مقالة منهجية

المعادن التصوير في أنسجة المخ عن طريق الاستئصال بالليزر - إلى جانب بالحث البلازما - الطيف الكتلي (LA-ICP-MS)

23.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/55042

⸱

يناير 22, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Elemental Bio-imaging Facility, University of Technology Sydney, 2Florey Institute of Neuroscience and Mental Health, The University of Melbourne, 3Department of Pathology, The University of Melbourne, 4School of Earth Sciences, The University of Melbourne, 5Research School, Ruhr University, 6Department of Physiology, Monash University, 7ESI Ltd., Bozeman, 8Agilent Technologies, Mulgrave

في هذه المقالة

ملخص

رسم كميا المعادن في الأنسجة عن طريق الاستئصال بالليزر - بالحث البلازما جانب - قياس الطيف الكتلي (LA-ICP-MS) هو تقنية تحليلية حساسة يمكن أن تقدم نظرة جديدة في كيفية المشاركة المعادن في العمليات وظيفة والمرض العادية. هنا، نحن تصف بروتوكول لتصوير كميا المعادن في أقسام رقيقة من الأنسجة العصبية الماوس.

الملخص

تم العثور على المعادن بتواجد مطلق في جميع أنحاء كائن حي، مع دور البيولوجي على تمليها كل من التفاعل الكيميائي وفرة في منطقة تشريحية محددة. داخل الدماغ، والمعادن لديها توزيع مجزأة للغاية، اعتمادا على وظيفتها الأساسية يلعبون داخل الجهاز العصبي المركزي. تصوير التوزيع المكاني للمعادن قدمت نظرة فريدة في العمارة الحيوية في الدماغ، مما يسمح علاقة مباشرة بين المناطق تشريحي عصبي وظيفة معروفة لها فيما يتعلق بعمليات تعتمد على المعادن. وبالإضافة إلى ذلك، تتميز العديد من الاضطرابات العصبية المرتبطة بالعمر عطلت توازن المعادن، والتي غالبا ما يقتصر على مناطق صغيرة من الدماغ التي يصعب تحليلها على خلاف ذلك. هنا، نحن تصف طريقة شامل لتصوير كميا المعادن في مخ الفأر، وذلك باستخدام الاستئصال بالليزر - إضافة بالحث البلازما - قياس الطيف الكتلي (LA-ICP-MS) ومعالجة الصور المصممة خصيصاالبرمجيات. التركيز على الحديد والنحاس والزنك، والتي هي ثلاثة من المعادن الأكثر وفرة والأمراض ذات الصلة داخل الدماغ، وصفنا الخطوات الأساسية في إعداد العينات والتحليل والقياسات الكمية ومعالجة الصور لإنتاج خرائط توزيع المعادن داخل ميكرومتر منخفضة قرار مجموعة. هذه التقنية، التي تنطبق على أي مقطع قطع الأنسجة، وقادر على إثبات توزيع متغير بدرجة كبيرة من المعادن داخل الجهاز أو النظام، ويمكن استخدامها لتحديد التغيرات في توازن المعادن والمستويات المطلقة داخل الهياكل التشريحية الدقيقة.

المقدمة

الأكسدة كيمياء فريدة من نوعها من المعادن يسهل مجموعة من الوظائف العصبية، بما في ذلك نقل الإشارة وإنتاج الطاقة والتوليف العصبي. في عدد من الأمراض العصبية الكبرى، كانت dyshomeostasis من هذه المعادن على حد سواء المتورطين في التسبب بالمرض وحددت أهدافا جديدة محتملة للتدخل العلاجي 1. لفهم أفضل لكيفية يشاركون المعادن في حالات مثل مرض الزهايمر والشلل الرعاش (AD وPD، على التوالي)، لا بد أن تكون قادرة على قياس مدى تغير توزيع المعادن والمستويات داخل المناطق المتضررة من عملية المرض. هذه التغيرات غالبا ما تكون مؤشرا على تحولات خفية في التفاعلات الكيميائية الحيوية التي قد تكون مرتبطة ارتباطا وثيقا العمليات التي تبدأ موت الخلايا، مثل لدينا الآلية المقترحة مؤخرا من الحديد والدوبامين العصبية في PD 2.

تقليديا، ميتاوقد أمكن تحقيق مستويات لتر داخل المناطق التشريحية المحددة من خلال الاستئصال الدقيق، والهضم والتحليل باستخدام مجموعة من التقنيات التحليلية 3. ومع ذلك، فإن مثل هذا النهج يفقد المعلومات المكانية، التي يمكن أن تكون حاسمة عندما الحالات المرضية يجري التحقيق إشراك صغيرة، مناطق محددة جيدا أو أنواع معينة من الخلايا. تتوفر لتصور المعادن في النظم البيولوجية، من عينات سليمة لقطاعات النسيج وثنائية وثلاثية الأبعاد، باستخدام التحليل الطيفي الانبعاثات، تحقيقات الفلورسنت وقياس الطيف الكتلي 4 وهناك عدد من الأساليب التحليلية. كل تقنية لها مزايا وعيوب تتعلق الحساسية والانتقائية من الأنواع الكيميائية، والقرار المكانية التي يمكن تحقيقها. لمحة شاملة عن مجموعة من التقنيات المتاحة، راجع مراجعة من قبل هير وآخرون. 5.

القائم على قياس الطيف الكتلي (MS) طرق هي الأكثر حساسية من هذه التقنيات، قادرة على قياس المعادن الأكثر أهمية من الناحية البيولوجية في تركيز أصلي بهم 6. ليزر الاجتثاث - إضافة بالحث البلازما - قياس الطيف الكتلي (LA-ICP-MS) التصوير يستخدم شعاع ليزر الأشعة فوق البنفسجية تركيزا تتراوح في حجمها من 1 إلى> 100 ميكرون في القطر (أو العرض، عند استخدام شكل شعاع رباعي)، والتي بموجبها يتم تمرير العينة 7. لا يمكن أن يتحقق من المعلومات الكمية من خلال الاجتثاث تمثيلي من المواد المرجعية القياسية، والتي يمكن أن يتم إنتاجها باستخدام مجموعة متنوعة من الأساليب المختلفة 8، كل منها بدرجات متفاوتة من الصعوبة التقنية والعملية التحليلية. يستخدم النهج الأكثر شيوعا مصفوفة المطابقة، حيث تعد المعيار مع التركيب الكيميائي الغالب مماثلة لتلك العينة من قبل ارتفاعه مع الحليلة الهدف وبدقة تقييم للتجانس وتركيز المعادن المطلق عن طريق تحليلية مستقلة 9، 10. ويمكن بعد ذلك الاجتثاث المعايير مستعدة أن تستخدم لأغراض المعايرة الخارجية، مما يسمح البيانات تركيز من صورة العينة الناتجة سيتم استخراج لكل بكسل.

يتم تحديد دقة وضوح الصورة من قبل كل من حجم الحزم والسرعة التي يتم مسحها ضوئيا العينة. معيار رباعي تصميم ICP-MS (والتي تمثل أكثر من 90٪ من جميع النظم ICP-MS المثبتة في جميع أنحاء العالم 11) هو محلل كتلة متسلسل، في تلك الدورات للكشف عن كتلة من خلال تحديد كافة نسبة الكتلة للشحنة (م / ض ) بدلا من جمع البيانات في وقت واحد. وهكذا، فإن اكتساب الوقت في كل دورة من الجماهير يجب أن تساوي إلى الوقت الذي يستغرقه لعينة لاجتياز عرض واحد من شعاع الليزر لضمان الحصول ممثل بكسل القرار المطلوب 12. الليزر اختيار حجم شعاع معلمة الحاسمة التي لها آثار كبيرة على كل من حساسية والزمن الكلي للتحليل. كما physi الاستئصال بالليزرساتيا يزيل المواد التي اجتاحت لICP-MS بواسطة غاز الأرجون الناقل، وكمية المادة التي يمكن الكشف عنها جسديا من قبل محلل كتلة يتبع قانون التربيع العكسي. على سبيل المثال، والحد من شعاع الليزر قطرها 50-25 ميكرون النتائج في الحد من المواد ذاب من قبل عامل من أربعة. بالإضافة إلى ذلك، كوسيلة من وسائل المسح الضوئي، وبأقطار شعاع أصغر زيادة الزمن اللازم لاجتثاث مساحة محددة. لذلك، التصميم التجريبي ضروري لتحقيق التوازن في القرار المكانية اللازمة مع احتياجات الحساسية وضيق الوقت.

وقد تم تطبيق التصوير بواسطة LA-ICP-MS إلى مجموعة من العينات، المصفوفات والحالات المرضية، بما في ذلك نماذج حيوانية من الاضطرابات العصبية 13، 14، صدمة إصابات الدماغ 15، توزيع، تعرض الأدوية المضادة للسرطان 16 المحتوية على معادن سامة في المشيمة 17 والمعادن تنقيبibution في الأسنان والعلامات البيولوجية من التحولات الغذائية في مستهل حياتها. 18 في هذا البروتوكول وصفنا طريقة عامة لتصوير الحديد والنحاس والزنك في مخ الفأر WT بدرجة وضوح 30 ميكرون، على الرغم من أنه يمكن أن تتكيف بسهولة مع مجموعة واسعة من أنواع العينات والنتائج التجريبية، استنادا إلى احتياجات المحلل.

البروتوكول

وقد تمت الموافقة على الإجراءات الموضحة في هذه الوثيقة من قبل فلوري جنة الأخلاقيات الحيوانية هوارد والالتزام بمعايير مجلس البحوث الطبية الصحية الوطنية ورعاية الحيوان.

1. إعداد نموذج للتحليل

ملاحظة: هذه الخطوة تختلف اعتمادا على مصفوفة عينة لتحليلها.

  1. تحضير عينات وباجتزاء
    ملاحظة: التثبيت باستخدام 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) وcryoprotection في 30٪ سكروز في 0.1 M برنامج تلفزيوني ينتج بكميات من غسل المعادن من أنسجة مختلفة. انظر هير وآخرون 19 للحصول على تفاصيل محددة. خضعت ضمان جميع العينات مطابقة تثبيت وcryoprotection الخطوات.
    1. Transcardially يروي الحيوان الموت الرحيم مع الجليد الباردة 0.1 M PBS، ودرجة الحموضة 7.4 (راجع المقطع طرق في Dodt وآخرون. (20) لمزيد من التفاصيل) وإزالة الدماغ.
    2. وضع الدماغ في 4٪ PFA O / N لإصلاح الأنسجة.
      3. <لى> Cryoprotect الدماغ عن طريق وضعها في السكروز 30٪ في 0.1 م برنامج تلفزيوني لمدة 24 ساعة، ثم قم بتغيير إلى الطازج 30٪ سكروز لمدة 24 ساعة أخرى. 19
    3. تجميد الدماغ في ناظم البرد في -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل.
    4. تركيب الدماغ على تشاك باستخدام المتوسطة المتزايدة مناسبة.
    5. قسم الدماغ على ناظم البرد باستخدام شفرة المتاح خالية من المعادن (على سبيل المثال، تترافلوروإيثيلين [PTFE] المغلفة السكاكين) وجبل على شريحة المجهر القياسية. يجب أن يكون سمك الأمثل لقسم ما يقرب من 30 ميكرون.
  2. في حالة استخدام عينات جزءا لا يتجزأ من البارافين، في الجزء سمك المطلوب، تطفو الشريط على حمام ماء دافئ وجبل على شرائح المجهر القياسية.
    ملاحظة: آثار دقيقة من التثبيت على المدى الطويل والبارافين التضمين من العينات البيولوجية ليست معروفة. كما هو موضح في 1.1، وضمان جميع العينات التي خضعت لإجراءات إعداد العينات متطابقة إذا كان المقصود تحليل مقارن.
    1. Dewax سنوياعينات جزءا لا يتجزأ من RAFFIN عن طريق غمس الشريحة في 3 تغييرات الزيلين، 1 تغيير كل من: الإيثانول بنسبة 100٪، و 95٪ من الإيثانول و 70٪ من الإيثانول ولا تقل عن 3 تغييرات في ISO 3696 أو المياه النقية أي ما يعادل (الآخرة، ويشار إلى ' المياه "، وانظر هير وآخرون 21 لطريقة تفصيلي).
  3. السماح للعينات ليجف في الهواء لحوالي 1 ساعة في بيئة خالية من الغبار، مثل مربع الشريحة مع عينات ضعت عموديا في رفوف وغطاء ترك مواربا.

2. إعداد معايير المطابقة مصفوفة

ملاحظة: وفيما يلي تلخيص بروتوكول نشرت سابقا 9. يرجى الرجوع إلى الورقة الأصلية لخطوات تفصيلية لإعداد معايير الأنسجة المتطابقة المصفوفة.

  1. الحصول على العقول الضأن التجارية (أو ما شابه) وشطف في الماء، وإزالة كل الدم والأنسجة الضامة.
  2. باستخدام مشرط، تشريح بعناية ما يقرب من 50 غراما من TISSU القشريةه وجزئيا التجانس باستخدام الخالط الأنسجة باليد مع التحقيق الذي تجريه المتاح البولي على الطاقة المنخفضة. تقسيمها إلى 5 ز قسامات، مع عدد تبعا لمدى معايرة وعدد من نقاط المعايرة المطلوبة.
  3. إعداد حلول للمعادن إلى ارتفاع كل مستوى عن طريق تذويب الملح للذوبان من كل تحليلها (على سبيل المثال، FeSO 4 · H 2 O) في 1٪ حمض النيتريك لإنتاج 0.1، 1، و 100 ملغ المعادن مل -1 الأسهم.
  4. إضافة حجم ما قبل محسوب من الحل الأسهم إلى 5 ز الأنسجة aliquoted (على سبيل المثال، 5 ميكرولتر من 10 ملغ مل -1 لتركيز النهائي تقريبي من 10 ميكروغرام ز -1 النسيج الرطب) لتحقيق مجموعة من مستويات المعادن ارتفعت في كل مستوى.
    1. اعتمادا على تركيز النهائي المطلوب من كل مستوى، واستخدام مزيج من كل حل سهم معدنية لضمان الحد الأدنى من الحلول تضاف إلى معيار. إضافة الارتفاع النهائي من المياه إلى كل مستوى لضمان متساوأحجام متكافئ من السوائل المضافة هي موجودة في كل مستوى.
    2. تجانس المعايير ارتفعت على الطاقة المنخفضة لحوالي 30 ثانية. إن لم يكن ليتم استخدامها على الفور، والحفاظ المجمدة في -20 درجة مئوية في أنابيب البولي بروبلين توج مختومة مع بارافيلم.
  5. تحديد تركيز دقيق وتجانس كل مستوى باستخدام أي من الإجراءات التالية:
    1. الهضم الميكروويف
      1. وضع 6 دقة وزنه (حوالي 50 ملغ) aliquots من مستوى في سفينة الهضم PTFE غسلها وإضافة 4 مل من تركيزهم (65٪) وحمض النتريك 1 مل من 30٪ بيروكسيد الهيدروجين. ختم وهضم في 500 واط لمدة 30 دقيقة.
      2. بعد التبريد السفينة الهضم، مفتوحة في غطاء الدخان وكميا نقل الحل هضمها إلى أنبوب 50 مل حمض غسلها باستخدام 10 مليلتر مأخوذة من الماء. جعل ما يقرب من 50 مل، وتزن بدقة كتلة الحل النهائي.
      3. كرر الخطوات 2.5.1.1 - 2.5.1.2 لكل معيار.
    2. استخدم الإجراء التالي إذا معدات الميكروويف الهضم ليست متوفرة:
      1. وضع ستة تقاس بدقة (بين 25-200 ملغ) aliquots من مستوى إلى حمض غسلها خالية من أنبوب معدني / البولي بروبلين ويجفد O / N.
      2. إضافة 40 ميكرولتر من حمض النتريك والحرارة، لم يسبق لهم اللعب، على كتلة التدفئة إلى 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ثم إضافة 10 ميكرولتر من 30٪ بيروكسيد الهيدروجين. الحرارة لمدة 5 دقائق أخرى، ثم قم بإجراء بدقة إلى 1 الحجم الكلي مل باستخدام 950 ميكرولتر من حمض النيتريك 1٪.
        ملاحظة: من المستحسن أن هضم المواد المرجعية المعتمدة باستخدام طريقة الاختيار لضمان إجراءات الهضم دقيقة.
  6. تحديد تركيز المعادن في كل الهضم حل عن طريق حل بالإرذاذ ICP-MS باستخدام بروتوكول قياسي. تقييم تجانس كل مستوى من خلال تحديد الانحراف المعياري النسبي (٪ RSD) بين كل قسامة. ضمان٪ RSDS كل سقوط في حدود 15٪. باستخدام كتلة تقاس من عصامالفصل قسامة، وحساب تركيز المعادن الدقيق لكل معيار النسيج المتجانس.
  7. وبالعودة إلى مستوى الأنسجة المتجانس، حزمة 5 × 5 مم من البلاستيك القابل للتصرف العفن الأنسجة وتجميد في -pentane ايزو تبرد في النتروجين السائل. إزالة كتلة الأنسجة القياسية المجمدة من العفن وقسم على ناظم البرد في سمك نفس العينة.
    ملاحظة: من المستحسن إعداد عدد من الفروع في سمك مختلفة عن التجارب المستقبلية. معايير المجفف في الهواء ويمكن تخزين ما لا نهاية في وعاء محكم الهواء وخالية من الغبار.

3. إعداد LA-ICP-MS لتحليل

  1. معايير مكان وعينة في غرفة الاجتثاث، والتأكد من أنها في عمق المجال للكاميرا CCD تركيبها على وحدة لوس انجليس. إذا ضبط الصك ضروري، وتشمل مادة مناسبة المرجعية (على سبيل المثال، نيست 612 العناصر النادرة في الزجاج). أصابع تشديد المسمارين على باب الغرفة لاغلاق عشرالبريد غرفة الاجتثاث.
  2. في برنامج ICP-MS، اختر فتح صمام غاز الأرجون في "الصيانة" أو لوحة مماثلة، وضبط تدفق الغاز الناقل إلى 1.2 L دقيقة -1 في مربع الحوار المناسب.
    ملاحظة: في هذا الأرجون بروتوكول يتم استخدام الغاز الناقل. العديد من الأمثلة تستخدم إما الهليوم أو خليط من الهيليوم والأرجون باعتبارها الناقل للغاز. انظر غونتر وهاينريش 22 للحصول على التفاصيل الفنية لاستخدام الهيليوم والأرجون خليط من غازات الاحتباس الهباء الجوي الناقل.
  3. في البرنامج LA، انقر فوق الزر "تطهير" للقضاء على الخلايا بغاز الأرجون مدة لا تقل عن 30 دقيقة.
    ملاحظة: وقت التطهير يمكن تغييرها عن طريق النقر على 'الوقت تطهير "أو زر مماثل. عند استخدام نظام الاجتثاث مع خلية الاجتثاث في مجلدين، دوري تحريك خشبة المسرح لكل زاوية واجتياز قطريا الخلية لضمان كما تتم إزالة الكثير من الهواء المتبقية من الخلية ممكن. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق اختيار "مراحل المنزل 'أو EQUIVوظيفة علنت.
  4. بدوره على ICP-MS بواسطة الضغط على 'البلازما على' والسماح لالاحماء لمدة ساعة، وخلالها الخطوات 3،5-4،4 يمكن القيام بها. تختلف إعدادات أداة بين المصنعين، على الرغم مثال من ظروف التشغيل LA-ICP-MS المناسبة يمكن العثور عليها في هير وآخرون. 10.
  5. الاجتثاث التمثيلي للمعايير الأنسجة
    1. حدد أداة خط ورسم خط واحد من الاجتثاث حوالي 3 مم طويل عبر سطح الأنسجة.
    2. تعيين المعلمات على النحو التالي بالنقر بزر الماوس الأيمن فوق خط الاجتثاث في قائمة التجربة وتغيير ما يلي: شعاع قطره (اختيار حسب الاقتضاء من قبل المستخدم، ويستخدم 30 ميكرون بروس هنا)، سرعة المسح الضوئي (4 أضعاف قطر شعاع في الثانية، 120 ميكرون الصورة -1) وفلوينس الطاقة (0.3 -0.5 سم J -2 لالأنسجة اللينة، تحسين إذا لزم الأمر للمصفوفات أصعب). في 30 ميكرون سمك الأنسجة شعاع الليزر لا تخترق thic الكاملkness يمكن لهذا النسيج، والقضاء على أي ملوثات المحتملين من الدعم المجهر. تطبيع للكربون 23 يمكن أن تستخدم لتصحيح التفاوت في كمية الأنسجة ذاب. تعيين هذه المعلمات كما الافتراضي لكل خط لاحق عن طريق اختيار زر الاختيار "الافتراضي".
    3. تكرار هذا الخط ست مرات عن طريق تحديد خط الأولي، النقر بزر الماوس الأيمن واختيار "مسح مكررة. جعل يتم إجراء مقاصة بين خطوط المؤكد إما س - أو المحور Y- من قبل شعاع قطره. وهذا يعطي ما مجموعه سبعة خطوط لكل معيار، بصرف النظر متباعدة وفقا لقطر شعاع.
    4. كرر الخطوات من 3.5.1 - 3.5.3 لكل معيار، وضمان خط طول متطابقة.
  6. رسم المنطقة الاجتثاث خلال عينة، اتبع احد من اثنين من الطرق التالية:
    ملاحظة: تأكد من نفس المعلمات المسح الضوئي (شعاع قطره، سرعة المسح الضوئي، فلوينس الطاقة) وتستخدم لخطوط العينة.
    1. إذا تم تجهيز نظام LA معحقل واسع من الرأي، حدد أداة خط ورسم خط من الزاوية العليا اليسرى من العينة طويلة بما فيه الكفاية لتغطية العينة عند أوسع نقطة فيها باستخدام المعلمات الليزر نفسها المذكورة في 3.5. تكرار هذا المسح على النحو المبين في 3.5.3 مع خطوط متباعدة وفقا لشعاع قطره عدة مرات حسب الضرورة لضمان تغطية كاملة من العينة.
    2. إذا كان عرض حقل واسع غير متوفر، وتحديد وتسجيل إحداثيات X و Y (وعادة ما يظهر على الشاشة الرئيسية على النحو 'موقف المرحلة "أو ما شابه ذلك) المقابلة لزوايا المستطيل تغطي عينة بأكملها. استخدام هذه الإحداثيات لوضع خطوط متوازية الاجتثاث تغطي منطقة العينة بأكملها كما هو موضح في 3.7.1.
    3. رسم خطوط المسح المتقطع المعايير على أبعد تقدير بعد ~ 20 ساعة من مسح العينة من خلال تكرار عملية وصفها في 3.5. اعتمادا على مدة المسح من العينة أن هذا قد يكون مطلوبا عدة مرات. إنهاء التجربة مع عديمسح tional المعايير.
      ملاحظة: عند تحديد إحداثيات X و Y بينما يتم تطهير الخلية، واختيار المناصب المنزل وسوف معايرة المرتبطة محور تغيير المكتسبة سابقا تفاصيل لإحداثيات س وص في حين أن الفرق (أي طول الخط) سوف عدم التأثر.

4. إعداد البيانات وطرق حيازة لICP-MS

  1. للخط القياسية الاجتثاث، تقسيم طول الخط من سرعة المسح الضوئي ليزر لتحديد الوقت التحليل الكلي للحصول على خط واحد. كرر هذا للخط العينة.
  2. في برنامج ICP-MS، خلق طريقة جديدة (كما هو موضح هنا ك "دفعة") والتأكد من أن "الوقت تحليل حل" أو يتم تحديد ما يعادلها. حدد القيم م / ض ليتم الكشف عن، ومن ثم ضبط الوقت التكامل لكل م / ض وبالتالي فإن الوقت التكامل التام لدورة واحدة يساوي 0.25 ثانية. انقر على "حفظ الخفاشالفصل باسم 'واسم وفقا لذلك (على سبيل المثال، Std1).
    ملاحظة: كما في النموذج سوف تجتاز شعاع الليزر على أربعة أضعاف قطر شعاع، وهذا يضمن يتم تسجيل نقطة البيانات لكل كتلة يعادل شعاع قطره 12. على سبيل المثال، وذلك باستخدام 100 حجم ميكرون بقعة، وسرعة المسح الضوئي من 400 ميكرون الصورة -1 مع الوقت التكامل من 0.25 ق وإنتاج صور ذات أحجام بكسل الحقيقية. الوقت التكامل يمكن تعديلها لتحسين حساسية. عند زيادة الوقت التكامل إلى 0.33 ق سرعة المسح الضوئي يجب أن تباطأ إلى ثلاثة أضعاف قطر شعاع.
  3. للمعايير، أدخل الوقت تحليل لتفحص كل خط في المربع المناسب، بالإضافة إلى 15 ثانية إضافية لحساب الليزر الاحماء والأوقات فشل. أدخل قائمة عينة المدى (أي الترتيب الذي يتم تشغيل المسح الضوئي) مع نفس العدد من عمليات الاستحواذ (عادة مرقمة بشكل تسلسلي، أي 001، 002، الخ)، والعدد الإجمالي للخطوط القياسية.
  4. بالنسبة للعينة، تكرار الطريقة المستخدمة لالمعايير عن طريق حفظ الطريقة الحالية أو دفعة مع اسم ملف بديل، وضبط الوقت الإجمالي اكتساب (بما في ذلك 15 ثانية إضافية) وعدد من عمليات الاستحواذ، لتتناسب مع عدد الأسطر التي سوف اجتثاث العينة .
    ملاحظة: كما تستخدم معظم أنظمة LA-ICP-MS في اتجاه واحد الزناد (LA يطلق ICP-MS)، فمن الضروري أن البرنامج ICP-MS ينتظر الزناد من قبل LA خط لاحق من يبدأ الاجتثاث. سوف نافذة اكتساب ICP-MS قراءة 'تنتظر بداية ".

5. تشغيل تجربة

  1. بدء قائمة الانتظار ICP-MS بإضافة الطريقة الأولى أو دفعة إلى قائمة الانتظار، وضمان البرنامج ينتظر الزناد من النظام لوس انجليس.
  2. في البرنامج LA، تمكين التيار الكهربائي ليزر عن طريق النقر "الانبعاث"، انقر فوق "تشغيل" وضبط الوقت الودية الليزر إلى 10 ثانية والوقت فشل إلى 20 ثانية في المربعات المناسبة.
    ملاحظة: هذا التجاوزضمان ICP-MS مستعدة لبدء الحصول على البيانات الجديدة عندما تبدأ ليزر كل سطر لاحق من الاجتثاث.
  3. بدء تسلسل الليزر عن طريق النقر على 'البداية'. في حالة استخدام الخلايا في مجلدين، وضمان كوب العينة في الموقف.

6. حساب معايير الكميات

ملاحظة: هناك اختلافات متعددة لتحويل البيانات ICP-MS إلى صور. وتشمل هذه باستخدام أدوات البرمجيات المحلية الصنع مكتوبة بلغات مفتوحة المصدر 17، 24، 25، وحدات الماكرو التجارية 26 وبيانات برامج التحليل. 7 هنا، استخدام البرنامج المساعد وضعت مؤخرا برنامج (الموصوفة في بول وآخرون. 27)، استنادا إلى وكالة متخصصة LA-ICP-MS تحليل البيانات جناح 28.

  1. نقل كافة المجلدات دفعة تحتوي على البيانات المدى (001.d، 002.d، الخ.) في لكمبيوتر منفصل مع برامج التحليل تثبيت. استخراج ملفات البيانات * بتنسيق csv لكل خط من الدفعة في مجلد منفصل.
    ملاحظة: استخدام برنامج نصي لنقل تلقائيا * ملفات .csv إلى مجلد جديد ينصح بشدة. انظر كود بايثون المرفقة لمزيد من التفاصيل. لقد كتب هذا السيناريو لتناسب إما اجيلنت 7700 أو 8800 سلسلة ICP-MS، ولكن يمكن أن تعدل لتناسب ملف الإخراج من غيرها من الشركات المصنعة.
  2. فتح منصة برمجيات واتبع بالتتابع علامات التبويب لاستيراد وتحليل معايير لإنتاج صور الكمية كما هو موضح أدناه.
  3. لاستيراد البيانات من أول دفعة القياسية، اختر 'اجيلنت بتنسيق csv' ل 'نوع الملف'، 'مجلد كامل' ل 'نوع استيراد "وتأكد من أن" تنسيق التاريخ "وتتطابق مع شكل الكمبيوتر. انقر فوق "استيراد"، حدد المجلد الذي يحتوي على ملفات بتنسيق csv لأول مجموعة من المعايير، والانتقال إلى علامة التبويب "خطوط الأساس".
  4. خط الأساسطرح
    1. استخدم علامة التبويب "مختارات التلقائي '(القيادة 2) من القائمة المنسدلة تطبيق الرئيسية في شريط الأدوات، حدد" معلومات من استيراد "وانقر فوق" متابعة ".
    2. انقر فوق "تحديد الكل" ثم اختر "Baseline_1" للتكامل.
    3. لتحديد 10 ثانية الأولى من كل سطر تفحص (الموافق الوقت الاحماء ليزر)، اقتصاص البيانات عن طريق إدخال قيم الثانية '0' و '(مدة الخط - 10 ثانية)' واضغط على "أضف التكامل" (على سبيل المثال ، ل35 ق خط المسح الضوئي، إدخال قيم '0' و '25').
  5. لتحديد نموذج البيانات، استخدم علامة التبويب "مختارات التلقائي 'كما هو موضح في 6.4، ولكن اختر' OUTPUT_1 'كما التكامل. بيانات المحاصيل من بداية ونهاية كل خط القياسي لاستبعاد إشارة الخلفية (على سبيل المثال ل35 ق خط المسح، أدخل القيم '13' و '4').
  6. استبعاد قطرات في إشارة الناجمة عن possiالثقوب بلي في المعايير، في علامة التبويب "نماذج"، انقر فوق "قنوات" على الجزء العلوي الأيسر من منطقة الرسم البياني لتحديد قناة مع إشارة إلى ارتفاع نسبة الضوضاء (على سبيل المثال، C13 أو P31). تقديم مذكرة من أي انخفاض حاد في إشارة وتحديد قيمة CPS منخفضة بما فيه الكفاية التي هي دون الاختلاف طبيعي داخل العينات، ولكن مرتفعة بما يكفي لانتقاء الانخفاضات الحادة في إشارة.
  7. انقر فوق علامة التبويب "DRS 'وحدد' Baseline_Subtract 'ل' خطة للحد من البيانات الحالية. اختيار القناة من 6.6 ل 'قناة مؤشر' وقيمة CPS ل 'عتبة لاستخدامها عند اخفاء إشارات منخفضة. إدراج قيمة <0.5 ق ل 'ثانية إلى تقليم قبل / بعد الإشارات المنخفضة "لحساب التأخير في نقل الإشارات من الليزر إلى ICP-MS.
  8. لتأكيد اخفاء كاف من المناطق إشارة منخفضة، انقر فوق العودة إلى علامة التبويب "عينات"، وحدد قناة أثر المصنعة (على سبيل المثال، Fe56_CPS). كرر وصقل CPS و & #39؛ ثانية إلى تقليم قبل / بعد القيم إشارات منخفضة "كما هو الحال في 6.7 إذا لزم الأمر.
  9. انقر فوق علامة التبويب "نتائج" ثم اختر "تصدير البيانات" من القائمة المنسدلة تطبيق الرئيسية. أدخل اسم ملف لإنشاء ملف بيانات جداول النتائج (على سبيل المثال، حسابات Std1، Std2 ...).
  10. فتح ملف البيانات في برنامج جدول بيانات مناسبة وحساب القيم CPS لكل قناة على حدة إلى أن quantitated. استخدام تراكيز المعادن محددة سلفا من الحل بالإرذاذ ICP-MS إلى حساب معامل التحويل من القيم CPS إلى جزء في المليون (ميكروغرام ز -1) لكل عنصر قياس الكمي.
  11. كرر الخطوات من 6،3-6،10 لجميع مجموعات من المعايير في التشغيل.

7. بناء الصور الكمية

  1. إرسال "بيولايت () 'في موجه الأوامر لفتح البرنامج.
  2. استيراد بيانات العينة بواسطة الضغط على 'تحميل الصور "واختيار المجلد الذي يحتوي على ملفات بتنسيق csv FOص صورة عينة.
  3. تصحيح الخلفية
    1. انقر فوق علامة التبويب "خطوط الأساس" لتطبيق تصحيح الخلفية للعينة. على الفوسفور (P31) صورة دفعت على الشاشة، ومناطق مختارة من الخلفية باستخدام أداة رسم المستطيل. اختيار العديد من ممكن من المناطق يخلق خريطة واسعة صورة إشارة الانجراف / البلازما لضمان التعويض المناسب من هذه العوامل المربكة.
    2. لجعل إشارة الخلفية أكثر وضوحا، حدد أداة الرسم البياني تحرير (أعلى اليسار من الصورة المعروضة)، وانقر على الحق في الصورة. اختر "تعديل صورة المظهر" وتغيير "اللون الأولى في Z = 'إلى قيمة سالبة كبيرة (على سبيل المثال -100،000). المضي قدما بالنقر على "تم".
  4. انقر علامة التبويب "معايير" لإحضار الجدول لعوامل التصحيح CPS / جزء في المليون. أدخل القيم المحسوبة من المعايير في خطوة 6.10 لكل من العناصر. وهذه الخطوة تساعد على تصحيح الانحراف حساسية في ICP-MS. انقر على "العودة! "
  5. فتح 'متصفح البيانات "من علامة التبويب" البيانات "، التي تتولى الصور لكل عنصر وكل خطوة.
  6. لوضع اللمسات الأخيرة صورة للتصدير، حدد الصورة المطلوبة في المجلد "StdCorrImages" انقر بزر الماوس الأيمن فوق اسم الصورة (* _ppm) وانقر على 'NewImage ". انقر بزر الماوس الأيمن على الصورة لفتحها 'تعديل صورة المظهر في اختيار المرجوة الجدول لون ولون الحجم. إضافة نطاق ألوان الصورة بالنقر بزر الماوس الأيمن فوق الصورة واختيار "إضافة الشرح. اختر 'ColorScale' من القائمة المنسدلة أعلى اليسار واستخدام علامات التبويب لتعديل نطاق اللون المطلوب.
  7. لتصدير صورة، تأكد من أن يتم تحديد الصورة في السؤال، ثم انتقل إلى علامة التبويب "ملف" على وانقر فوق "حفظ الرسومات ... '. حدد التنسيق المطلوب وحفظ الصورة. بدلا من ذلك، الصورة المحددة يمكن نقلها باستخدام نسخ ولصق الأدوات.
  8. كرر الخطوات من 7.6 و 7.7 لجميع الصور المثيرة للاهتمام.
  9. Quantifيينغ مناطق منفصلة
    1. لتفعيل أدوات العائد على الاستثمار، انتقل إلى "تحليل" علامة التبويب، "الحزم" واختر "معالجة الصور".
    2. حدد الصورة المطلوبة، ثم انتقل إلى علامة التبويب "صورة" للوانقر على 'العائد على الاستثمار ... ". انقر على "القرعة بدء العائد على الاستثمار" واستخدام أداة رسم لتحديد المنطقة ذات الاهتمام في العينة. لإنهاء الرسم، انقر فوق "إنهاء العائد على الاستثمار".
    3. للحصول على إحصاءات العائد على الاستثمار المحدد، انتقل إلى علامة التبويب "صورة" ثم انقر على "إحصائيات ... '.
    4. نسخ ولصق النتائج إلى جدول بيانات منفصلة. اختيار كرر العائد على الاستثمار (7.9.2) لجميع المناطق والعناصر المثيرة للاهتمام.

النتائج

للتدليل على قدرات هذا النهج التصوير LA-ICP-MS، تجربة بسيطة باستخدام مقطع واحد من WT C57BL / 6 مخ الفأر، شطر في الجسم الثفني ومقطوع في الطائرة الاكليلية، وتقدم. يوصف أيضا سير عمل لتحليل البيانات باستخدام بيولايت (الشكل 1)، كما هو موضح في الأقسام 6 و 7، فضلا عن تقديم صورة ممثل توزيع المعادن في قسم تحليل (الشكل 2).

كما يمكن أن يرى، وتوزيع المعادن في مخ الفأر هو متغير حسب المنطقة التشريحية. ويمكن أن يعزى ذلك إلى المعادن الأدوار المتغيرة، وبشكل أكثر تحديدا البروتينات التي لا بد أنها، ولعب في كل منطقة في الدماغ 27. على سبيل المثال، والحديد يميل إلى أن يكون تركيزات أعلى في الدماغ المتوسط ​​وعلى طول التلفيف المسنن، في حين أن الزنك هو الأكثر وفرة في كورتيالمناطق كال. الكربون، وهو معيار الداخلية التي تستخدم عادة 8، يتم توزيع متجانس. خرائط عنصري (الشكل 2) يمكن أن يكون مفيدا بشكل خاص عندما تستخدم بالاقتران مع الأطالس المرجعية القائمة التشريحية والوظيفية 29، حيث من المعلومات عن colocalization من المعادن يمكن التعبير عن البروتينات ملزمة معدنية معينة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة وظيفة المعادن داخل الدماغ المنطقة، أو التغيرات في مستويات المعادن في خط مع جزيء حيوي المتعلقة بالأمراض التي تم تحديدها. باستخدام النهج المبين، الذي هو الأمثل لمجموعة واسعة من التحاليل، لا يحول دون حساسية لعناصر منخفضة وفرة مثل المنغنيز، ويمكن تكييفها طرق للتركيز في المقام الأول على هذه تحليلها عن طريق زيادة مرات يسكن على حساب الجماهير المقاسة الأخرى.

والميزة الرئيسية في استخدام التصوير بواسطة LA-ICP-MS يراقب الاختلافات النسبية في concentr المعادنأوجه والتوزيع بين المجموعات التجريبية. لقد كانت تستخدم في السابق مثل هذه التقنية لإثبات زيادة الحديد بعد إهانة عصبي محاكاة PD 2، 10، والتغيرات في مستويات الحديد القشرية في الأنسجة مرض الزهايمر البشري 21. مثل هذا البروتوكول كما هو موضح هنا يمكن أن تتكيف بسهولة مع أي نوع الأنسجة الأخرى مع تعديلات طفيفة على الطرق المذكورة.

figure-results-1
الشكل 1: سير العمل لمعالجة الصور. سير العمل مكملة لأقسام 6 و 7، والتي تصور تحويل البيانات في الوقت الخام حلها من ICP-MS إلى صور الكمية لتوزيع المعادن في مخ الفأر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: توزيع عنصري نموذجي Biometals داخل دماغ الفأر. خرائط عنصر تمثيلية من قسم الاكليلية 30 ميكرون سميكة من نصف الكرة دماغ الفأر واحدة تحليلها مع LA-ICP-MS. صور لمدة 13 الكربون (C13)، المغنيسيوم 24 (Mg24) والفوسفور 31 (P31) المعروضة في موازين الذهب اللون (التهم في الثانية الواحدة. CPS) (الصف العلوي). الصور الكمية (الصف السفلي) لالمنغنيز-55 (Mn55)، النحاس-63 (Cu63)، الحديد 56 (Fe56) والزنك-66 (Zn66) عرض مع المقابلة مقاييس الألوان BlueHot (ميكروغرام ز -1). كان مجموع الوقت تحليل لقسم المخ ما يقرب من 5 ساعات. شريط مقياس = 2 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

كود التكميلية ملف 1. المفتوح شفرة المصدر بيثون هو موضح في 6.1، والتي يمكن تعديلها باستخدام محرر بيثون المناسب وفقا لطريقة ICP-MS المصنعة من إخراج البيانات. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

المعادن التصوير في الأنسجة العصبية هي مجرد مثال واحد عن كيفية هذا البروتوكول يمكن أن توفر معلومات مفيدة عن التوزيع وكميات من المعادن في أي مصفوفة البيولوجية. على الرغم من أن إعداد مواد مرجعية معيارية يمكن أن يكون شاقا، هو التجربة التي لا يمكن أن يؤديها مرة واحدة وحفظها لاستخدامها لاحقا.

LA-ICP-MS لديها بعض المزايا على طرق بديلة، مثل القائم على السنكروترون الأشعة السينية مضان المجهر، ومعظمهم من حيث سهولة الوصول والحساسية. ومع ذلك، هناك بعض العيوب التي يجب أخذها في الاعتبار عند إعداد التجربة باستخدام LA-ICP-MS، وعلى هذا النحو هو في كثير من الأحيان تقنية تكميلية مفيدة للتصوير الكيميائية التي تشمل تقنيات تحليل المعادن البديلة، فضلا عن الكيمياء النسيجية المقارن 5.

التوافق مع الخصائص التشريحية المعروفة للدماغ الفأر يمكن أن توفر معلومات مفيدة عن relati وظيفي ممكنonship بين مستويات المعادن والتوزيع المكاني. سابقا، وقد استخدمنا ألين الدماغ أطلس الموارد على شبكة الإنترنت، 29 وهو مستودع الوصول المفتوح من كلا البيانات التعبير التشريحية والجينات في مخ الفأر C57BL / 6 لدراسة الارتباط المكاني من كلا التعبير انزيم التي تعتمد على المعادن 14 والتشريح 27، 30. الموارد الأخرى، مثل منضدة القوارض الدماغ 31 متوفرة للمساعدة في التسجيل والمواءمة بين الصور المعادن للمساعدة في تحديد الصحيح من توزيع المعادن في المناطق التشريحية غالبا ما تكون صغيرة أيضا.

تطبيقات هذه التقنية مفيدة في تقييم مستويات كيف معدنية وتغير التوزيع في الميكروسكيل في جميع أنحاء كل أحداث الحياة العادية (على سبيل المثال، الشيخوخة) وفي الحالات المرضية. وكذلك دراسة تأثير كل من المركبات المحتوية على المعادن والأدوية المصممة لاستهداف ليتل الأيض. القيود الرئيسية الحالية للLA-ICP-MS باعتبارها تقنية التصوير لتقييم مكانيا توزيع المعادن والإنتاجية والحساسية. هناك علاقة تبادلية بين سرعة التحليل والقرار المكانية 5، 12، مع صور عالية الدقة تتطلب الأوقات تحليل أطول. هذه التقنية هي مناسبة تماما لعناصر بيولوجية في تركيزات أعلى، على الرغم من تقييد العناصر مثل المنغنيز والكوبالت والسيلينيوم وذلك بسبب وفرة منخفضة في الأنسجة الطبيعية و / أو القيود في الكشف عنها من قبل التقليدي ICP-MS. التطورات الجديدة في مجال التكنولوجيا ICP-MS، مثل إدخال تحليل كتلة الثلاثي رباعية، والسماح للكشف المستهدفة من التحاليل الصعبة، مثل السيلينيوم 32 في الحساسيات أعلى 33. كإجراء المعتمدة على التكنولوجيا، والتقدم في كل من ليزر وتصميم مطياف الكتلة سوف نرى هذا التصوير تقنية تستمر في التطور، وزيادةسرعة تحليل وحساسية 34.

الإفصاحات

RWH و COC هما موظفان مدفوعان في ESI Ltd. FF و TPH هما موظفان رواتبهم في Agilent Technologies Australia.

شكر وتقدير

معتمدة DJH وPAD من قبل مشروع المجلس الاسترالي للبحوث الربط (LP120200081) مع اجيلنت تكنولوجيز وESI المحدودة مساهمة BK كان مدعوما من جامعة الرور بحوث مدرسة PLUS، بتمويل من مبادرة التميز في ألمانيا [DFG GSC 98/3]. وقد DJH دعما جزئيا من قبل مؤسسة Ramaciotti. ويدعم KK من قبل مؤسسة سيجريد جوسيليوس.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
شرائح مجهر زجاج الصوداn / an / aالشرائح النموذجية مناسبة لجميع التجارب
شفرات ميكروتوم مطلية ب PTFECL StuckeyDT315R50يعتمد حجم الشفرة على حامل شفرة ناظم البرد. تحقق قبل الطلب.
بارافومالديهايد (PFA)سيجما ألدريتش16005أي مورد مناسب
للسكروزن / أن /أ سكر أبيض من الدرجة التجارية مناسب
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)Sigma-AldrichP5368مخلوطة مسبقا مدرجة ، يمكن تحضيرها وفقا لبروتوكولات المختبر العادية
زيلينسيجما ألدريتش247624أي مورد مناسب
الإيثانولسيجما-ألدريتشE7023أي مورد مناسب
لدماغ الضأنن / أن / أمتاح من معظم الجزارين المحليين أملاح
معدنيةالماء ، واستخدم الأملاح المعدنية القابلة للذوبان في الماء التي تحتوي على التحليلات المرغوبة
Omni TH Tissue HomogeniserOmni IncTHP115المجانسات البديلة مناسبة
مجسات مبشرات البولي كربوناتوحدة هضم الميكروويف OmniInc TH115-PCRH
n / an / aاختياري. انظر القسم 2
أنابيب ميكروفوج سعة 1.5 ملTechnoPlasP4010أنابيب البولي بروبلين الخالية من المعادن. الأنابيب المغسولة بالحمض مناسبة أيضا
65٪ حمض النيتريكميرك ميليبور100441تحليل التتبع
درجة 30٪ بيروكسيد الهيدروجينسيجما ألدريتش95321تحليل التتبع الصف
10 × 10 مم قوالب التبريد التي يمكن التخلصمنها تيد بيلا27181
إيزوبنتانسيجما ألدريتش76871
النيتروجين السائلن / أغيرمتاح للاستخدام المورد المحلي
NWR213 نظام الاستئصال بالليزرESI Ltdn / aالمستخدمة في هذه التجارب. الشركات المصنعة الأخرى مناسبة, قد تتطلب تعديلات على بروتوكول
Agilent 8800 Series ICP-MSAgilent Technologiesغيرمستخدمة في هذه التجارب. الشركات المصنعة الأخرى مناسبة, قد تتطلب تعديلات على بروتوكول
IoliteIolite Softwaren / aمتاح من http://iolite-software.com/. تتوفر طرق أخرى ، راجع بروتوكول
ExcelMicrosoftn / a
IGOR ProWave Metricsn / aAvalable من https://www.wavemetrics.com/products/igorpro/igorpro.htm
أكياس غير متوفرة في

المراجع

  1. Barnham, K. J., Bush, A. I. Biological metals and metal-targeting compounds in major neurodegenerative diseases. Chem Soc Rev. 43 (19), 6727-6749 (2014).
  2. Hare, D. J., Double, K. L. Iron and dopamine: a toxic couple. Brain. 139 (4), 1026-1035 (2016).
  3. Savory, J., Herman, M. M. Advances in instrumental methods for the measurement and speciation of trace metals. Ann Clin Lab Sci. 29 (2), 118-126 (1999).
  4. New, E. J. Tools to study distinct metal pools in biology. Dalton Trans. 42 (9), 3210-3219 (2013).
  5. Hare, D. J., New, E. J., de Jonge, M. D., McColl, G. Imaging metals in biology: balancing sensitivity, selectivity and spatial resolution. Chem Soc Rev. 44 (17), 5941-5958 (2015).
  6. Pozebon, D., Scheffler, G. L., Dressler, V. L., Nunes, M. A. G. Review of the applications of laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (LA-ICP-MS) to the analysis of biological samples. J Anal At Spectrom. 29 (12), 2204-2228 (2014).
  7. Becker, J. S., Zoriy, M. V., Dehnhardt, M., Pickhardt, C., Zilles, K. Copper, zinc, phosphorus and sulfur distribution in thin section of rat brain tissues measured by laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry: possibility for small-size tumor analysis. J Anal At Spectrom. 20 (9), 912(2005).
  8. Hare, D. J., Austin, C., Doble, P. Quantification strategies for elemental imaging of biological samples using laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. The Analyst. 137 (7), 1527-1537 (2012).
  9. Hare, D. J., Lear, J., Bishop, D., Beavis, A., Doble, P. A. Protocol for production of matrix-matched brain tissue standards for imaging by laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Anal Meth. 5 (8), 1915-1921 (2013).
  10. Hare, D. J., et al. Quantitative elemental bio-imaging of Mn, Fe, Cu and Zn in 6-hydroxydopamine induced Parkinsonism mouse models. Metallomics. 1 (1), 53(2009).
  11. Potter, D. A commercial perspective on the growth and development of the quadrupole ICP-MS market. J Anal At Spectrom. 23 (5), 690(2008).
  12. Lear, J., Hare, D. J., Adlard, P., Finkelstein, D., Doble, P. Improving acquisition times of elemental bio-imaging for quadrupole-based LA-ICP-MS. J Anal At Spectrom. 27 (1), 159(2012).
  13. Matusch, A., et al. Cerebral bioimaging of Cu, Fe, Zn, and Mn in the MPTP mouse model of Parkinson's disease using laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (LA-ICP-MS). J Am Soc MAss Spectrom. 21 (1), 161-171 (2010).
  14. Hare, D. J., et al. An iron-dopamine index predicts risk of parkinsonian neurodegeneration in the substantia nigra pars compacta. Chem Sci. 5 (6), 2160-2169 (2014).
  15. Portbury, S. D., Hare, D. J., Sgambelloni, C., Finkelstein, D. I., Adlard, P. A. A time-course analysis of changes in cerebral metal levels following a controlled cortical impact. Metallomics. 8 (2), 193-200 (2016).
  16. Theiner, S., et al. LA-ICP-MS imaging in multicellular tumor spheroids - a novel tool in the preclinical development of metal-based anticancer drugs. Metallomics. 8, 398-402 (2016).
  17. Niedzwiecki, M. M., et al. A multimodal imaging workflow to visualize metal mixtures in the human placenta and explore colocalization with biological response markers. Metallomics. 8, 444-452 (2016).
  18. Austin, C., et al. Barium distributions in teeth reveal early-life dietary transitions in primates. Nature. 498 (7453), 216-219 (2013).
  19. Hare, D. J., et al. The effect of paraformaldehyde fixation and sucrose cryoprotection on metal concentration in murine neurological tissue. J Anal At Spectrom. 29, 565-570 (2014).
  20. Dodt, H. -U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Meth. 4 (4), 331-336 (2007).
  21. Hare, D. J., et al. Laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry imaging of white and gray matter iron distribution in Alzheimer's disease frontal cortex. NeuroImage. 137, 124-131 (2016).
  22. Günther, D., Heinrich, C. Enhanced sensitivity in laser ablation-ICP mass spectrometry using helium-argon mixtures as aerosol carrier. J Anal At Spectrom. 14 (9), 1363-1368 (1999).
  23. Austin, C. A., et al. Factors affecting internal standard selection for quantitative elemental bio-imaging of soft tissues by LA-ICP-MS. J Anal At Spectrom. 26 (7), 1494-1501 (2011).
  24. Hare, D. J., et al. Three-dimensional elemental bio-imaging of Fe, Zn, Cu, Mn and P in a 6-hydroxydopamine lesioned mouse brain. Metallomics. 2 (11), 745-753 (2010).
  25. Osterholt, T., Salber, D., Matusch, A., Becker, J. S., Palm, C. IMAGENA: Image Generation and Analysis - An interactive software tool handling LA-ICP-MS data. Int J Mass Spectrom. 307 (1-3), 232-239 (2011).
  26. Uerlings, R., Matusch, A., Weiskirchen, R. Reconstruction of Laser Ablation Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (LA-ICP-MS) Spatial Distribution Images in Microsoft Excel 2007. Int J Mass Spectrom. 395, 27-35 (2015).
  27. Paul, B., et al. Visualising mouse neuroanatomy and function by metal distribution using laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry imaging. Chem Sci. 6 (10), 5383-5393 (2015).
  28. Paton, C., Hellstrom, J., Paul, B., Woodhead, J., Hergt, J. Iolite: Freeware for the visualisation and processing of mass spectrometric data. J Anal At Spectrom. 26 (12), 2508(2011).
  29. Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
  30. Hare, D. J., et al. Three-dimensional atlas of iron, copper, and zinc in the mouse cerebrum and brainstem. Anal Chem. 84 (9), 3990-3997 (2012).
  31. Hjornevik, T., et al. Three-dimensional atlas system for mouse and rat brain imaging data. Frontiers Neuroinform. 1, 4(2007).
  32. Bishop, D. P., et al. Elemental bio-imaging using laser ablation-triple quadrupole-ICP-MS. J Anal At Spectrom. 31 (1), 197-202 (2016).
  33. Balcaen, L., Bolea-Fernandez, E., Resano, M., Vanhaecke, F. Inductively coupled plasma - tandem mass spectrometry (ICP-MS/MS): a powerful and universal tool for the interference-free determination of (ultra)trace elements - a tutorial review. Analytica Chimica Acta. 894, 7-19 (2015).
  34. Van Malderen, S. J. M., Managh, A. J., Sharp, B. L., Vanhaecke, F. Recent developments in the design of rapid response cells for laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry and their impact on bioimaging applications. J Anal At Spectrom. 31, 423-439 (2016).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة