يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

Cryosectioning المناطق المتاخمة من العضلات الهيكلية واحدة فأرة للالتعبير الجيني والتحليلات النسيجية

15.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/55058

⸱

ديسمبر 12, 2016

1Department of Pharmaceutical and Biomedical Sciences, University of Georgia

في هذه المقالة

ملخص

يتم جمع متتالية المقاطع البرد لتمكين التطبيقات النسيجية والإثراء من الحمض النووي الريبي لقياس التعبير الجيني باستخدام المناطق المجاورة من ماوس واحدة العضلات والهيكل العظمي. يتم الحصول على جودة عالية RNA 20-30 ملغ من cryosections والقياسات المجمعة تتم مقارنة مباشرة عبر تطبيقات.

الملخص

مع هذا الأسلوب، يتم جمع cryosections التوالي لتمكين كل من التطبيقات المجهري لأنسجة الأنسجة والإثراء من الحمض النووي الريبي للتعبير الجينات باستخدام المناطق المجاورة من ماوس واحدة العضلات والهيكل العظمي. عادة، فإنه يمثل تحديا لتحقيق التجانس كافية من عينات صغيرة العضلات والهيكل العظمي وذلك لأن كميات المخزن المؤقت قد تكون منخفضة للغاية بالنسبة لتطبيقات طحن كفاءة، ولكن دون تعطيل الميكانيكية كافية، والهندسة المعمارية الأنسجة الكثيفة من اختراق حدود العضلات من الكواشف العازلة، مما تسبب في نهاية المطاف انخفاض العائد الحمض النووي الريبي. باتباع بروتوكول ذكرت هنا، يتم جمع 30 ميكرون أقسام وتجميع السماح cryosectioning والتجانس إبرة لاحق لتعطيل ميكانيكيا العضلات، وزيادة مساحة السطح المعرض للاختراق العازلة. القيود الأساسية للتقنية هي أنه يتطلب ناظم البرد، وأنه هو نسبيا منخفضة الإنتاجية. ومع ذلك، يمكن الحصول على جودة عالية من الحمض النووي الريبي عينات صغيرة من م المجمعةcryosections uscle، مما يجعل هذه الطريقة في متناول العديد من العضلات والهيكل العظمي المختلفة والأنسجة الأخرى. التحليلات وعلاوة على ذلك، تمكن هذه التقنية مطابقة (على سبيل المثال، التشريح الأنسجة والجينات) من المناطق المجاورة في العضلات والهيكل العظمي واحدة بحيث القياسات يمكن مقارنتها مباشرة عبر تطبيقات للحد من عدم اليقين التجريبي وللحد من التجارب على الحيوانات تنسخي اللازمة لمصدر الأنسجة صغيرة ل تطبيقات متعددة.

المقدمة

والهدف من هذه التقنية هو جعل التحليلات التجريبية متعددة من طرائق مختلفة، مثل الأنسجة والتعبير الجيني، يمكن الوصول إليها من صغيرة الهيكل العظمي الأنسجة مصدر عضلة واحدة. تطبيقات المجهر هي الأكثر حساسية لعينة طرق المحافظة، والتي يجب أن تسيطر عليها بعناية للحد من تشكيل التحف الكريستال الجليد أثناء الحفظ بالتبريد. وهكذا، ويستند تطوير الأسلوب على الأمامية الظنبوبي (TA) في العضلات المجمدة مغطاة جزئيا مع تضمين الراتنج في السائل حمام 2-methylbutane تبريد النيتروجين -140 ° C كمادة مصدر لكلا المجهري المناعي والتعبير الجيني التحليلات.

الحاجة إلى استخدام نفس المادة المصدر لنهج تقنية متنوعة ذات أهمية خاصة للتجارب القائم على حقن في العضل حيث تمثل العضلات اليمنى واليسرى ظروف مختلفة، واحد المجموعتين الضابطة والتجريبية واحد. على سبيل المثال، في دراسات تجديد العضلات، مو واحديتم حقن scle مع المادة السامة أن يسبب تلف الأنسجة على نطاق واسع في حين تخدم العضلات المقابل كعنصر تحكم حقن المركبة 1. وبالمثل، دراسات العلاج الجيني للاضطرابات العضلات وعادة ما تبدأ مع المصادقة على ناقلات العلاج الجيني عن طريق الحقن العضلي يمكن مقارنتها مع ناقلات فارغة، ناقلات لا علاقة لها أو السيطرة على السيارة على الجانب المقابل 2. وبالتالي، فإنه ليس من الممكن أن مصدر كل عضلة TA إلى تطبيق آخر.

استراتيجيات مشتركة للتعامل مع هذه المسألة هي: ط) لاستخدام مجموعة مختلفة من العضلات لكل تطبيق، ب) لاستخدام الفئران إضافية، أو ج) لقطع قطعة من العضلات لكل تطبيق. ومع ذلك، اختلافات جوهرية بين المجموعات العضلية تجعل من الصعب مقارنة البيانات من التطبيقات منفصلة، ​​والحيوانات إضافية تزيد النفقات ولها ما يبررها سيئة في حالة وجود بدائل أخرى. تقسيم العضلات بعد تشريح لمصدر التطبيقات المختلفة هو الخيار الأفضل طالعديد ن الحالات. ومع ذلك، فإن قطع العضلات وغالبا ما تكون صغيرة جدا لاستخدام سحق تحت النيتروجين السائل أو تقنيات طحن الميكانيكية لتجانس 2-5. كما العضلات هي الأنسجة الهيكلية للغاية معبأة مع مصفوفة ومقلص البروتينات خارج الخلية، وعدم كفاية التجانس الميكانيكية يؤدي إلى العائد المنخفض من الحامض النووي لاحق، RNA أو البروتين. طريقة مفصلة هنا يسمح كميات صغيرة من نسيج العضلات مصدر واحد للاستخدام في تطبيقات متعددة، وإدراج cryosectioning وإبرة سحن يحسن تجانس الميكانيكية لتحسين العائد الحمض النووي الريبي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من جامعة جورجيا المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام اللجنة في ظل الاستخدام الحيوان بروتوكول A2013 07-016 (بيدل).

1. الحفظ بالتبريد العضلات الهيكلية غير المثبتة

  1. تجهيز
    1. قطع الفلين إلى مربعات صغيرة (حوالي 1 سم × 1 سم) مع شفرة حلاقة، والكتابة على الفلين مع علامة غيض الجميلة التي هي مقاومة لل2-methylbutane لتحديد الماوس المصدر والعضلات، واجراء خفض ضحلة جدا (حوالي 1 ملم) عبر السطح العلوي. إدراج ساترة البلاستيك إلى قطع لاستخدامها لتوجيه الأنسجة. كرر حتى الفلين جاهز للكل الأنسجة لتكون cryopreserved.
    2. الحصول على النيتروجين السائل، 2-methylbutane، الراتنج التضمين، ميزان الحرارة درجات الحرارة المنخفضة، الفلين، أدوات التشريح، والفأرة الدراسة.
      تنبيه: السائل النيتروجين هو غاز مضغوط التي قد تنفجر إذا تم تسخينه. ارتداء معطف المختبر، والقفازات درجات الحرارة المنخفضة، وحماية الوجه عند التعامل مع السائل نيTrogen من. الاتصال مع الجلد أو العينين قد يسبب الحروق أو قضمة الصقيع. 2-Methylbutane هو قابل للاشتعال، سامة، مخاطر صحية وبيئية. ارتداء معدات الوقاية الشخصية (معطف المختبر، والقفازات، ونظارات السلامة)، فتح الحاوية الأسهم في غطاء الدخان، ونقل كمية صغيرة اللازمة لتجميد (عادة 200 إلى 400 مل) إلى وعاء منفصل التي يمكن أن تكون مغلقة بإحكام، وتجنب استنشاق .
    3. الموت ببطء الفئران مع أسلوب معتمد للقتل الرحيم تحت التخدير. لفترة وجيزة، إدراج الماوس الى غرفة استنشاق مع 2.5٪ الأيزوفلورين في الأكسجين من المرذاذ الأيزوفلورين، انتظر حتى 20 ثانية بعد الماوس توقف تتحرك للتحقق من ردة فعل دواسة. عندما منعكس دواسة هو سلبي، الموت ببطء الماوس الدراسة من قبل خلع عنق الرحم 6.
      ملاحظة: أساليب القتل الرحيم تتطلب موافقة لجنة الأخلاقيات المؤسسية.
    4. إزالة الجلد المغطي hindlimb القاصي وقطع الأوتار الأمامية البعيدة فقط فوق الكاحل مع ديس غرامة نقطةمقص ction. فهم الأوتار القاصي مع ملقط غرامة وسحب بلطف صعودا ونحو الركبة في حين خفض فآسيا الجانبية للافراج عن العضلات. سحب العضلات من عمودي من الركبة واجراء خفض النهائي لاستئصال عضلة TA 7.
      ملاحظة: يتم استخدام عضلة TA هنا كمثال على ذلك، ولكن أي فأر العضلات والهيكل العظمي أو قلب يمكن أن تكون بديلا للTA في هذا البروتوكول إذا كان ذلك مناسبا لأهداف تجريبية للمستخدم. والقيد الوحيد هو أن الأنسجة يجب أن تكون صغيرة بما يكفي لتحقيق الحفظ بالتبريد السريع في جميع أنحاء عمقها. ينصح حجم الأنسجة الحد الأقصى من 1 سم × 1 سم.
    5. كرر على الساق المعاكسة، وتشريح خارج أي الأنسجة الأخرى التي يتعين جمعها. أداء تشريح في أسرع وقت ممكن للحد من تدهور الأنسجة قبل الحفظ بالتبريد.
    6. توجيه كل عضلة على المقاطع العرضية على الفلين وصفت مسبقا لها. الوقوف عضلة عمودي على الفلين مع وتر البعيدة لمس الفلين والجزء العلوي من تحويلة العضلاتإنهاء بعيدا، مرفوعة من قبل ساترة.
    7. Cryopreserve جميع أنسجة للتحليل النسيجي في أقرب وقت ممكن بعد تشريح، ويفضل في غضون 5 دقائق ولكن بالتأكيد ليست أكثر من 15 مرة دقيقة انقضت منذ euthanization من المصدر الحيواني.
  2. الحفظ بالتبريد
    1. تبدأ تبريد حمام الحفظ بالتبريد خمس دقائق قبل نهاية تشريح. صب 2-methylbutane إلى دورق المعادن مفتوحة على عمق حوالي 3 سم. صب النيتروجين السائل في وعاء معزول على عمق 2-4 سم. تعيين كوب من 2 methylbutane في النيتروجين السائل. وسوف تبدأ النيتروجين في الغليان. تجنب الرش النيتروجين في الكأس 2-methylbutane.
      تنبيه: إعداد تجميد حمام في غطاء الدخان أو منطقة جيدة التهوية.
    2. إدراج مقياس الحرارة درجات الحرارة المنخفضة إلى منطقة methylbutane 2 لمراقبة درجة الحرارة واثارة في كثير من الأحيان مع مفترق لضمان حتى يبرد. الاستمرار في إثارة وبارد حتى 2-ليthylbutane تصل إلى -140 درجة مئوية، مضيفا النيتروجين السائل الجديد إلى الحمام الخارجي عند الضرورة.
      ملاحظة: -140 درجة مئوية هي درجة الحرارة المثلى للحد من القطع الأثرية وضوح الشمس الجليد في العضلات المخططة. الأنسجة الأخرى قد cryopreserve أفضل عند درجات حرارة مختلفة (على سبيل المثال، الدماغ، -90 درجة مئوية).
    3. تطبيق الراتنج تضمين فقط إلى انخفاض 35-50٪ من العضلات حيث يلتقي الفلين وإسقاط فورا الفلين إلى منطقة methylbutane 2 في -140 درجة مئوية. تكرار بسرعة لمدة تصل إلى 8 الأنسجة لكل دفعة التجميد. يحرك المزيج لمدة 30 ثانية وتجريف قاع الكأس للتأكد من أن الأنسجة لا تجميد في ترسيخ 2-methylbutane.
    4. استخدام شوكة، ملعقة فترة زمنية محددة أو ملقط كبيرة لسحب كل الفلين الأنسجة من-methylbutane 2. بسرعة إزالة ساترة، ربت الزائدة 2-methylbutane في الكأس، ثم إسقاط الفلين الأنسجة في حمام النيتروجين الخارجي. أكرر للجميع الفلين المتبقية في الكأس.
    5. بنقل العينات في النيتروجين السائل أو على الجليد الجاف ل-80 درجة مئوية الثلاجة لمدة التخزين.
    6. إذا تبقى أي أنسجة لحفظ البرودة، كرر الخطوات من 1.2.3 إلى 1.2.4. إضافة إضافي 2-methylbutane إلى الدورق أو النيتروجين السائل إلى الحمام الخارجي حسب الضرورة وإعادة بارد إلى -140 درجة مئوية. التخلص من استخدام 2-methylbutane كنفايات خطرة.

2. جمع Cryosections لعلم الأنسجة والحمض النووي الريبي التطبيقات

  1. تجهيز.
    1. قبل تزن أنبوب تعقيمها الدناز / ريبونوكلياز خالية على الميزان التحليلي. ثم، نقله الى غرفة ناظم البرد إلى precool. كرر حتى أنابيب جاهزة لجميع العينات cryosection المجمعة التي يتعين جمعها.
    2. لباجتزاء الهيكل العظمي والعضلات، تأكد من أن درجة حرارة الغرفة ناظم البرد هي -21 إلى -22 درجة مئوية بحلول الحرارة الداخلية. نقل أي حاويات مع الأنسجة إلى أن يقتطع من الغرفة وتسمح للحاوية (ق) لكي تتوازن إلى درجة حرارة ناظم البرد لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل الافتتاح.
    3. إدراج شفرة ناظم البرد المتاح جديدة. بالتناوب، وإزالة شفرة الحالية، رذاذ مع ريبونوكلياز الحل إزالة التلوث، وشطف مع ده 2 O، وإعادة تركيبها في ناظم البرد لتبرد. رش منديل نظيف مع 70٪ من الإيثانول ويمسح بعناية شفرة وشفرة منصة لقط.
      1. رش منديل نظيف مع محلول تطهير ريبونوكلياز والقضاء فرش ناظم البرد. رش الأنسجة مع ده 2 O، مسح فرش مرة أخرى وتضعها في الغرفة ناظم البرد على سطح نظيف.
        تنبيه: يجب تغطية شفرة ناظم البرد من قبل حارس سكين عندما لا تكون قيد الاستعمال. أيضا، ريبونوكلياز الحل إزالة التلوث السام وسوف تجمد لتشكيل راسب في الغرفة ناظم البرد الباردة. وبالتالي، التعامل معها بحذر وتجنب استخدامه في الغرفة ناظم البرد.
    4. داخل غرفة ناظم البرد، وضع قطرة سنتات الحجم (حوالي 300 ميكرولتر) من تضمين الراتنج على تشاك عينة الدافئ، وضع الفلين الأنسجة على الجزء العلوي من الراتنج، واضغط لأسفل، ثم قم بتعيين تشوك في الابeezing السكك الحديدية أو على عنصر تجميد سريع إذا كانت متوفرة.
    5. بعد تضمين يتصلب الراتنج (أبيض)، إضافة الراتنج تضمين إضافية على أعلى من الفلين، حول انخفاض 35٪ من الأنسجة واضغط على مستخرج الحرارة في الراتنج تضمين لتجميد سريع لتحقيق الاستقرار في أفضل الأنسجة. انتظر 5 دقائق قبل باجتزاء للسماح للراتنج لتتصلب تماما.
    6. تأكد من أن المشبك العينة في الموقف الأكثر تراجع لها، الأبعد من النصل. إدراج تشاك عينة الأنسجة في المشبك العينة.
  2. إعداد Cryosection.
    1. قم بفك حامل الناقل شفرة، تعيين زاوية تطهير النصل إلى 10 درجة (أو زاوية مناسبة للناقل شفرة المستخدمة)، وإعادة تشديد. الافراج عن الفرامل وتحويل عجلة اليد لخفض عضلة نحو النصل. تقدير أقرب مسافة بين الأنسجة وشفرة، ثم نقل الأنسجة بعيدا عن شفرة وإشراك الفرامل عجلة اليد.
    2. تخفيف LEVE تعديل الارتفاعص ونقل الناقل شفرة إلى الأمام أو الخلف، على التوالي، وإذا كانت نهاية الأنسجة أكثر من حوالي 2 ملم من شفرة أو إذا كانت شفرة يضرب الأنسجة. تشديد وخفض الأنسجة مرة أخرى للتحقق المسافة من شفرة. تكرار التعديلات حتى نصل هي 1-2 ملم من نهاية الأنسجة عن طريق تقدير البصرية.
    3. خفض الأنسجة نحو النصل وتقييم زاوية الأنسجة لالمقاطع العرضية. قفل عجلة اليد والافراج عن رافعة عينة المشبك. دفع المشبك عينة اليمين أو اليسار حتى اتجاه أفقي من النسيج هو عمودي على النصل.
    4. دفع عينة المشبك أعلى أو لأسفل لضبط اتجاه "ص" بحيث أقسام الأنسجة سيكون عمودي على محور طويل من العضلات. تشديد رافعة عينة المشبك.
    5. استخدام بالطبع وغرامة التغذية إلى الأمام لدفع عينة حتى مجرد تلامس شفرة. إذا طلب مقاطع من عمق الأنسجة معين، إعادة مبلغ القسم سمك من الصفر (العلوي من الأنسجة).
    6. تعيين ناظم البرد إلى تقليص وظيفة مع سمك الباب 30 ميكرون. قص وتجاهل المقاطع حتى يتم الوصول إلى عمق انتقاؤه لجمع الأنسجة (على سبيل المثال، 400 ميكرون من أعلى).
  3. جمع cryosections لاستخراج الحمض النووي الريبي.
    1. فتح أنبوب للأقسام جمع ووضعه بالقرب من الناقل شفرة. استخدام، فرشاة نظيفة تبرد قبل أن تلتقط كل قسم كما هو قطع عليه من النصل ونقل cryosection في أنبوب. كرر حتى تزن الأقسام المجمعة 30 ملغ أو الوصول إلى عمق الأنسجة المطلوب.
      ملاحظة: للحصول على الظنبوبي الأمامي الماوس الكبار، وجمع من عمق الأنسجة من حوالي 400 إلى 4000 ميكرومتر عادة ينتج 25 - 40 ملغ. باستخدام الملقط المعدني لنقل المقاطع لأنبوب جمع لا ينصح كما تميل الأقسام التمسك وتتجمع على سطح المعدن.
    2. إذا تضمين الراتنج يحيط cryosection العضلات، وقفل فرملة اليد واستخدام شفرة حلاقة ليحلق قطع صغيرة من الراتنج حتى لا يوجد سوى طبقة رقيقة حول الجزء العلوي من العضلات. قطع دائما الراتنج مع شفرة الزاوية بعيدا عن العضلات.
      ملاحظة: هناك طبقة رقيقة من تضمين الراتنج أمر لا ينتقص كثيرا من إعداد RNA المصب. إذا الراتنج تضمين اسمك موجودا، استخدام فرش لندف بعيدا عن العضلات قبل أن ينتقل إلى cryosection في أنبوب جمع.
    3. بدلا من ذلك، أقسام تجمع على الناقل شفرة ونقل بكميات كبيرة إلى أنبوب جمع.
      ملاحظة: ومع ذلك، فإن هذا الأسلوب يميل إلى أن يكون أبطأ، وأكثر عرضة للعصا وتتجمع معا، والتي يمكن أن تقلل من كفاءة التجانس إبرة في خطوات لاحقة أقسام.
    4. المكان بسرعة أنبوب cryosection المجمعة إلى التحليلي التوازن وأنبوب سجل الوزن. العودة فورا الأنبوب إلى غرفة ناظم البرد الباردة للحفاظ على درجة حرارة الجزء بالقرب -20 درجة مئوية. حساب الوزن من المقاطع المجمعة.
      ملاحظة: إذا RNA العزلة سيحدث على الإعلاناليوم ifferent، وتخزين أنبوب cryosection المجمعة في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  4. جمع cryosections لالأنسجة.
    1. اضغط على زر سمك مقطع لغرامة باجتزاء واستخدام السهام لضبط قسم ناظم البرد سمك إلى 7 ميكرون (أو غيرها من القسم المناسب سمك، وعادة 6-10 ميكرون).
      ملاحظة: أرق المقاطع (6-10 ميكرون) وينبغي أن تستخدم للتطبيقات النسيجية لضمان الكواشف تلطيخ يمكن ان تخترق عمق قسم الأنسجة. الشرائح الرقيقة التي يمكن اتخاذها من أي عمق أثناء cryosectioning، ولكن يفضل أقسام أعمق لتضمين الراتنج، الأمر الذي يزيد مع عمق الأنسجة، أمر لا ينتقص تلطيخ النسيجي.
    2. قص وتجاهل 4-7 أقسام للحصول على سطح الأنسجة ثابت حتى. جعل علما عمق الأنسجة.
    3. قطع جزء وتوجيهه على سطح حاملة شفرة. التقاط القسم من قبل بسرعة وبلطف لمس الدافئة (درجة حرارة الغرفة) شريحة المجهرإلى قسم على الناقل شفرة. العودة الشريحة إلى درجة حرارة الغرفة. تستمر حتى يتم الحصول على عدد من الشرائح المطلوب. جعل علما عمق الأنسجة النهائي.
      ملاحظة: جمع قسم ثان (مكررة) لكل الأنسجة ويوصى.
    4. مع باجتزاء كاملة، إشراك فرامل العجلات جهة، والعودة العينة إلى موقف الخلفي معظم، وإزالة تشاك الأنسجة. استخدام عنصر الحرارة ناظم البرد لإذابة الراتنج تضمين عقد الفلين الأنسجة على تشاك العينة. إزالة الفلين الأنسجة، وتجف مع الأنسجة، والعودة إلى التخزين.
    5. كرر من الخطوة 2.1.2 لكل الأنسجة المتبقية. تسمح الشرائح لتجف لمدة 20 دقيقة بعد تم تركيب الأنسجة الماضية. ثم، استخدم الشرائح لالنسيجية أو تلطيخ مناعي أو التجميد في -80 درجة مئوية في مربع الشريحة لحين الحاجة إليها.

3. عزل الحمض النووي الريبي من مجمع Cryosections

  1. استخراج الحمض النووي الريبي
    1. أنبوب نقل (ق) من cryosections المجمعة إلى جليد. على الفور إضافةالعضوية كاشف استخراج الحمض النووي الريبي في نسبة حوالي 1 مل كاشف لكل 50 ملغ الوزن cryosection، وعادة 600 ميكرولتر في أنبوب.
      تنبيه: RNA الكواشف العزلة سامة، قابلة للتآكل، ومزعجة. اتبع إرشادات الشركة المصنعة للتعامل الآمن.
    2. باستخدام حقنة 1 مل مع إبرة قياس 18، واستخلاص الحمض النووي الريبي استخراج السائل صعودا وشطف جدران الأنبوب حتى يتم تعليق جميع الأنسجة في الحل. محاولة للحد من فقاعات الهواء خلال التجانس إبرة.
    3. استخدام غيض من الإبرة إلى الهريس وتفريق أي cryosections وقطع تجمعت التمسك جدار الأنبوب. يسحن إلى التجانس عن طريق تمرير العينة صعودا وهبوطا من خلال إبرة لخمس ضربات، ثم يعود العينة إلى جليد. كرر الخطوتين 3-5 مرات، أو عدة مرات كما هو ضروري لتعطيل كافة كتل وتمرير العينة بسهولة من خلال إبرة.
    4. إزالة إبرة قياس 18 واستبدالها مع إبرة قياس 22. بعناية آرiturate العينة لخمس ضربات، ثم يعود العينة إلى جليد. كرر سحن 3-4 مرات للتحقيق جناسة الأنسجة جدا تفرق بدقة.
      ملاحظة: إذا بدأت جزيئات الأنسجة لمنع الإبرة عند وضع العينة، وطرد كل عينة من حقنة والتبديل إلى إبرة قياس 18 للمزيد من التجانس. خطوة سحن إضافية مع إبرة 25 أو 26 مقياس يمكن أن تضاف إلى الحصول على العائد القصوى. ومع ذلك، فإن إبرة يمكن أن تصبح مسدودة حتى لا يكون هناك خطر من عينة إراقة.
    5. نقل عينة من الجليد إلى درجة حرارة الغرفة. احتضان لمدة 5 دقائق لتعطيل المجمعات الجزيئية.
    6. في غطاء الدخان، إضافة 0.1 مل من 1-برومو-3-chloropentane (BCP) في 1 مل من كاشف RNA العزلة المستخدمة (الخطوة 3.1.1)، وعادة 60 ميكرولتر في الأنبوب. هز أنبوب بقوة باليد لمدة 15 ثانية (لا الدوامة). احتضان العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 إلى 3 دقائق. ثم، الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 12000 x ج و 4 درجات مئوية.
      الحذر: BCP غير قابلة للاشتعال والسامة. التعامل في غطاء الدخان وارتداء القفازات، معطف المختبر، ونظارات السلامة.
    7. بعناية جمع المرحلة المائية العليا (عديم اللون) التي تحتوي على الحمض النووي الريبي وتحويلها إلى أنبوب نظيفة. إضافة حجم مساو من 70٪ من الإيثانول (في الماء DEPC) ودوامة لخلط. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 10 دقيقة.
      ملاحظة: في الطور البيني المتوسطة والدنيا مراحل الفينول BCP يمكن معالجتها عن الحمض النووي الجيني والبروتين، على التوالي، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة أو المجمعة في الفينول BCP حاوية النفايات الخطرة للتخلص المناسب.
  2. تنقية الحمض النووي الريبي.
    1. اتبع إرشادات الشركة المصنعة لعينة ملزمة، غسل وشطف مع اختلافات طفيفة 8. فمثلا:
    2. وضع قسامة من المياه الدناز / ريبونوكلياز خالية في حمام C 37 درجة أو حاضنة لمرحلة ما قبل الحارة للخطوة 3.2.4.
    3. إضافة عينة الحمض النووي الريبي من 3.1.8 أعلاه للعمود تنقية وأجهزة الطرد المركزي العينة لمدة 15 ثانيةفي 12000 x ج في درجة حرارة الغرفة. صب التدفق من خلال العودة الى نفس العمود وإعادة الطرد المركزي. كرر وقت إضافي واحد لتحقيق أقصى قدر من الحمض النووي الريبي ملزمة، ومن ثم التخلص من تدفق النهائي من خلال.
    4. تنفيذ الخطوات غسل وفقا لتعليمات الشركة الصانعة 8. تطبيق 700 ميكرولتر من غسل العازلة (لا الإيثانول) إلى العمود، وتدور لمدة 15 ثانية في 12000 x ج، وتجاهل التدفق من خلال.
    5. إضافة 500 ميكرولتر من غسل العازلة (الإيثانول) إلى العمود، وتدور لمدة 15 ثانية في 12000 x ج، وتجاهل التدفق من خلال. كرر هذه الخطوة لمرة واحدة.
    6. تدور العمود الفارغ لمدة 1 دقيقة في 12000 x ج لتجف الغشاء.
    7. نقل عمود الدوران إلى RNase- نظيفة، خالية من أنبوب الدناز. إضافة 40 ميكرولتر من الدناز / الماء قبل حرارة ريبونوكلياز خالية (من 3.2.1) إلى مركز للغشاء العمود. في درجة حرارة الغرفة، واحتضان لمدة 2 دقيقة ثم الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 12000 ز س.
      ملاحظة: حجم شطف 40 ميكرولتر ما يقرب من 1.3 ميكرولتر لكل ملغ من الأصليالأنسجة لمدة 30 ملغ من cryosections المجمعة. ضبط حجم شطف بما يتناسب مع مختلف الأوزان الأنسجة الانطلاق، ولكن لا تقلل أقل من 32 ميكرولتر. ، يمكن إضافة شطف الثاني، وذلك باستخدام ما يقرب من 0.7 ميكرولتر لكل ملغ من الأنسجة الأصلية لزيادة المحصول الكلي الحمض النووي الريبي.
    8. تحليل الحمض النووي الريبي (العمود شطف) للتركيز ونقاء من قبل معمل، الكهربائي، و / أو bioanalyzer. تخزين الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية لحين الحاجة إليها لتطبيقات المصب، مثل النسخ العكسي لPCR الكمي (4).
      ملاحظة: ينصح العلاج الدناز قبل استخدام الحمض النووي الريبي في التطبيقات المصب. هذا العلاج لا يمكن أن يؤديها على بعض الأعمدة تنقية الحمض النووي الريبي قبل خطوة الغسيل، وعند هذه النقطة المحددة التالية العمود شطف، أو على قسامة من الحمض النووي الريبي كخطوة أولى في أي تطبيق المصب. وينبغي أن يكون الحمض النووي الريبي مستقرا لعدة سنوات.

4. تحليل النسيجي بواسطة مناعي Staininغرام من Cryosections العضلات

  1. بروتوكول المناعي بسيط.
    1. استخدام قلم مسعور للدوران حول مجموعة من الفروع في كل شريحة. إسقاط بلطف برنامج تلفزيوني في منطقة حلقت (حوالي 80 ميكرولتر لمساحة صغيرة تصل إلى 500 ميكرولتر لمساحة كبيرة)، والحرص على عدم لمس الأنسجة. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: في حالة استخدام شرائح المجمدة، وإزالة الشرائح من -80 درجة مئوية الفريزر ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 إلى 30 دقيقة إلى ذوبان الجليد والجافة، ثم المضي قدما على النحو الوارد أعلاه. وهناك حاجة إلى اثنين على الأقل من الشرائح: شريحة تجريبية واحدة إلى أن حضنت في الأجسام المضادة الأولية والثانوية. ويتم استبعاد شريحة واحدة التحكم الذي الضد الابتدائي، و "الثانوية فقط" السيطرة.
    2. تلميح الشريحة صب قبالة برنامج تلفزيوني. إضافة 5٪ المصل حمار في برنامج تلفزيوني (عرقلة الحل) إلى منطقة دائري. كن حذرا للتأكد من أن أقسام العضلات لا تجف. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة (أو حتى عدة ساعات في غرفة الرطوبة).
    3. يعد حل الأجسام المضادة الأولية لتحليل تجديد العضلات. مزيج عرقلة الحل، مع الأجسام المضادة eMHC (01:40)، والأجسام المضادة ColVI (1: 1000). إعداد ما يقرب من 150 ميكرولتر 300 ميكرولتر أو 500 ميكرولتر للشركات الصغيرة والمتوسطة، أو المناطق شريحة كبيرة، على التوالي. دوامة لمدة 5 ثوان، ثم الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 15000 x ج لتكوير أي راسب.
    4. للشرائح التجريبية، تقلب الشريحة صب قبالة عرقلة الحل ثم قم بإضافة حل الأجسام المضادة الأولية من 4.1.3. للشريحة تحكم الثانوية، تقلب الشريحة صب قبالة عرقلة الحل ثم قم بإضافة عرقلة الحل الطازجة (أي الأجسام المضادة). احتضان الشرائح في غرفة الرطوبة في 4 درجات مئوية خلال الليل.
      ملاحظة: عندما pipetting لحلول الأجسام المضادة على الشرائح، دائما سحب السائل من أعلى الأنبوب حل الأجسام المضادة الأولية، لا تعطيل أي راسب في الجزء السفلي من الأنبوب.
    5. نصيحة الشرائح صب قبالة حل. إضافة برنامج تلفزيوني قطرة قطرة إلى المنطقة حلقت من كل شريحة لغسل، تلميح إلى صبالخروج، ثم إضافة المزيد من برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 3 إلى 5 دقائق. كرر ما مجموعه ثلاثة يغسل.
      ملاحظة: الساعة غسل مرنة للغاية ويمكن أن تطول مدة تصل إلى 20 دقيقة إذا رغبت في ذلك. عموما، فإن عددا من التغييرات الحل هو أكثر أهمية من ذلك الوقت.
    6. يعد حل الضد الثانوية لجميع الشرائح (بما في ذلك الشريحة تحكم الثانوية) باستخدام 1: 500 التخفيف من الأجسام المضادة الثانوية الحمراء والخضراء إلى جانب fluorophore للكشف IgG1 الماوس (eMHC) والأرنب مفتش (ColVI) و 1: 10000 التخفيف من دابي النووية وصمة.
      1. على سبيل المثال، مزيج 1 ميكرولتر من دابي مع 9 ميكرولتر من ده 2 O لجعل 01:10 التخفيف من دابي. ثم، ل500 الحجم النهائي ميكرولتر، إضافة 1.0 ميكرولتر مكافحة فأر IgG1 الحمراء + 1.0 ميكرولتر المضادة للأرنب، مفتش الأخضر + 0.5 ميكرولتر من 01:10 دابي إلى 447.5 ميكرولتر من عرقلة الحل. دوامة لخلط وأجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 15000 x ج لتكوير أي راسب.
        ملاحظة: من الناحية المثالية، ينبغي أن تكون جميع الأجسام المضادة الثانوية من الأنواع المضيفة نفسها.
    7. تلميح الشرائح صب قبالة غسل برنامج تلفزيوني الماضي. إضافة حل الضد الثانوية لتغطية جميع أنسجة. تغطية الشرائح لحمايتها من الضوء ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: يجب التحقق من صحة جميع الأجسام المضادة الثانوية لديهم الحد الأدنى من التفاعل عبر مع الأنواع الأخرى في التجارب وضع العلامات المزدوجة.
    8. تغسل الشرائح كما هو موضح في 4.1.5. بعد غسل الماضي، تقلب الشريحة لتخلصي من برنامج تلفزيوني ووضع الشريحة على الأنسجة. إضافة 3-4 قطرات من وسائل الإعلام تصاعد مائي على طول جانب واحد.
    9. تعيين حافة ساترة الزجاج فقط إلى الحافة الخارجية من وسائل الإعلام في تصاعد مستمر. باستخدام ملقط، خفض ببطء ساترة نحو الأنسجة، ثم، والإفراج عن ساترة وبلطف اضغط عليها في الموقف. أخيرا، اضغط بلطف كل ركن من أركان ساترة لتحقيق الاستقرار فيه.
    10. حماية الشرائح من الضوء وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
      ملاحظة: للتخزين على المدى الطويل، وتطبيق طبقة رقيقة من طلاء الأظافر على طول حافة عشرالبريد ساترة للمساعدة في منع الشريحة من الجفاف.
  2. التقييم النسيجي.
    1. صورة الشرائح باستخدام epifluorescent أو مبائر مع الفلاتر المناسبة للكشف عن eMHC (الأحمر)؛ ColVI (الأخضر)؛ والنوى (الأزرق) دابي الملون، وعادة ما تستخدم لموضوعي 20X 1،5.
    2. تأكد من أن إشارة الفلورسنت من الشرائح التجريبية تختلف عن الشريحة تحكم الثانوية للتدليل على خصوصية eMHC وColVI كشف 4.
      ملاحظة: يجب أن تكون eMHC الألياف تجديد إيجابية واضحة من ما يقرب من 2-7 أيام بعد تعافيه من اصابة في العضلات وبنسب مختلفة في الفئران مع ضمور العضلات. الكولاجين السادس هو موجود في المصفوفة خارج الخلية المحيطة ألياف العضلات والأوعية الدموية، والأعصاب وفي حزم النسيج الضام أكبر من peri- وغمد العضلة. دابي وصمة عار النووية هي مفيدة لتحديد ألياف العضلات مع نواة مركزية مقابل نوى الطرفية مشيرا إلى تجديد الألياف، ووجود طnfiltrating الخلايا. الألياف الميتة أو إصابة قد وصمة عار ضعيفة مع الأجسام المضادة الثانوية الماوس مفتش بسبب الكشف عن الذاتية مفتش أن تخترق الألياف من خلال أغشية العضلات التالفة.
    3. لتحديد تجديد، والتقاط الصور المجهر متداخلة مع بعضها مرشح الفلورسنت عبر كامل الصورة. دمج الصور eMHC، ColVI ودابي لكل موقع ثم محاذاة الصور لإعادة بناء خريطة لكامل القسم 1،5.
    4. استخدام برامج التحليل، والاعتماد على عدد من eMHC الألياف الإيجابية وعدد من إجمالي الألياف لحساب التجديد الأخير (مجموع الألياف 100 * (# eMHC + ألياف / #)). أيضا، الاعتماد على عدد من الألياف الأنوية مركزيا من مجموع الألياف لقياس تجديد على مدى فترة أطول (100 * (# CN + ألياف / # مجموعه البروتين)) 1،5.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

cryosection العضلات RNA عالية في الجودة ويوفر العائد كافية لمعظم التطبيقات

وأظهرت التحاليل التي أجريت على ستة عشر الاستعدادات العضلات والهيكل العظمي RNA في الجدول 1 باستخدام 19،4 حتي 41 ملغ من المجمعة الظنبوبي الأمامي (TA) في العضلات من 8 السيطرة على الفئران. كل من اليسار (L) وأعدت الحق العضلات (R) TA في التجارب تجديد مع العضلات التي ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

لتحقيق أفضل النتائج مع هذا الأسلوب، والحفاظ على تضمين الراتنج يقتصر على الثلث السفلي أو نصف العضلات أثناء الحفظ بالتبريد الأنسجة بسبب الراتنج الزائد سيتباطأ جمع cryosections المجمعة وقد يزيد تضمين تلوث الراتنج في عزل الحمض النووي الريبي. أيضا، عناية فائقة خلال التجانس إبرة مهم لتعظيم العائد وتقليل احتمال انسداد الإبرة. يجوز تعديل بروتوكول باستخدام محقنة لور-لوك لحماية ضد فقدان العينة إذا أصبح الإبرة منعت ويتطلب ارتفاع ضغط لإزاحة تسد. خطوة إضافية إبرة التجانس مع 25 أو 26 إبرة قياس ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

تعلن صاحبة البلاغ أنه ليس لديها مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

ماديسون جرانت وستيفن فولتز وهالي زاستري وجونا لوان قدم المساعدة الفنية. تم دعم البحث الوارد في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني لالتهاب المفاصل وأمراض الجهاز العضلي الهيكلي والجلد التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب الجائزة رقم AR065077. المحتوى هو مسؤولية المؤلف وحده ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
كوركVWR Scientific23420-708مقطعة إلى مربعات صغيرة بشفرة حادة.
غطاء بلاستيكيفيشر Scientific12-547يستخدم لتوجيه العضلات أثناء التجميد.
ميزان حرارة منخفضVWR Scientific89370-158
2-methylbutaneSigmaM32631-4Lتحذير: مادة كيميائية خطرة. تخزينها في خزانة قابلة للاشتعال.
تضمين الراتنج: "المصفوفة التبريدية"6769006 Thermo Fisher Scientificيمكن استبدال راتنجات التضمين الأخرى بالمصفوفة التبريدية.
CryostatThermo Fisher Scientificmicrom HM550 مع حامل شفرة يمكن التخلص منهيجب أن يكون أي ناظم ناظم للحرارة كافيا للبروتوكول.
شفرة ناظم البرد يمكن التخلصمنها Thermo Fisher Scientific3052835استخدم شفرة أو سكينا مناسبا لاستخدام ناظم البرد.
محلول إزالة التلوث RNAse: "RNase Zap"Thermo Fisher ScientificAM9780
الميزان التحليليMettler ToledoXS64
فرشاة الطلاءDaler Rowney214900920تستخدم للتعامل مع عمليات التشريح بالتبريد. يمكن العثور عليها في المتاجر التي تحتوي على مستلزمات فنية بسيطة.
شفرة الحلاقةVWR Scientific55411-050
شريحة المجهرVWR Scientific48311600
RNA الكاشف العضوي للاستخلاص: TRIzolThermo Fisher Scientific15596026تحذير: TRIzol مادة كيميائية خطرة. ملاحظة: يوصى باستخدام كواشف الاستخراج العضوية فقط لاستخراج الحمض النووي الريبي من العضلات الهيكلية.
إبرة قياس 18VWR ScientificBD305185
22 إبرةقياس VWR ScientificBD305155
26 إبرةقياس VWR ScientificBD305115اختياري. يمكن استخدامها لجولة ثالثة من تجربة العينة في بروتوكول استخراج الحمض النووي الريبي.
حقنة 1 ملVWR ScientificBD309659بالنسبة للعينات عالية القيمة ، يوصى باستخدام حقنة Luer-Lok ( على سبيل المثال < / i> ، VWR BD309628).
1-برومو -3-كلوروبنتان (BCP)سيجماB9673
ل 70٪ من الإيثانول في مياه DEPC: 200 كحول مقاوملشركة Decon Laboratories، Inc.+M18027161Mامزج 35 مل 200 كحول برهان + 15 مل ماء DEPC.
للحصول على 70٪ من الإيثانول في مياه DEPC: المياه المعالجة DEPCThermo Fisher ScientificAM9922Mix 35 مل 200 كحول مقاوم + 15 مل ماء DEPC.
طقم تنقية الحمض النووي الريبي: PureLink RNA minikitThermo Fisher Scientific12183018Aالخطوات النهائية لإعداد الحمض النووي الريبي.
مياه خالية من DNase / Rnase يمكن أيضا استخدام المياه المعالجةب Gibco10977
مقياس الطيف الضوئي: Nanodrop 2000Thermo Fisher ScientificNanoDrop 2000
Dnase IThermo Fisher ScientificAM2222علاج الحمض النووي الريبي المنقى لإزالة أي تلوث بالحمض النووي قبل التطبيقات النهائية.
قلم كاره للماءThermo Fisher Scientific8899
Dulbecco's PBSGibco14190PBS لبروتوكول التألق المناعي.
مصل الحمارJackson ImmunoResearch Laoratories, Inc017-000-121قم بترطيب مخزون مصل الحمير العادي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، ثم قم بتخفيف كمية إلى 5٪ للتألق المناعي. يمكن أيضا استخدام مصل الماعز العادي.
الأجسام المضادة eMHCجامعة أيوا للدراسات التنموية بنك الورم الهجينF1.652
الجسم المضاد للكولاجين السادسفيتزجيرالدإندستريز#70R-CR009x
الحمار المضاد للأرانب AlexaFluor488Thermo Fisher ScientificA21206
الماعز المضاد للفأر IgG1 AlexaFluor546Thermo Fisher ScientificA21123
DAPI (4 '، 6- diamidino-2-phenylindole)Thermo Fisher ScientificD1306
وسائط التركيب المائية: PermafluorThermo Fisher ScientificTA-030-FMاستخدم فقط وسائط التركيب المصممة لتطبيقات الفلورسنت ذات الخصائص المضادة للبهتان.
غطاء زجاجيVWR Scientific16004-314استخدم لتركيب الشرائح في نهاية protocl التألق المناعي
برنامج تحليل الصور: ImageProExpressMedia Cybernetics، Inc.أن يعمل Image-Pro Express أو المنتجات الأكثر تقدماالمجانية ImageJ أيضا على العد اليدوي. قد تسمح البرامج الأكثر تقدما مع قابليات التجزئة بالتشغيل الآلي الجزئي للعملية. على سبيل المثال< / em> ، ImageProPremier.
دمج ورسم خرائط الصور: تم إيقاف PhotoshopAdobePhotoshop
CardiotoxinSigmaC9659Sigma C9659. الخيارات الأخرى لسموم القلب هي EMD Millipore # 217503; شركة الكيماويات الأمريكية المخصصة # BIO0000618 ؛ أو Ge Script # RP17303 ؛ لكن لم يتم التحقق من صحة هذه.
طقم النسخ العكسي: نظام توليف الخيط الأول Superscript IIIThermo Fisher Scientific18080051يمكن استخدام أي كواشف نسخ عكسي عالية الجودة تم التحقق من صحتها.
PCR القياسي: نظام بوليميراز مرن GoTaqPromegaM8298يمكن استخدام أي نظام Taq polymerase عالي الجودة تم التحقق من صحته. إذا كان سيتم استخدام تسلسل الحمض النووي لأي تطبيق في اتجاه مجرى تفاعل البوليميراز المتسلسل ، فيجب استخدام نظام تفاعل البوليميراز المتسلسل عالي الدقة بدلا من ذلك.
SYBR الأخضرثيرمو فيشر العلميS7585للاستخدام في qPCR عند عدم استخدام مزيج رئيسي مخصص من qPCR. استخدم مع SuperROX (لأدوات الأنظمة الحيوية التطبيقية) و GoTaq Flexi polymerase والمخازن المؤقتة.
ROX: SuperROX ، 15 mMBioResearch Technologies، Inc. Novato CASR-1000-10SuperROX أكثر استقرارا في تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، لذلك يفضل استخدامه كصبغة مرجعية سلبية qPCR على ROX (كربوكسي-X-رودامين). ل qPCR مع أدوات الأنظمة الحيوية التطبيقية
في الوقت الحقيقي PCRApplied Biosystems7900HT
DEPC.يجب

المراجع

  1. Foltz, S. J., et al. Abnormal skeletal muscle regeneration plus mild alterations in mature fiber type specification in Fktn-Deficient Dystroglycanopathy Muscular Dystrophy Mice. PLoS One. 11 (1), 0147049(2016).
  2. Bartoli, M., et al. Noninvasive monitoring of therapeutic gene transfer in animal models of muscular dystrophies. Gene Ther. 13, 20-28 (2006).
  3. Ip, W. T., Huggins, C. E., Pepe, S., Delbridge, L. M. Evaluating RNA preparation options for archived myocardial biopsies. Heart Lung Circ. 20 (5), 329-331 (2011).
  4. Beedle, A. M., et al. Mouse fukutin deletion impairs dystroglycan processing and recapitulates muscular dystrophy. J. Clin. Invest. 122 (9), 3330-3342 (2012).
  5. Foltz, S. J., et al. Four-week rapamycin treatment improves muscular dystrophy in a fukutin-deficient mouse model of dystroglycanopathy. Skeletal Muscle. 6, 20(2016).
  6. AVMA Guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. , American Veterinary Medical Association (AVMA). Available from: www.avma.org/KB/Policies/Pages/Euthanasia-Guidelines.aspx 1-102 (2013).
  7. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nat. Protoc. 10, 1612-1624 (2015).
  8. Rump, L. V., Asamoah, B., Gonzalez-Escalona, N. Comparison of commercial RNA extraction kits for preparation of DNA-free total RNA from Salmonella cells. BMC Res. Notes. 3, 211(2010).
  9. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J. Vis. Exp. (45), e2565(2010).
  10. Valdez, M. R., Richardson, J. A., Klein, W. H., Olson, E. N. Failure of Myf5 to support myogenic differentiation without myogenin, MyoD, and MRF4. Dev Biol. 219 (2), 287-298 (2000).
  11. Pavlath, G. K., Dominov, J. A., Kegley, K. M., Miller, J. B. Regeneration of transgenic skeletal muscles with altered timing of expression of the basic helix-loop-helix muscle regulatory factor MRF4. Am. J. Pathol. 162 (5), 1685-1691 (2003).
  12. Chomczynski, P., Mackey, K. Substitution of chloroform by bromo-chloropropane in the single-step method of RNA isolation. Anal. Biochem. 225 (1), 163-164 (1995).
  13. Lee, J. T. Y., Cheung, K. M. C., Leung, V. Y. L. Extraction of RNA from tough tissues with high proteoglycan content by cryosection, second phase separation and high salt precipitation. J. Biol. Methods. 2 (2), 20(2015).
  14. Guo, D., Catchpoole, D. R. Isolation of intact RNA following cryosections of archived frozen tissue. BioTechniques. 34, 48-50 (2003).
  15. Goodpaster, T., Randolph-Habecker, J. A flexible mouse-on-mouse immunohistochemical staining technique adaptable to biotin-free reagents, immunofluorescence, and multiple antibody staining. J. Histochem. Cytochem. 62 (3), 197-204 (2014).
  16. Ikezawa, M., Minami, N., Takahashi, M., Goto, Y., Miike, T., Nonaka, I. Dystrophin gene analysis of 130 patients with Duchenne muscular dystrophy with a special reference to muscle mRNA analysis. Brain Dev. 20 (3), 165-168 (1998).
  17. Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle. Anal. Biochem. 474, 25-27 (2015).
  18. Espina, V., Heiby, M., Pieroban, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert Rev Mol Diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

RNA
Cryosectioning المناطق المتاخمة من العضلات الهيكلية واحدة فأرة للالتعبير الجيني والتحليلات النسيجية
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.