مقالة منهجية

نموذج للمحيط بالعصب الغزو في الرأس والرقبة قشري سرطان الخلايا

DOI:

10.3791/55043

⸱

يناير 5, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Otolaryngology, University of Pittsburgh Medical Center, 2University of Pittsburgh Cancer Institute, Hillman Cancer Center

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الغزو حول العصب (PNI) هو سمة شائعة لسرطان الخلايا الحرشفية في الرأس والرقبة (HNSCC) ، مما يمنح معدلات بقاء أقل. آلياته غير مفهومة جيدا. باستخدام الخلايا العصبية المتولدة من العقد الجذرية الظهرية للفئران المحصورة في مصفوفة شبه صلبة ، يمكن التحقيق في المسارات المتضمنة في PNI لخطوط خلايا HNSCC.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
تم العثور على < p class = 'jove_content'> الغزو حول العصب (PNI) في حوالي 40٪ من سرطان الخلايا الحرشفية في الرأس والرقبة (HNSCC). على الرغم من العلاج متعدد الوسائط بالجراحة والإشعاع والعلاج الكيميائي ، تحدث التكرارات الموضعية والنقائل البعيدة بمعدلات أعلى ، وينخفض البقاء على قيد الحياة بشكل عام بنسبة 40٪ مقارنة ب HNSCC بدون PNI. كانت الدراسات المختبرية للمسارات المتضمنة في HNSCC PNI تمثل تحديا تاريخيا نظرا لعدم وجود اختبار متسق وقابل للتكرار. الموصوف هنا هو تكييف مقايسة عقدة الجذر الظهري (DRG) لفحص PNI في HNSCC. في هذا النموذج ، يتم حصاد DRG من العمود الفقري للفأر العاري الذي تم التضحية به ووضعه داخل مصفوفة شبه صلبة. خلال الأيام اللاحقة ، يتم إنشاء الخلايا العصبية وتنمو في نمط شعاعي من أجسام خلايا DRG. ثم يتم وضع خطوط خلايا HNSCC محيطيا حول المصفوفة وتغزو بشكل تفضيلي على طول الخلايا العصبية باتجاه DRG. تسمح هذه الطريقة بالتقييم السريع لحالات العلاج المتعددة ، مع معدلات نجاح عالية جدا في الفحص وقابلية التكاثر.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

سرطان الخلايا الحرشفية في الرأس والرقبة (HNSCC) هو سادس أكثر أنواع السرطان شيوعا في الولايات المتحدة ، حيث يبلغ عدد الوفيات 10,000 سنويا على المستوى الوطني و 300,000 حالة وفاة سنويا في جميع أنحاءالعالم 1. ظل التشخيص العام ل HNSCC دون تغيير عند 50٪ على مدى العقود العديدة الماضية. يعد الغزو حول العصب (PNI) أحد أبرز السمات المرضية التي تنذر بتشخيص ضعيف لدى المرضى الذين يعانون من HNSCC. لسوء الحظ ، يعد PNI أمرا متكررا في HNSCC ويمكن العثور عليه في ما يصل إلى 40٪ من مرضى HNSCC2،3.

PNI هي العملية التي تتعقب من خلالها الخلايا الخبيثة على طول الأعصاب إلى الأنسجة المجاورة ، مما يسمح بمعدلات أعلى من الانتشار المحلي والبعيد. وفقا لذلك ، فإن أورام HNSCC الإيجابية PNI لديها معدلات أعلى من التكرار الموضعي والنقائل البعيدة ، مما يؤدي إلى انخفاض البقاء على قيد الحياة بشكل عام مقارنة بمرضى HNSCC بدون PNI4-8.

< p class = 'jove_content'> على الرغم من أن علاج المرضى الذين يعانون من PNI عادة ما يتم تعظيمه من خلال استخدام الجراحة والإشعاع والعلاج الكيميائي ، إلا أن معدلات البقاء على قيد الحياة الإجمالية لهؤلاء المرضى لا تزال تنخفض بنسبة تصل إلى 40٪ مقارنة بالمرضى الذين لا يعانون من PNI9-11. وبالتالي ، من الواضح أن طرائق العلاج الحالية ل HNSCC غير فعالة في تحسين التشخيص السلبي المرتبط ب PNI. تم إعاقة نهج تطوير العلاج الموجه ضد PNI في HNSCC بسبب سوء فهم العوامل التي تنظم هذه العملية. هذا ، جزئيا ، نتيجة لعدم وجود نموذج متسق في المختبر لدراسة PNI في HNSCC.

في السنوات الأخيرة ، استخدمت العديد من المجموعات نموذجا في المختبر لدراسة PNI في سرطانات البنكرياس والبروستاتا فيالغالب 12-19. يستخدم هذا النموذج الخلايا العصبية المتولدة من العقد الجذرية الظهرية المعزولة من الفئران أو الفئران كبديل لغزو الأعصاب الكبيرة. يتم تثبيت العقد الجذرية الظهرية في مصفوفة شبه صلبة مستنفدة من العوامل ، وهي عبارة عن خليط بروتين غشاء القاعدي قابل للذوبان تفرزه خلايا ساركوما الفأر Engelbreth-Holm-Swarm. تسمح هذه المصفوفة بنمو الخلايا العصبية وتتبع الخلايا السرطانية المفردة على طول هذه الخلايا العصبية. الموصوف هنا هو تكييف هذا النموذج لفحص PNI في HNSCC.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد متوسطة الثقافة وأطباق (10 دقيقة)

  1. إضافة 100 ميكرولتر من Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) إلى آبار لوحة-V القاع 96-جيدا.
  2. إزالة aliquoted ما قبل-قنينة ما يقرب من 100 ميكرولتر من المصفوفة نصف صلبة من الفريزر 20 ° C ووضعه مباشرة على الجليد.
    ملاحظة: هل هذا قبل العقدة الجذرية الظهرية (DRG) الحصاد لأن المصفوفة نصف صلبة تأخذ تقريبا 30 دقيقة للوصول إلى حالة سائلة على الجليد، وهو أمر ضروري لخطوات لاحقة. والفشل في الحفاظ على مصفوفة نصف صلبة على الجليد في جميع الأوقات ينتج مصفوفة ذات نوعية رديئة قطرة.
  3. التسمية الزجاج القاع الثقافات لوحات بالحبر الدائم، وخلق معرفات فريدة من نوعها في كل من الزوايا الأربع على السطح السفلي من لوحة. وضع لوحات اليمين حتى الجانب على الجليد لتبريد سطح اللوحة.
    ملاحظة: عائدات كل الماوس 32-40 DRG، لذلك تسمية لهم من 1 إلى 40. وليس من الضروري لمرحلة ما قبل البرد بيالحيوانات الأليفة النصائح، ونصائح المثلجة والحارة على مدار وضع قطرات مصفوفة، ويحتمل أن إدخال الاختلافات في اتساق المصفوفة.

2. تشريح الفئران DRG (45 دقيقة)

  1. الموت ببطء ماوس عارية athymic حسب البروتوكولات مختبر معينة، وذلك من خلال استخدام غرفة CO 2 وبضع الصدر.
  2. إعداد منطقة تشريح والمجهر. استخدام السفلي نظيفة، معقمة، وشقة الحاويات البوليسترين ل15- أو أنابيب مخروطية 50 مل.
    ملاحظة: بالإضافة إلى ذلك، فهي مناسبة للاستخدام على سطح تشريح، كما أنها غير مكلفة، يمكن التخلص منها، والسماح لتثبيت العمود الفقري باستخدام دبابيس أو الإبر. فقط استخدام الأدوات والإبر المعقمة.
  3. تحت الرؤية الطبيعية، وجعل شق طولي على طول العمود الفقري من جذر الذيل في الرأس من الفأرة مع زوج من مقص غرامة مستقيمة أو منحنية.
  4. استخدام نفس المقص لفرق مستعرض تحت sacrآل العمود الفقري. تشريح جانبي العمود الفقري وصولا إلى قاعدة الجمجمة باستخدام المقص. عند هذه النقطة، تأكد من أن العمود الفقري العنقي ومقطوع cranially إلى أقصى حد ممكن مع مقص.
  5. نلاحظ نهاية عنق الرحم العمود الفقري تحت المجهر التشغيل في الطاقة المنخفضة. الحبل الشوكي الأبيض هو واضح في منتصف حلقة العظمية، والتي تحيط بها كميات متفاوتة من عضلات محيطة بالنخاع والأنسجة اللينة.
  6. تقسيم الظهرية أو الجانب العلوي من الأولى 2 - الهيئات 3 الفقري مع مقص الربيع المجهرية. باستخدام إجراء الربيع من مقص، فتح هذا عظمي الأولي قطع للتأكد من أن تشريح الجسم الفقري وقع في خط الوسط. تواصل بزيادات صغيرة نحو العمود الفقري المقدسة، ثم شطر العمود الفقري من خلال استكمال تخفيضات مماثلة على الجانب البطني أو أدنى من الهيئات الفقري.
    ملاحظة: فشل لضمان تشريح خط الوسط من العمود الفقري عظمي سيؤدي إلى العائد DRG أقل.
  7. في ثيالصورة النقطة، يتم تقسيم العمود الفقري إلى نصفين. مكان واحد نصفي العمود الفقري جانبا، مع الحبل الشوكي في مكان وأسفل على لوحة العقيمة.
    ملاحظة: إن ترك الحبل الشوكي في مكان منع DRGs من الجفاف، كما DRGs هي عميقة إلى الحبل الشوكي.
  8. تأمين حد سواء من الآخرين نصفي العمود الفقري مع اثنين من الإبر عيار 18 على منصة البوليسترين تشريح. ابتداء من نهاية عنق الرحم (والذي هو واضح لأن العمود الفقري أضيق، وDRG هي أقرب إلى بعضها البعض، وهناك الإدراج الضلع)، قشر بلطف ذهابا والحبل الشوكي من حوالي 4 مستويات الفقري.
  9. مراقبة الأعصاب الحسية (عادة اثنين) الذي يربط بين DRG. في المنطقة حيث أعصاب تضاف إلى DRG، فهم بلطف اللفافة المحيطة بها مع ملقط المجهرية. تشريح وتقليم هذه اللفافة والأنسجة العصبية الأخرى مع مقص الربيع مجهرية لتحرير DRG. وتراجع لطيف يجلب DRG الخروج من مركزها في العمود الفقري عظمي.
    ملاحظة: زيادةقوة المجهر في هذه الخطوة هو مفيد. سحق إصابة DRG سوف تحد بشكل كبير من نمو neurites التي. يتم تجنب هذا عن طريق أبدا استيعاب DRG مباشرة، ولكن بدلا من استيعاب اللفافة المحيطة بها.
  10. قطع الأعصاب الطرفية (في DRG ديه عموما الأعصاب الطرفية واحد، وهو عميقة بالنسبة إلى عرض تشريح) مع مقص الربيع المجهرية للافراج عن DRG.
    ملاحظة: من الأسهل للتأكد حيث ينتهي العصبية وDRG يبدأ أثناء التوتر، مما يجعل هذا الخفض في أقرب وقت ممكن إلى DRG في هذه المرحلة هو المثل الاعلى. مرة واحدة يتم قطع هذا الفرع البعيدة، يتم قطع الفروع القريبة أيضا.
  11. تقليم DRG من أي الألياف العصبية الضالة أو المرفقات اللفافي مع مقص الربيع المجهرية. بعد عزل كافية، ضع DRG في المتوسط ​​درجة حرارة الغرفة ضمن لوحة-V القاع 96-جيدا.
    ملاحظة: وضع خلفية داكنة تحت لوحة يجعل تصور شبه ملم DRGs البيضاء أسهل. المكان الوحيد DRG واحد في مجموعة شرق افريقياح جيدا. بهذه الطريقة، يمكن أن تمثل أكثر سهولة في الخطوات اللاحقة.
  12. كرر هذه العملية على طول الطريق واحد نصفي العمود الفقري وثم من جهة أخرى. كل جانب غلة 16-20 DRGs، بلغ مجموعها 32 - 40.
    ملاحظة: إذا كان هناك DRGs أقل من هذا، تشريح العمود الفقري يجب أن تنفذ المزيد من رأسيا و / أو caudally. وDRGs تصبح على نحو متزايد تعريف أقل كذلك العائدات واحد caudally.

3. إعداد مصفوفة شبه الصلبة قطرات (<1 دقيقة لكل لوحة)

  1. إزالة كوب واحد لوحة القاع جيدا من الثلج ووضعه على كتلة الجليد تحت المجهر التشغيل. تأكد من أن قسامة من مصفوفة تبقى على الجليد في جميع الأوقات.
  2. وضع قطرات 1.5 ميكرولتر من المصفوفة في كل من الزوايا الأربع من لوحة من الزجاج السفلي مع 2 ميكرولتر أو 10 ميكرولتر micropipetter، وترك مسافة لا تقل كبيرة مثل قطرات نفسه من حافة الزجاج جيدا.
    1. مكان غيض من ماصة مباشرة علىالزجاج في زاوية 45 درجة. ببطء الماصة المصفوفة. تحرك ببطء بعيدا عن أسفل الزجاج بعد تعمل المصفوفة على لوحة.
      ملاحظة: التوتر السطحي بين المصفوفة والزجاج يجب إنشاء نصف الكرة الكمال في كل مرة.
    2. وقف pipetting للتو قبل طرف فارغ، لأن حقن غير مقصود من الهواء إلى قطرة مصفوفة يجعل قطر الحبرية مصفوفة أكبر بكثير ويصعب إزالتها.
      ملاحظة: استخدام اليد الثانية لتحقيق الاستقرار من ناحية pipetting ليسهل موضع أكثر دقة.

4. الإدراج من DRG في شبه الصلبة مصفوفة قطرات (<2 دقيقة لكل لوحة)

  1. ترك لوحة مع قطرات مصفوفة لفترة وجيزة في درجة حرارة الغرفة (~ 1 دقيقة). هذا تصلب قليلا المصفوفة، مما يجعل من الأسهل لوضع دقيق للDRG.
  2. سكوب (ما لا يدرك) وDRG بلطف مع ملقط المجهرية مغلقة في اليد اليسرى. مرة أخرى، على خلفية مظلمة ضد صغير، أبيضDRG يسهل التصور. نقل DRG لغيض من إبرة عيار 21 في اليد اليمنى. وهذا النقل ترك وسائل الاعلام المتبقية على ملقط.
  3. إدراج بلطف DRG في وسط الحبرية مصفوفة باستخدام إبرة عيار 21 (الشكل 1). في معظم الوقت، فإن DRG الافراج بسهولة في مصفوفة ثم يمكن وضعه مركزيا مع الإبرة.
    1. إذا العصي DRG إلى الإبرة، واستخدام ملقط المجهرية لدفع DRG الخروج من إبرة وفي قطرة المصفوفة. الفتيل وسائل الإعلام الزائدة بعيدا عن ملقط المجهرية مع مختبر مسح.
      ملاحظة: إدخال وسائل الإعلام إلى مصفوفة تغيير القطر، وحجم، واتساق الفحص. كتلة الجليد مع اللون أو الكتابة الملونة يوفر تباين الخلفية، التي تخفف من التصور لهذه العملية الحساسة.
  4. بعد لوحة لديه كل DRGs أربعة، إجراء التفتيش النهائي للتأكد من أن DRG هو في وسط الحبرية المصفوفة. إجراء تعديلاتحسب الحاجة مع إبرة 21 GUAGE.
  5. نقل لوحة الانتهاء إلى 37 درجة مئوية الحاضنة. هذا وسوف يصلب مصفوفة نصف صلبة وإصلاح DRG في الموقف.
  6. كرر هذه العملية لجميع DRGs. وضع قطرات مصفوفة فارغة بدون DRG كما سيطرة سلبية.
  7. إضافة 4 مل من DMEM مع 10٪ سائل الإعلام FBS إلى كل لوحة من الزجاج السفلي بعد الانتهاء من جميع لوحات وتعريضهم إلى 37 درجة مئوية الحاضنة لمدة 3 دقائق على الأقل. وضع لوحة في زاوية طفيف وإضافة ببطء المتوسط، بحيث يأتي تدريجيا في اتصال مع وحدات مصفوفة DRG.
    ملاحظة: إذا تم إضافة وسيلة بسرعة كبيرة جدا أو بقوة، المصفوفة و / أو DRG يمكن أن تخلع.
  8. تخزين فحوصات في الحاضنة 37 درجة مئوية لالقادمة 48-72 ساعة.
    ملاحظة: الفحص الدوري للفحوصات تظهر ثمرة كفافي من neurites التي نحو حافة مصفوفة (الشكل 2). عندما neurites التي هي أكبر من ثلاثة أرباع الطريق إلى مصفوفة، فإنههو مناسب لوحة الخلايا.

5. إعداد الرأس والرقبة خلايا السرطان

ملاحظة: خطوط خلية أخرى من الرأس والرقبة الحرشفية الخلايا سرطان الخلايا يمكن استخدامها في هذا التصميم التجريبي.

  1. الحفاظ على خطوط الحرشفية سرطان الخلايا خلية في DMEM مع FBS 10٪ في قوارير المفضل أو أطباق الثقافة في الحاضنة 37 درجة مئوية. لإعداد الخلايا لإجراء التجارب، وشفط كل وسيلة من القارورة ثقافة أو طبق، وأغسلها مرتين مع برنامج تلفزيوني. تعليق الخلايا عن طريق إضافة كمية مناسبة من 0.025٪ التربسين لمدة 5 دقائق، تليها DMEM مع FBS 10٪. ماصة 4 مل من خلية وسائل الإعلام الخليط في أطباق ثقافة 6 مل.
    ملاحظة: لوحة الثقافة 6 مل توفر أكثر من كافية الخلايا، حتى عندما يكون أقل من 50٪ متموجة.
  2. كشف خطوط الخلايا HNSCC لظروف مختلفة 24 ساعة قبل تلطيخ وتصفيح على فحص DRG. إعادة إعطاء جرعات من حالة مرة واحدة ومطلي الخلايا للحفاظ على environme ثابتالإقليم الشمالي.
    ملاحظة: إضافة الأجسام المضادة، عوامل النمو، السيتوكينات، أو جزيئات أخرى إلى أطباق زراعة الخلايا 1-2 أيام بعد تشريح الفأر وزرع DRG في المصفوفة.
  3. إضافة البقع خلية الفلورسنت 1 ساعة قبل طلاء الخلايا (2 - 3 أيام بعد الحصاد DRG وغرس في المصفوفة).
    ملاحظة: بقع معينة المستخدمة هنا يمر بحرية من خلال غشاء الخلية؛ ومع ذلك، بعد التفاعل مع مجموعة ثيول داخل الخلايا، وتظل وصمة عار داخل الخلية ويتم تمرير إلى الخلايا الوليدة. تلطيخ يسهل إلى حد كبير التصور داخل المقايسات. هذه البقع مؤقتة مثالية لهذه المقايسات لأن مضان موجودا ل2-3 أيام، وهو الإطار الزمني لهذه التجارب. كما يسمح لاستخدام العديد من الألوان المختلفة، ويغني عن الحاجة لإنشاء خطوط الخلايا transfected بروتين فلوري.
    1. إعداد 10 ميكرومتر من محلول الصبغة عن طريق خلط 2 ميكرولتر من 10 ملي البقع خلية الأسهم في 2 مل من DMEM المصل خاليةلكل حالة الخلية. تدفئة هذا إلى 37 درجة مئوية قبل إضافته إلى الخلايا.
    2. إزالة مستنبت داخل لوحة 6 مل، وترك الخلايا HNSCC ملتصقة على لوحة. إضافة 2 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وإزالة 2 مل من DMEM 10 ميكرومتر الخلية وصمة عار / المصل خالية تضاف إلى كل لوحة
    3. العودة لوحة الثقافة 6 مل مع وصمة عار الخلية إلى 37 درجة مئوية الحاضنة لمدة 40 دقيقة.
    4. بعد 40 دقيقة، ونضح المتوسط. إضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني وثم نضح ذلك. إضافة 1 مل من 0.025٪ التربسين إلى كل لوحة واستبدالها في الحاضنة 37 درجة مئوية.
    5. إضافة 2 مل من DMEM مع FBS 10٪ بعد 3-5 دقائق ونقل الخلايا مع وقف التنفيذ لأنبوب مخروطي 15 مل. تدور الخلايا وإعادة أوقفهم في 1 مل من DMEM مع FBS 10٪.
    6. عدد الخلايا مع عدادة الكريات أو آلية مكافحة الخلايا، ثم قم بإضافة DMEM مع 10٪ FBS لخلق تركيز الخلية النهائي من 300000 خلية لكل مليلتر.

6. طلاء رئيس وNخلايا السرطان إيك

  1. إزالة لوحات من الزجاج السفلي مع المقايسات مصفوفة DRG من الحاضنة.
    ملاحظة: مرة أخرى، فهي المناسب عندما neurites التي هي لا يقل عن 75٪ من الطريق إلى حافة المصفوفة، والذي يحدث عادة بعد 2-3 أيام. هذا يعتبر أفضل باستخدام الهدف 10X على الأقل.
  2. نضح المتوسطة داخل لوحة من الزجاج السفلي. تماما نضح المتوسطة داخل الزجاج جيدا دون إزالة وحدات مصفوفة DRG.
  3. وضع 200 ميكرولتر من 300000 خلية / مل المتوسطة باستخدام الماصة 200 ميكرولتر. وضع قطرتين من الخلايا فوق بعضها فحص مصفوفة DRG. تنفيذ هذه الخطوة لكل قطرة مصفوفة، وخلق أربعة يكرر كل حالة الخلية على لوحة واحدة.
    ملاحظة: شكل نصف كروي المصفوفة تسمح للخلايا ليستقر في حلقة على طول المحيط الخارجي للفحص (الشكل 3A، الشكل 3B). العثور على الماصة مع مشغل سلس يجعل وضع زي قطرات أسهل بكثير.
  4. تأكيد أرقام الهواتف المحمولة مماثلة وديstribution الشروط خلية مختلفة تحت المجهر 4X.
  5. وضع لوحات من الزجاج السفلي في الحاضنة 37 درجة مئوية لحوالي 60 دقيقة. ملاحظة: على الرغم من أن هناك ليست سوى كمية صغيرة من الخلايا وسائل الإعلام (~ 150 ميكرولتر)، وفحوصات لا تجف حتى انقضت عدة ساعات من وقت الحاضنة.
  6. بعد 60 دقيقة، إضافة بلطف 4 مل من DMEM مع FBS 10٪ على طول جدار من لوحة من الزجاج السفلي.
    ملاحظة: على مدى فترة من الزمن، فإن الخلايا تلتزم جزئيا إلى أسفل لوحة، وطريقة إضافة المتوسطة لا يزعج الخلايا. أنواع مختلفة من الخلايا تجعل تأخذ أكثر أو أقل من الوقت للبدء في الانضمام إلى لوحة زجاج القاع.
  7. استبدال أي أدوية خارجية أو عوامل النمو في هذا الوقت للحفاظ على مستويات تركيز السابقة.
  8. العودة المقايسات إلى 37 درجة مئوية الحاضنة، إلا عندما يتم فحصها مجهريا. تحديد نتائج هذا الفحص بواسطة التصوير المجهري. لفترة وجيزة، عد خيوط غزو حول العصب معفي أربعة أجزاء باستخدام 4X صورة مجهرية.
    ملاحظة: المجهر مع 4X قدرات موضوعية ومضان كافية لفحوصات توثيق الصور. حجم المقايسات يناسب جيد في مجال هدف 4X، الذي هو مفصل بما يكفي لالتقاط كل مجال من مجالات غزو حول العصب. غزو ​​حول العصب يصبح واضحا خلال 24 ساعة، ولكن بعد 48 ساعة، وسلامة فحوصات تبدأ لإضعاف، وتنقسم الخلايا السرطانية على طول المحيط الخارجي للمصفوفة وتغزو. أكثر من 48 ساعة، وهناك أيضا هروب كبير من الخلايا الليفية من DRG، الذي يحجب التصور باستخدام brightfield المجهري. ولذلك، فإنه من المستحسن أن صورة وثيقة النتائج مع 4X المجهري مرتين على الأقل خلال هذه النافذة (على سبيل المثال، في 24 و 48 ساعة بعد طلاء الخلايا السرطانية). أن تضع في اعتبارها أن هذه المقايسات 3-الأبعاد، وأنه من الصعب أن صورة تماما فحص كامل. يحدث معظم غزو حول العصب في طائرة من الجزء السفلي من لوحة، حيث tانه الخلايا هي جزء لا يتجزأ في مصفوفة أعلى قليلا من أسفل لوحة. لأن هذه الطائرة هي قريبة من الأفقي، واستولت على الغالبية العظمى من neurites التي مع الخلايا السرطانية في صورة واحدة على مستوى في 4X.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بعد تشريح DRG ووضع داخل الحبرية مصفوفة، يجب أن ظهور الفحص تشبه الشكل 1. لاحظ أن DRG ليس دائريا تماما، ولكن يتركز في غضون الحبرية المصفوفة. وهذا يسمح للثمرة من neurites التي في 360 درجة، كما هو موضح جزئيا في الشكل 2. كن على علم أن أجزاء معينة من DRG ترسل neurites التي أسرع وبأعداد أكبر من غيرها، وعادة ما تقابل حيث صادر وفروع العصب وارد دخلت وخرجت من DRG، على التوالي. نفسر هذا وعن حجم الخلافات بين DRGs من الطلاء بشكل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خطوات حاسمة في إطار بروتوكول

أهم الخطوات في هذا البروتوكول هي تشريح دقيق واستخراج العقد الجذرية الظهرية. transection الصحيح للعمود الفقري وتقسيم خط الوسط الطولي إلى قسمين نصفي العمود الفقري حاسمة لحصول على أعداد كبيرة من DRG. خلال تشريح DRGs الفردية، ينبغي أبدا أن يكون التعامل مع العقدة مباشرة، ولكن ينبغي اغتنامها بدلا اللفافة المحيطة مع ملقط المجهرية. وعدم القيام بذلك يؤدي إلى إصابة في سحق من DR...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس للمؤلفين مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل بالكامل من خلال تمويل من المعاهد الوطنية للصحة من خلال منحة R21 ، "آليات الغزو المحيط بالعصب في سرطان الرأس والرقبة" ومنحة تدريب NCI T32 ، "التدريب البحثي لما بعد الدكتوراه في أورام الرأس والرقبة (2T32CA060397-21)." شكرا لريتشارد ستيمان ، دكتوراه في الطب ودكتوراه وموظفي المختبر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
DMEM / F-12 50/50 امزج مع L-glutamine و 15 ملي مولار HEPESCorning Cellgro10-090-CVManassas ، VA
مصل الأبقار الجنينيAtlanta BiologicalsS11150Flowery Branch ، GA
0.25٪ Trypsin-EDTA (1x)Technologies Corporation25200056Grand Island ، NY
Phosphate Buffered Saline 1xCorning21-040-CMManassas ، VA
Matrigel hESC-Qualif MouseCorning Incorporated354277Bedford, MA
Gamma مشع 35 مم أطباق ثقافة القاع الزجاجيMatTek CorporationP35G-1.5-14-CAshland, MA
SteREO Discovery.V8 مجهر التشغيلCarl Zeiss Microimaging495015-0021-000 ثورنوود، نيويورك
Schott ACE I مصدر الضوءSchottA20500ألمانيا
CellTracker  شركة Life TechnologiesCorporation C2925Carlsbad ، CA
BD PrecisionGlide Needle 18 G و 21 GBD305195Franklin Lakes ، NJ
Premium Microdissecting TweezerHarvard Apparatus60-3851Holliston ، MA
Fine التشغيل القياسي مقصهارفارد جهاز هارفارد52-2789هوليستون ، ماساتشوستس
مقص الربيع الممتازهارفارد الجهاز60-3923هوليستون ، ماساتشوستس
ملقط خلعجهاز هارفارد72-8949هوليستون ، ماساتشوستس
الفئران العارية الشعرية (002019) مختبرجاكسون002019بار هاربور ، ME
Life Premium الملابس

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jemal, A., et al. Cancer statistics, 2006. CA Cancer J Clin. 56 (2), 106-130 (2006).
  2. Hinerman, R. W., et al. Postoperative irradiation for squamous cell carcinoma of the oral cavity: 35-year experience. Head Neck. 26 (11), 984-994 (2004).
  3. Rahima, B., Shingaki, S., Nagata, M., Saito, C. Prognostic significance of perineural invasion in oral and oropharyngeal carcinoma. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 97 (4), 423-431 (2004).
  4. Woolgar, J. A., Scott, J. Prediction of cervical lymph node metastasis in squamous cell carcinoma of the tongue/floor of mouth. Head Neck. 17 (6), 463-472 (1995).
  5. Tai, S. K., et al. Treatment for T1-2 oral squamous cell carcinoma with or without perineural invasion: neck dissection and postoperative adjuvant therapy. Ann Surg Oncol. 19 (6), 1995-2002 (2012).
  6. George, D. L., et al. Nosocomial sinusitis in patients in the medical intensive care unit: a prospective epidemiological study. Clin Infect Dis. 27 (3), 463-470 (1998).
  7. Fagan, J. J., et al. Perineural invasion in squamous cell carcinoma of the head and neck. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 124 (6), 637-640 (1998).
  8. Soo, K. C., et al. Prognostic implications of perineural spread in squamous carcinomas of the head and neck. Laryngoscope. 96 (10), 1145-1148 (1986).
  9. Parsons, J. T., Mendenhall, W. M., Stringer, S. P., Cassisi, N. J., Million, R. R. An analysis of factors influencing the outcome of postoperative irradiation for squamous cell carcinoma of the oral cavity. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 39 (1), 137-148 (1997).
  10. Liao, C. T., et al. Does adjuvant radiation therapy improve outcomes in pT1-3N0 oral cavity cancer with tumor-free margins and perineural invasion. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 71 (2), 371-376 (2008).
  11. Fan, K. H., et al. Treatment results of postoperative radiotherapy on squamous cell carcinoma of the oral cavity: coexistence of multiple minor risk factors results in higher recurrence rates. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 77 (4), 1024-1029 (2010).
  12. Dai, H., et al. Enhanced survival in perineural invasion of pancreatic cancer: an in vitro approach. Hum Pathol. 38 (2), 299-307 (2007).
  13. Ceyhan, G. O., et al. Neural invasion in pancreatic cancer: a mutual tropism between neurons and cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 374 (3), 442-447 (2008).
  14. Gil, Z., et al. Paracrine regulation of pancreatic cancer cell invasion by peripheral nerves. J Natl Cancer Inst. 102 (2), 107-118 (2010).
  15. He, S., et al. GFRalpha1 released by nerves enhances cancer cell perineural invasion through GDNF-RET signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (19), 2008-2017 (2014).
  16. He, S., et al. The chemokine (CCL2-CCR2) signaling axis mediates perineural invasion. Mol Cancer Res. 13 (2), 380-390 (2015).
  17. Bakst, R. L., et al. Radiation impairs perineural invasion by modulating the nerve microenvironment. PLoS One. 7 (6), 39925(2012).
  18. Ayala, G. E., et al. In vitro dorsal root ganglia and human prostate cell line interaction: redefining perineural invasion in prostate cancer. Prostate. 49 (3), 213-223 (2001).
  19. Na'ara, S., Gil, Z., Amit, M. In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion. J Vis Exp. (110), (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة