مقالة منهجية

خلية خالية من الحمض النووي تحليل النزاهة في عينات البول

DOI:

10.3791/55049

⸱

يناير 5, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Biosciences Laboratory, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, 2Department of Urology, Morgagni-Pierantoni Hospital

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم اقتراح طريقة لتحليل سلامة الحمض النووي في الجزء الطافي الخالي من الخلايا من عينات البول. هذه الطريقة مناسبة للكشف المبكر عن أورام المسالك البولية الخبيثة وقد أثبتت دقتها في التشخيص المبكر لسرطان المثانة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على الرغم من وجود تعميم الحمض النووي خالية من الخلايا في البلازما أو مصل وقد تبين على نطاق واسع أن تكون مصدر مناسب من المؤشرات الحيوية لأنواع عديدة من السرطان، وركزت بعض الدراسات على إمكانية استخدام (UCF) الحمض النووي البول خالية من الخلايا. بدءا من الفرضيات أن الخلايا أفكارك العادية تنتج الحمض النووي مجزأة للغاية وأن الخلايا السرطانية الإفراج أطول الحمض النووي، والدور المحتمل للUCF سلامة الحمض النووي تم تقييم باعتباره علامة التشخيص المبكر قادرة على التمييز بين المرضى الذين يعانون من سرطان البروستاتا أو المثانة والأفراد الأصحاء.

ويقترح تحليل سلامة UCF الحمض النووي على أساس أربعة تقارير إنجاز المشروعات في الوقت الحقيقي الكمية من أربعة سلاسل أطول من 250 سنة مضت: ج-MYC، BCAS1، HER2، وAR. وقد تم اختيار تسلسل أن يكون في كثير من الأحيان زيادة عدد نسخ الحمض النووي في المثانة وسرطان البروستاتا لتحليل، ولكن الأسلوب هو مرن، ويمكن أن تكون بديلا هذه الجينات مع جينات أخرى من الأسواق العالمية ضغطهاراحة. وقد تم بالفعل أظهرت إمكانية الاستفادة من UCF الحمض النووي كمصدر من المؤشرات الحيوية للالأورام الخبيثة المسالك البولية، مما يمهد الطريق لمزيد من الدراسات حول توصيف UCF الحمض النووي. وUCF اختبار سلامة الحمض النووي لديها ميزة كونها غير الغازية، سريعة، وسهلة لأداء، مع عدد قليل فقط ملليلتر من البول اللازمة لإجراء التحليل.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن الكشف عن الحمض النووي خالية من الخلايا في الدم والبول نتيجة لموت الخلايا عن طريق آليات أفكارك أو الميتة. الحمض النووي خالية من الخلايا في الدم وقد درس على نطاق واسع لأغراض التشخيص والنذير في مختلف الأمراض، خاصة سرطان 1. ومع ذلك، لا يعرف الكثير عن دور (UCF) الحمض النووي البولية خالية من الخلايا. UCF الحمض النووي قد تنشأ من مرور الدم من خلال نظام الترشيح الكبيبي أو من الخلايا التي تأتي مباشرة في اتصال مع هذه السوائل في الجسم 2 (على سبيل المثال، خلايا الظهارة البولية أو خلايا البروستاتا). بصورة رئيسية تم التحقيق في استخدام UCF الحمض النووي كمصدر من المؤشرات الحيوية للتشخيص المبكر للالكلى والمثانة، وسرطان البروستاتا ويرجع ذلك إلى نسبة عالية من الحمض النووي UCF القادمة مباشرة من خلايا المسالك البولية 3،4.

لا يعرف الكثير عن UCF الحمض النووي وأفضل الطرق لعزل وتوصيف ذلك. وبالنظر إلى فرضية أن الخلايا السرطانية تطلق شظايا الحمض النووي أطول من الخلايا الطبيعية، وتقييمالنزاهة الحمض النووي خالية من الخلايا وقد درس في محاولة لإلقاء الضوء على أصل الحمض النووي في الدورة الدموية 5. وقد أظهرت بعض الدراسات أن خالية من الخلايا سلامة الحمض النووي في الدم تمثل اختبارا جيدا لأنواع عديدة من السرطان 6 التشخيص، وقد اقترحت نفس الفرضية فيما يتعلق البول 7-9.

وتصف هذه الورقة طريقة جديدة لتحليل سلامة UCF الحمض النووي مع التطبيق المحتمل لكشف المثانة وسرطان البروستاتا. على وجه الخصوص، وسلامة UCF الحمض النووي شظايا تم اختبار أطول من 250 نقطة أساس في 4 مناطق المعروف أن زيادة عدد نسخ الحمض النووي في الأورام الصلبة، بما في ذلك سرطان البروستاتا وسرطان المثانة: ج-MYC (8q24.21)، HER2 (17q12.1 )، BCAS1 (20q13.2)، وAR (Xq12) 10-14. والجينات المسرطنة محددة، بدلا من تسلسل عشوائي المختار، لزيادة احتمال العثور عليهم في جزء خالية من الخلايا لمرضى السرطان. واحدة من المزايا الرئيسية لهذا الأسلوب هو أنه مرن ويمكن أيضا اختيار أن المناطق الأخرى على أساس نوع الورم وخصائصها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتبع بروتوكول للمبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات البحوث الإنسان IRST.

ملاحظة: في هذا البروتوكول، ونحن عزل الحمض النووي من عينات البول لإجراء تحليل سلامة UCF الحمض النووي. واستخدمت Lncap والخلايا MRC خطوط لبناء المعايير. تم تنفيذ تقنيات مثل استخراج الحمض النووي، وتحديد الحمض النووي (معمل وفي الوقت الحقيقي PCR لجين السيطرة، STOX1)، والوقت الحقيقي PCR لالمسرطنة محددة (الشكل 1).

1. جمع البول ومعالجة

  1. الحصول على تنظيف الصيد صباح أول عينة البول في جاف، كوب نظيف، البلاستيك. جمع لا يقل عن 50 مل من عينة البول.
  2. الحفاظ على البول عند 4 درجة مئوية لمدة أقصاها 3 ساعة وإرسالها إلى المختبر في نفس درجة الحرارة.
  3. خلط كل عينة عن طريق عكس ذلك مرتين فور وصوله في المختبر ونقل الى قسمين 50 مل أنابيب البولي بروبلين القاع المخروطية.
  4. أنابيب الطرد المركزيفي 850 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية أو في درجة حرارة الغرفة.
  5. نقل بعناية 10 مل من الجزء العلوي من طاف البول إلى أنبوبين 5 مل، وترك ما لا يقل عن 2 مل من طاف فوق بيليه الخلية.
    ملاحظة: نقل الجزء العلوي من طاف يقلل من خطر التلوث من الخلايا أو الحطام الخلوي. ليس هناك تحديد واضح بين الأجزاء العلوية والسفلية.
  6. تجاهل بيليه وتجميد فورا طاف في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

2. عزل الحمض النووي من طاف البول وخطوط الخلية

ملاحظة: عزل الحمض النووي من خط الخلية (على سبيل المثال، Lncap لسرطان البروستاتا أو MRC للكشف عن سرطان المثانة) باستخدام طقم التجارية وباتباع إرشادات الشركة المصنعة. يجب أن يتم تنفيذ عزل الحمض النووي من طاف البول باستخدام بروتوكول تجاري أو تعديل على النحو التالي:

  1. ذوبان الجليد قسامة واحدة من طاف البول في درجة حرارة الغرفة.
  2. دوامة وخلط عينة البول ونقل 1 مل من طاف البول إلى واضح أنبوب 5 مل. تجميد البول المتبقية في -80 درجة مئوية.
  3. إضافة 100 ميكرولتر من بروتين ك مباشرة للعينة.
  4. إضافة 1 مل من العازلة AL إلى عينة وتخلط جيدا من قبل pipetting.
  5. إغلاق أنابيب واحتضان العينات عند 56 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  6. أثناء الحضانة، وإعداد عمود واحد لكل عينة وإعداد مخازن غسل، AW1 وAW2، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (إضافة المبلغ المشار إليه من الإيثانول بنسبة 100٪).
  7. جلب العينات إلى درجة حرارة الغرفة وإضافة 1 مل من الايثانول المطلق. تماما مزيج من قبل pipetting.
  8. إضافة 650 ميكرولتر من خليط حصلت عليه في الخطوة 2.7 إلى العمود وأجهزة الطرد المركزي أنه في 6000 x ج لمدة 1 دقيقة.
  9. تجاهل الأنبوب الذي يحتوي على التدفق من خلال وضع عمود في أنبوب جمع جديدة ونظيفة. كرر الخطوات من 2.8 و 2.9 حتى تم استخدام كل من خليط العينة (5 مرات).
  10. إضافة 500 &# 181؛ L العازلة AW1 دون ترطيب حافة العمود. أجهزة الطرد المركزي أنه في 6000 x ج لمدة 1 دقيقة.
  11. تجاهل الأنبوب الذي يحتوي على التدفق من خلال واستبدالها أنبوب مجموعة جديدة ونظيفة.
  12. إضافة 500 ميكرولتر من AW2 عازلة بدون ترطيب حافة العمود. أجهزة الطرد المركزي لذلك بأقصى سرعة (20000 x ج) لمدة 3 دقائق.
  13. تجاهل الأنبوب الذي يحتوي على التدفق من خلال واستبدالها أنبوب مجموعة جديدة ونظيفة.
  14. كرر الخطوة 2.12 لإزالة أي غسل العازلة المتبقية.
  15. وضع عمود في أنبوب 1.5 مل نظيف. إضافة 50 ميكرولتر من شطف العازلة AE وانتظر 7 دقائق للتأكد من أن يبلل عازلة العمود.
  16. أجهزة الطرد المركزي أنه في 8000 x ج لمدة 1 دقيقة.
  17. ماصة شاطف من الخطوة 2.15 في العمود صغيرة وأجهزة الطرد المركزي أنه في أقصى سرعة لمدة 1 دقيقة لضمان أقصى قدر من الانتعاش من الحمض النووي.

3. الحمض النووي الكمي والتخفيف

  1. باستخدام مقياس الطيف الضوئي، أداء الكمي من الحمض النووي من بوتح خط الخلية وعينات البول طاف. استخدام 2 ميكرولتر من العينة على مقعد بين كبار طيف، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  2. تمييع عينات UCF الحمض النووي للحصول على تركيز من 1 نانوغرام / ميكرولتر وتخزين الحمض النووي في -20 درجة مئوية حتى تحليل سلامة الحمض النووي.
    ملاحظة: إذا كانت كمية الحمض النووي ليست كافية للمضي قدما في الوقت الحقيقي PCR (لا يقل عن 100 نانوغرام)، نفذ عملية عزل الحمض النووي الجديدة.
  3. تمييع DNA من عينات خط الخلية للحصول على ستة معايير بتراكيز مختلفة: 0.001، 0.01، 0.1، 1، 0.5، و 2 نانوغرام / ميكرولتر، لكل منها حجم 100 ميكرولتر (ST1، ST2، ST3، ST4، ST5، و ST6). تخزين معايير الحمض النووي خط خلية في -20 درجة مئوية حتى تحليل سلامة الحمض النووي.

4. DNA النزاهة إختبار - PCR

  1. ذوبان الجليد الاشعال (تركيز يعتمد على نوع الفحص)، SUPERMIX الأخضر، والمعايير الحمض النووي خط الخلية، وعينات من الحمض النووي UCF المخفف على الجليد.
  2. إعداد أنابيب الشريط في لوحة وأو القرص الدوار 72-جيدا. قسامة 10 ميكرولتر من نسختين لكل معيار وعينة المخفف و 10 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه للسيطرة سلبية.
  3. إعداد مزيج من 1 ميكرولتر من كل التمهيدي (يشار إلى التركيزات في الجدول 1)، 12.5 ميكرولتر من SUPERMIX الأخضر، و 6.5 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه لكل عينة. عند إعداد هذا المزيج، واستخدام الرقم التالي من العينات: 6 معايير ل2 مكررات، وعدد من العينات لمدة 2 مكررات، سيطرة سلبية لمدة 2 مكررات، و 2 عينات اضافية.
  4. قسامة 15 ميكرولتر من المزيج في كل بئر. لا ماصة أو تدور الأنابيب.
  5. بدء تشغيل بروتوكول مع الظروف PCR هو مبين في الجدول رقم 1.
    ملاحظة: للحصول على قيمة UCF الحمض النووي، تم تجهيز 29 عينات من الحمض النووي لكل تجربة في الوقت الحقيقي باستخدام 72-جيدا الدوار القرص: 29 × 2 عينات + 6 × 2 معايير + السلبية السيطرة × 2 = 72 (القيمة UCF DNA).
    ملاحظة: بروتوكول لتحليل سلامة UCF الحمض النووي يمكن أن يكون أيضاتتم باستخدام PCR الوقت الحقيقي أداة أخرى (عند استخدام جهاز آخر، قد تحتاج إلى إضافة ROX صبغة).

5. الحمض النووي النزاهة إختبار - تحليل وتفسير البيانات

ملاحظة: قيمة UCF الحمض النووي لكل عينة تم الحصول عليها من قبل في الوقت الحقيقي برامج النظام أداة الكشف باستخدام بناء المنحنى القياسي لكل تقييم الجينات PCR الفردية واستخدام الاستيفاء منحنى قياسي، كما هو موضح سابقا 7-9 (الشكل 2).

  1. تقييم مكررات. يعيد عينة مع الفرق ≥1 يجب التخلص منها ط م وإعادة تقييمها في التجربة الثانية.
  2. حساب متوسط ​​ط م لكل عينة والنظر في العينات مع قيمة ط م ≤ 36.
  3. تقييم خصوصية المنتجات PCR باستخدام التحليل ذوبان.
  4. تقييم تركيز كل amplicon قبل الاستيفاء مع المنحنى القياسي. الحصول على قيمة تركيز (نانوغرام / ميكرولتر) لكل amplicon.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كان مجموع تركيز الحمض النووي مجانية للقياس بواسطة القياس الطيفي لجميع العينات التي تم تحليلها، مما يدل على مدى يتراوح بين 1.51 و 138 نانوغرام / ميكرولتر. استخدمت خمس عينات الرقابة على استنساخ البيانات: تم إجراء تجربتين في الوقت الحقيقي مستقلة لج-MYC، HER2، BCAS1، AR، وSTOX1. ثم تم حساب معاملات الاختلاف (CV) لكل جينة (الجدول 2)، مع وجود درجة جيدة من التكاثر بين اثنين من تجارب مستقلة

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UCF تحليل سلامة الحمض النووي هو أسلوب جديد، غير الغازية لتقييم سلامة الحمض النووي في البول. واقترح مؤخرا انها لتشخيص مبكر من المثانة (9) وسرطان البروستات 7،8. وتناقش عدد من مزايا وعيوب اختبار سلامة UCF الحمض النووي هنا، جنبا إلى جنب مع آفاق المستقبل.

والميزة الرئيسية لهذا النهج هو أنه يقدم، طريقة غير مكلفة غير الغازية وبروتوكول بسيط لدراسة البول كمصدر محتمل من المؤشرات الحيوية، الأمر الذي يت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون Gráinne Tierney و Silvia Bellissimo على مساعدتهما التحريرية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
QIAamp DNA Mini Kit
 		Qiagen51304
iQ SYBR  سوبر مكس أخضر ، 100 × 50 وميكرو ؛ L rxns ، 2.5 مل (2 × 1.25 مل) Biorad1708880
IDT مخصص DNA oligos   ؛IDT تنقية HPLC ، 100nMole DNA oligo
NanoDrop 1000 مقياس الطيفالحراري العلمييمكن أيضا استخدام طرق القياس الطيفي الأخرى لتحديد كمية DNA
Rotor-Gene 6000Corbettأيضا استخدام أداة PCR أخرى في الوقت الحقيقي
طرد
دقيقة لأنابيب 50 مل
حاضنة
80 درجة ؛ C الفريزر
-20 درجة ؛ فريزر
10 &# 956; ماصة
20 &# 956; L ماصة
200 &# 956; ماصة
1,000 &# 956; أطراف ماصة الماصة
L (10؛ 20؛ 200؛ 1,000)
أنابيب سعة 1.5 مل أنابيب
سعة 50 مل أنابيب
سعة 15 مل أنابيب
القرص الدوار 79018899
وأغطية شريطية من القرص الدوار، 0.1 مل (250)981103 Qiagen
أنابيب التجميع (2 مل)Qiagen19201
Buffer AL (264 مل)Qiagen19075
Proteinase K (10 مل)Qiagen19133
الضوئي يمكن لأجهزة مركزي CLL2 أنابيب

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Francis, G., Stein, S. Circulating Cell-Free Tumour DNA in the Management of Cancer. Int.J.Mol.Sci. 16 (6), 14122-14142 (2015).
  2. Bryzgunova, O. E., Laktionov, P. P. Extracellular Nucleic Acids in Urine: Sources, Structure, Diagnostic Potential. Acta Naturae. 7 (3), 48-54 (2015).
  3. Szarvas, T., et al. Deletion analysis of tumor and urinary DNA to detect bladder cancer: urine supernatant versus urine sediment. Oncol.Rep. 18 (2), 405-409 (2007).
  4. Togneri, F. S., et al. Genomic complexity of urothelial bladder cancer revealed in urinary cfDNA. Eur.J.Hum.Genet. , (2016).
  5. Zonta, E., Nizard, P., Taly, V. Assessment of DNA Integrity, Applications for Cancer Research. Adv.Clin.Chem. 70, 197-246 (2015).
  6. Hao, T. B., et al. Circulating cell-free DNA in serum as a biomarker for diagnosis and prognostic prediction of colorectal cancer. Br.J.Cancer. 111 (8), 1482-1489 (2014).
  7. Salvi, S., et al. Urine Cell-Free DNA Integrity Analysis for Early Detection of Prostate Cancer Patients. Dis.Markers. 2015, 574120(2015).
  8. Casadio, V., et al. Urine cell-free DNA integrity as a marker for early prostate cancer diagnosis: a pilot study. Biomed.Res.Int. 2013, 270457(2013).
  9. Casadio, V., et al. Urine cell-free DNA integrity as a marker for early bladder cancer diagnosis: preliminary data. Urol.Oncol. 31 (8), 1744-1750 (2013).
  10. Salvi, S., et al. Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone. Br.J.Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).
  11. Ishkanian, A. S., et al. High-resolution array CGH identifies novel regions of genomic alteration in intermediate-risk prostate cancer. Prostate. 69 (10), 1091-1100 (2009).
  12. Oxley, J. D., Winkler, M. H., Gillatt, D. A., Peat, D. S. Her-2/neu oncogene amplification in clinically localised prostate cancer. J.Clin.Patho. 55 (2), 118-120 (2002).
  13. Nord, H., et al. Focal amplifications are associated with high grade and recurrences in stage Ta bladder carcinoma. Int.J.Cancer. 126 (6), 1390-1402 (2010).
  14. Tabach, Y., et al. Amplification of the 20q chromosomal arm occurs early in tumorigenic transformation and may initiate cancer. PLoS One. 6 (1), e14632(2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة