة بطيئة وثابتة. وبالمثل، خلال خطوة الغسيل الأخيرة لإزالة الزائد كرات الدم الحمراء، وينبغي أن تكون الحركة بطيئة وثابتة. وهذا يضمن الحد الأدنى من اضطراب أحادي الطبقة في حين لا يزال إزالة الغالبية العظمى من كرات الدم الحمراء-المبتلعة الامم المتحدة. وغسل غير كافية يؤدي إلى خلفية عالية من كرات الدم الحمراء الملوثة، الأمر الذي يجعل منه اليدويntification صعوبة. ثانيا، كرات الدم الحمراء R 2 R 2 يجب opsonized بما فيه الكفاية للحصول على متوسط مؤشر أكلة من 80-120 لمراقبة البلعمة. هذا النطاق أكلة المطلوب توازنا بين سهولة العد (على سبيل المثال، المبتلعة حيدات مع أكثر من 5 كرات الدم الحمراء يصعب تحديدها بدقة) والحفاظ على كمية كافية من البلعمة للتحليل الإحصائي. درجة طهاية يمكن تأكيد من قبل معهد التكنولوجيا التطبيقية، وهناك حاجة إلى القراءة بين 3+ 4+ ل. وR 2 R يجب التخلص 2 كرات الدم الحمراء عندما يكون هناك تحلل الزائد أثناء الغسيل، عندما يتحول طاف الأحمر الداكن، أو عندما لوحظ انخفاض كبير في البلعمة في التجارب نظرا لشيخوخة الخلايا في التخزين. وأخيرا، وتحديد يدوي باستخدام المجهر ويمكن أن تكون خادعة، وخاصة عند المقارنة بين التهم بين أفراد المختبر وبين التجارب. من خلال دراسة نفس المجال على كل بئر، أو ببساطة عن طريق عد المزيد من الخلايا، يمكن الحصول على عدد أكثر اتساقا. ويوصى التدريب جنبا إلى جنب مع فني من ذوي الخبرة واستخدام مجموعة معينة من الشرائح التدريب.

نقد كبير من مجلس العمل المتحد هو ذاتية الخطوة الكمي اليدوية. ومع ذلك، مع التدريب المناسب، والاتساق ويمكن الحصول عبر عدادات مختلفة. الحد الآخر هو الجوهرية الخلافات المانحة إلى الجهات المانحة في قدرات أكلة الوحيدات وفي R 2 R 2 سطح مستويات التعبير مستضد، والتي هي مصدر التباين في البيانات عند التعامل مع العينات البشرية.

تتوفر لدراسة البلعمة بوساطة FcγR تقنيات بديلة أخرى. غالبية مجموعات تجارية تستخدم الناتج الفلورسنت لمراقبة البلعمة (على سبيل المثال، bioparticles وحساسة درجة الحموضة البروتين مضان، أو المسمى مفتش الخرز اللاتكس الفلورية). استخدام الناتج الفلورسنت لا تقدم الكمي أكثر موضوعية، ولكن يحتاج واحد أيضا لخداعسدر توافر والتكلفة والتدريب المرتبطة باستخدام المجهر الفلورسنت أو قياس التدفق الخلوي، فضلا عن الاعتماد التي تلت ذلك على مجموعات المتاحة تجاريا.

وأخيرا، وهذا الفحص يمكن تعديلها تبعا لسؤال البحث. على سبيل المثال، عند اختبار تثبيط المخدرات البلعمة، وحيدات يمكن أن تكون إما قبل المعالجة أو المشارك حضنت مع كل من المخدرات وكرات الدم الحمراء opsonized (أي فحص المنافسة). إشارات المصب من الأجسام المضادة من أنواع فرعية مختلفة، والأجسام المضادة خيالية، أو يبني المؤتلف ويمكن أيضا اختبار. مع اختراقات الأخيرة في تطوير مستضد باطل العالمي الدم 24، مجلس العمل المتحد يمكن استخدامها في الشاشات الأولية لهذه كرات الدم الحمراء مستضد لاغيا مع مختلف الأجسام المضادة لتقييم ما إذا كان هناك بالفعل فعالية خفضت في التسبب البلعمة.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

يشكر المؤلفون خدمات الدم الكندية على جائزة برنامج زمالة الدراسات العليا ل T.N.T. تلقى هذا البحث دعما ماليا من مركز الابتكار التابع لخدمات الدم الكندية ، بتمويل من الحكومة الفيدرالية (وزارة الصحة الكندية) ووزارات الصحة في المقاطعات والأقاليم. لا تعكس الآراء الواردة هنا وجهات نظر الحكومات الفيدرالية أو الإقليمية أو الإقليمية في كندا.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
سكر العنب الحمضي سيترات (ACD)فراغات BDREF364606
RPMI 1640SigmaR8758
HEPESBioshopHEP003.100
مصل بقري الجنينمتعدد الخلايا   ؛080150
جنتاميسينجيبكو15710-64
Ficoll-Paque PLUSGE17-1440-03https://www.gelifesciences.com/
الفوسفات المحلول الملحيالمخزن SigmaD8537
8 غرف شرائحLab-Tek-ll154534
R2< / sub>R2< / sub> (cDE / cDE) خلايا الدمالحمراءخدمات الدم الكنديةالمتاحة تجاريا ( على سبيل المثال < / em> ، http://www.bio-rad.com/en-ca/product/reagent-red-blood-cells) مضاد
يمكن استبدال SigmaP8136بحامل
UltraPure GlycerineInvitrogen15514-011
المتوفر تجاريا زلات الغطاءVWR48366 067
Novaclone anti-IgGImmucorgamma5461023اختياري ل IAT (http://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/.../ucm081743.pdf)
متعدد النسيلة من مصل الدم البشري Gamma Biologics DIN 02247724 يمكن استبداله ب monoclonal anti-D المتاح تجاريا أو مع Rh الجلوبيولين المناعي 100٪ ميثانول كاليدون 6700-1-42 راتنج كحول البولي فينيل

المراجع

  1. Hunt, J. S., Beck, M. L., Hardman, J. T., Tegtmeier, G. E., Bayer, W. L. Characterization of human erythrocyte alloantibodies by IgG subclass and monocyte interaction. Am J Clin Pathol. 74 (3), 259-264 (1980).
  2. Schanfield, M. S., Stevens, J. O., Bauman, D. The detection of clinically significant erythrocyte alloantibodies using a human mononuclear phagocyte assay. Transfusion. 21 (5), 571-576 (1981).
  3. Branch, D. R., Gallagher, M. T., Mison, A. P., Sysiokian, A. L., Petz, L. D. In vitro determination of red cell alloantibody significance using an assay of monocyte-macrophage interaction with sensitized erythrocytes. Br J Haematol. 56 (1), 19-29 (1984).
  4. Hunt, J. S., Beck, M. L., Wood, G. W. Monocyte-mediated erythrocyte destruction. A comparative study of current methods. Transfusion. 21 (6), 735-738 (1981).
  5. Noumsi, G. T., Billingsley, K. L., Moulds, J. M. Successful transfusion of antigen positive blood to alloimmunised patients using a monocyte monolayer assay. Transfus Med. 25 (2), 92-100 (2015).
  6. Moulds, J. M. Introduction to antibodies and complement. Transf Apher Sci. 40 (3), 185-188 (2009).
  7. Grandstaff Moulds, M. K. Antibody identification. Transf Apher Sci. 40 (3), 195-197 (2009).
  8. Hendrickson, J. E., Tormey, C. A., Shaz, B. H. Red blood cell alloimmunization mitigation strategies. Transfus Med Rev. 28 (3), 137-144 (2014).
  9. Hamilton, J. R. Common and frequently encountered antibodies. Transfus Apher Sci. 40 (3), 189-194 (2009).
  10. Kenna, M. A., Cooper, R. A., Schrieber, A. D. Effect of papain on the interaction between human monocytes, erythrocytes and IgG. Blood. 46 (2), 245-252 (1975).
  11. Tong, T. N., et al. Optimal conditions for the performance of a monocyte monolayer assay. Transfusion. , Epub ahead of print (2016).
  12. Gray, S. J., Sterling, K. The tagging of red cells and plasma proteins with radioactive chromium. J Clin Invest. 29 (12), 1604-1613 (1950).
  13. Mollison, P. L., Veall, N. The use of the isotope 51Cr as a label for red cells. Br J Haematol. 1 (1), 62-74 (1955).
  14. Sebring, E. S., Polesky, H. F. Detection of fetal hemorrhage in Rh immune globulin candidates. A rosetting technique using enzyme-treated Rh2Rh2 indicator erythrocytes. Transfusion. 22 (6), 468-471 (1982).
  15. Downing, I., Templeton, J. G., Mitchell, R., Fraser, R. H. A chemiluminescence assay for erythrophagocytosis. J Biolumin Chemilumin. 5 (4), 243-250 (1990).
  16. Fabron, A. Jr, et al. Application of noninvasive phagocytic cellular assays using autologous monocytes to assess red cell alloantibodies in sickle cell patients. Transfus Apher Sci. 31 (1), 29-35 (2004).
  17. Michelis, F. V., et al. Acute hemolysis after intravenous immunoglobulin amid host factors of ABO-mismatched bone marrow transplantation, inflammation, and activated mononuclear phagocytes. Transfusion. 54 (3), 681-690 (2014).
  18. Rampersad, G. C., et al. Chemical compounds that target thiol-disulfide groups on mononuclear phagocytes inhibit immune mediated phagocytosis of red blood cells. Transfusion. 45 (3), 384-393 (2005).
  19. Purohit, M. K., et al. Structure-activity relationships of pyrazole derivatives as potential therapeutics for immune thrombocytopenias. Bioorg Med Chem. 22 (9), 2739-2752 (2014).
  20. Neschadim, A., Kotra, L. P., Branch, D. R. Small molecule phagocytosis inhibitors for immune cytopenias. Autoimmun Rev. 15 (8), 843-847 (2016).
  21. Fitzer-Attas, C. J., et al. Fcgamma receptor-mediated phagocytosis in macrophages lacking the Src family tyrosine kinases Hck, Fgr, and Lyn. J. Exp Med. 191 (4), 669-682 (2000).
  22. Allhorn, M., et al. The IgG-specific endoglycosidase EndoS inhibits both cellular and complement-mediated autoimmune hemolysis. Blood. 115 (24), 5080-5088 (2010).
  23. Li, L., et al. Inhibition of phagocytic recognition of anti-D opsonized Rh D+ RBC by polymer-mediate immunocamouflage. Am J Hematol. 90 (12), 1165-1170 (2015).
  24. Kwan, D. H., et al. Toward efficient enzymes for the generation of universal blood through structure-guided directed evolution. J Am Chem Soc. 137 (17), 5695-5705 (2015).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

بلعمة مستقبلات Fcالبلعمة بوساطة الأجسام المضادةالخلايا أحادية النواة في الدم المحيطيتوسيم كريات الدم الحمراءمجهر تباين الطورالمجهر الفلورياللطخة المناعية الغربيةتثبيط الغلوبولين المناعي الوريديمقايسة طب نقل الدم
استخدام الوحيدات أحادي الطبقة الفحص لتقييم البلعمة بوساطة مستقبلات Fcγ
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.