رسم خريطة الموقع ملزم لأبتمر على ATP عن طريق الميكروسكيل Thermophoresis

ملخص

MicroScale Thermophoresis (MST) هي تقنية حساسة لتوصيف تفاعلات aptamer المستهدفة. تصف هذه المخطوطة بروتوكول MST لتوصيف تفاعلات الجزيئات الصغيرة aptamer.

الملخص

يعد توصيف التفاعلات الجزيئية من حيث معلمات الربط الأساسية مثل تقارب الربط ، وقياس التكافئ ، والديناميكا الحرارية خطوة أساسية في العلوم الأساسية والتطبيقية. الرحلان الحراري MicroScale (MST) هو طريقة فيزيائية حيوية حساسة للحصول على هذه المعلومات المهمة. بالاعتماد على تأثير فيزيائي يسمى الرحلان الحراري ، والذي يصف حركة الجزيئات من خلال تدرجات درجة الحرارة ، تسمح هذه التقنية بالتحديد السريع والدقيق لمعلمات الربط في المحلول وتسمح بالاختيار الحر لظروف المخزن المؤقت (من المخزن المؤقت إلى المحللات / السيلا). يستخدم MST حقيقة أن الجزيء غير المرتبط يعرض حركة حرارية مختلفة عن الجزيء المعقد مع شريك ملزم. تتغير الحركة الحرارية في لحظة التفاعل الجزيئي بسبب التغيرات في الحجم والشحنة وغلاف الترطيب. من خلال مقارنة ملامح الحركة للنسب الجزيئية المختلفة لشريكي الربط ، يمكن تحديد المعلومات الكمية مثل تقارب الربط (pM إلى mM). حتى التفاعلات الصعبة بين الجزيئات ذات الأحجام الصغيرة ، مثل الأبتامير والمركبات الصغيرة ، يمكن دراستها بواسطة MST. باستخدام تفاعل النموذج المدروس جيدا بين DH25.42 DNA aptamer و ATP ، توفر هذه المخطوطة بروتوكولا لتوصيف تفاعلات aptamer - الجزيئات الصغيرة. توضح هذه الدراسة أن MST حساس للغاية ويسمح برسم خرائط لموقع الارتباط لأبتامر الحمض النووي 7.9 كيلو دالتون إلى الأدينين من ATP.

المقدمة

التفاعل بين الجزيئات هو أساس الطبيعة. ومن هنا، والعلماء في العديد من مجالات البحوث الأساسية والتطبيقية محاولة لفهم المبادئ الأساسية للتفاعلات الجزيئية من أنواع مختلفة. الميكروسكيل Thermophoresis (MST) تمكن العلماء من أداء ودقيقة، وتوصيف سريع، ومراقبة الجودة فعالة من حيث التكلفة من التفاعلات الجزيئية في الحل، مع حرية اختيار المخازن. وهناك بالفعل أكثر من 1000 المنشورات باستخدام MST، اعتبارا من عام 2016 وحده، واصفا أنواع مختلفة من التحليلات، بما في ذلك عروض مكتبة، ملزمة التصديقات الحدث، فحوصات المنافسة، والتجارب مع شركاء ملزم متعددة ^1-8. بشكل عام، يسمح MST دراسة المعلمات ملزمة الكلاسيكية، مثل تقارب ملزمة (بعد الظهر لملم....

البروتوكول

1. إعداد المخزون العمل أبتمر

1. اتبع إرشادات الشركة المصنعة وحل النوكليوتيد (5 Cy5-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3، سلسلة من مرجع ¹⁸⁾ في الماء لتصل إلى تركيز النهائي 100 ميكرومتر.
2. إعداد الحل أبتمر العمل التي تمييع الأسهم النوكليوتيد إلى 200 نيوتن متر مع العازلة ملزمة (20 ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.6، 300 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملي MgCl _2، 0.01٪ Tween20).
3. احتضان الخليط لمدة 2 دقيقة عند 90 درجة مئوية، والسماح للعينة يبرد على الف....

النتائج

في هذه الدراسة، تم تطبيق MST لتميز موقع ملزم للأبتمر DH25.42 الحمض النووي ¹⁸ على ATP. وعلى النقيض من الدراسات الأخرى التي تميز تفاعل ATP أو ATP-محاكاة جزيئات صغيرة مع البروتينات وصفت بشكل عشوائي مع واحد أو أكثر من fluorophores ^38-40، وتشمل هذه الدراسة نسخة المسمى من أبتمر 7.9 كيلو دالتون ssDNA مع واحد جزيء Cy5 في نهاية 5' . المشتقات ATP مختلفة والجزيئات ذات الصلة، وجميع المختلفة من ATP في مناصب مختلفة استخدمت، لرسم خريطة ل.......

المناقشة

مراقبة الجودة:

غير محددة الشائكة / امتصاص مادة العينة على الأسطح، وكذلك آثار التجميع، يكون لها تأثير كبير على نوعية البيانات تقارب. ومع ذلك، سوى عدد قليل من التقنيات للدولة من بين الفن وتوفر خيارات دقيقة وسريعة لرصد وتجنب هذه الآثار. تقدم MST ضوابط الجودة المتكاملة التي تكشف عن وتساعد على التغلب على هذه القضايا، والسماح لتحسين تدريجي من الإعداد التقني. ويمكن استخراج معلومات مهمة عن الشائكة ومضان الآثار من الفحص الشع.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
أبتامر ملزمة عازلة			20 ملي مولار تريس الرقم الهيدروجيني 7.6; 300 مللي كلوريد الصوديوم; 5 مللي مولار MgCl2; 0.01٪ Tween-20
ATP aptamer IDT	, Leuven, Belgium		التسلسل: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT- ATTGCGGAGGAAGG-3
ATP	Sigma Aldrich, Germany	A2383	حلول مخزون 10 ملي مخزنة عند - 20 درجة ؛ C
ADP	Sigma Aldrich, Germany	A2754	10 ملي محاليل مخزون مخزنة عند - 20 درجة ؛ C
AMP	Sigma Aldrich, Germany	A2252	10 ملي محاليل مخزون مخزنة عند - 20 درجة ؛ C
Adenine	Sigma Aldrich ، ألمانيا   ؛	A8626	حلول مخزون 10 ملي مخزنة عند - 20 درجة ؛ C
SAM	Sigma Aldrich, Germany	A7007	10 ملي محاليل مخزون مخزنة عند - 20 درجة ؛ C
dATP	Sigma Aldrich, Germany	11934511001	10 ملي محاليل مخزون مخزنة عند - 20 درجة ؛ C
CTP	Sigma Aldrich, Germany	C1506	حلول مخزون 10 ملي مخزنة عند - 20 درجة ؛ C
GTP	Sigma Aldrich, Germany	حلول مخزون G8877	10 ملي مخزنة عند - 20 درجة ؛ C
Monolith NT.115	NanoTemper Technologies ، ميونيخ ، ألمانيا	MO-G008	MST أزرق / أحمر مع كاشف قياسي ، Monolith NT115 pico هو جهاز MST مع كاشف عالي الحساسية
Monolith NT.115 الشعيرات الدموية Standard	NanoTemper Technologies ، ميونيخ ، ألمانيا	MO-K002
أنابيب Eppendorf PCR	Eppendorf ، ألمانيا	30124537
برنامج التحكم Monolith. 2.1.33 ، مثبت مسبقا على الجهاز	تقنيات NanoTemper ، ميونيخ ، ألمانيا
تحليل MO.affinity v2.1.1	NanoTemper Technologies ، ميونيخ ، ألمانيا
Kaleidagraph 4.5.2	برنامج

جهاز التآزر