Method Article

نظام ميكروفلويديك مع الزخرفة السطحية للتحقيق فقاعة التجويف (ق) التفاعل -Cell وBioeffects الناتجة على مستوى وحيدة الخلية

DOI:

10.3791/55106

⸱

January 10th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Mechanical Engineering and Materials Science, Duke University, 2Huacells Corp

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = 'jove_content'> تم تصنيع رقاقة مائع دقيقة لإنتاج أزواج من النقاط الذهبية لتوليد الفقاعات الترادفية والجزر المطلية بالألياف الفيبرونكتين لتزيين الخلية المفردة في مكان قريب. تميز مجال التدفق الناتج بقياس سرعة صورة الجسيمات وتم استخدامه لدراسة التأثيرات الحيوية المختلفة ، بما في ذلك ثقب غشاء الخلية ، وتشوه الغشاء ، واستجابة الكالسيوم داخل الخلايا.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه المخطوطة، علينا أولا وصف بروتوكول تصنيع رقاقة ميكروفلويديك، مع نقاط الذهب والمناطق المغلفة فبرونيكتين على الركيزة الزجاج نفسها، التي تسيطر على وجه التحديد توليد فقاعات جنبا إلى جنب والخلايا الفردية نمط قريب مع مواقع محددة جيدا والأشكال. نحن ثم تثبت توليد فقاعات جنبا إلى جنب باستخدام اثنين من الليزر نابض إلقاء الضوء على زوج من النقاط الذهبية بزمن تأخير بضعة-ميكروثانية. نحن تصور التفاعل فقاعة فقاعة وتشكيل الطائرة من قبل التصوير فائق السرعة وتميز مجال تدفق الناتجة باستخدام السرعة بواسطة الصور الملتقطة للجسيمات (التعريف الشخصية). وأخيرا، فإننا نقدم بعض تطبيقات هذه التقنية لتحليل خلية واحدة، بما في ذلك خلايا الغشاء poration مع امتصاص جزيء، محلية تشوه غشاء يحددها النزوح من الخرز ملزم إنتغرين المرفقة، والاستجابة الكالسيوم داخل الخلايا من التصوير ratiometric. نتائجنا تظهر أن تدفق النفث السريع والاتجاه هو للمحترفينالتي تنتجها التفاعل جنبا إلى جنب فقاعة، والتي يمكن فرض إجهاد القص المترجمة للغاية على سطح خلية نمت على مقربة. وعلاوة على ذلك، bioeffects مختلفة يمكن أن يتسبب من خلال تغيير قوة تدفق النفث عن طريق ضبط المسافة المواجهة من الخلية إلى فقاعات جنبا إلى جنب.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هناك اعتراف متزايد بأن عدم التجانس الخلوية، الناشئة عن التعبير العشوائية من الجينات والبروتينات، والأيض، يوجد ضمن مجموعة من السكان خلية كبيرة وبمثابة المبدأ الأساسي في علم الأحياء للسماح للتكيف الخلية وتطورها 1. لذلك، غالبا ما يكون غير دقيق ولا يمكن الاعتماد عليها لاستخدام القياسات معظم السكان على أساس لفهم وظيفة الخلايا الفردية وتفاعلاتها. تطوير تقنيات جديدة لتحليل خلية واحدة ولذلك من فائدة عالية في الأبحاث البيولوجية والدوائية، ويمكن استخدامها، على سبيل المثال، لفهم أفضل لمسارات الإشارات الرئيسية وعمليات بيولوجية الخلايا الجذعية وعلاج السرطان 2-4. في السنوات الأخيرة، وظهور منصات ميكروفلويديك سهلت كثيرا تحليل وحيدة الخلية، حيث أجريت لتحديد المواقع، والعلاج، ومراقبة الاستجابة من الخلايا الفردية مع استراتيجيات تحليلية جديدة 5.

يلعب التجويف دورا هاما في مجموعة متنوعة من التطبيقات الطبية الحيوية، بما في ذلك علاج السرطان من خلال كثافة عالية تركز الموجات فوق الصوتية (HIFU) 6، وتجزئة غير الغازية من حصى الكلى التي كتبها موجة صدمة تفتيت الحصوات (SWL) 7، المخدرات أو الجينات تسليم بواسطة صوتنة الخلايا 8، وتدمير ذكرت مؤخرا من الخلايا أو الأنسجة الهيدروديناميكية 9،10 فقاعة التجويف. على الرغم من هذا، والعمليات الديناميكية للفقاعة التجويف (ق) التفاعل مع الأنسجة البيولوجية والخلايا لم يتم فهمها جيدا. ويرجع ذلك إلى العشوائية في التجويف بدء وفقاعة ديناميات المنتجة بواسطة الموجات فوق الصوتية، وموجات الصدمة، والضغط الهيدروليكي المحلي هذا. علاوة على ذلك، هناك نقص تمكين التقنيات لحل استجابات معقدة بطبيعتها وسريعة من الخلايا البيولوجية، وخاصة على مستوى خلية واحدة.

وبسبب هذه التحديات، فإنه ليس من المستغرب أن دراسات قليلة جدا لها النحلذكرت ن للتحقيق في التفاعلات فقاعة خلية تحت ظروف تجريبية تسيطر عليها بشكل جيد. على سبيل المثال، غشاء poration من الخلايا الفردية محاصرين في تعليق 11 ولقد ثبت تشوه كبير من خلايا الدم الحمراء في الانسان 12 التسرع باستخدام الفقاعات واحدة ولدت ليزر في قنوات ميكروفلويديك. هذه التقنية الأخيرة، ومع ذلك، يمكن أن تنتج فقط تشوه صغير جدا في الخلايا حقيقية النواة بسبب وجود نواة 13. وعلاوة على ذلك، فإنه من الصعب رصد bioeffects المصب عند معالجة الخلايا في تعليق. في دراسات أخرى، تم الإبلاغ عن الموجات فوق الصوتية الإثارة من متجهة خلية microbubble (أو وكيل الموجات فوق الصوتية على النقيض) لإنتاج poration الغشاء و / أو ردود الكالسيوم داخل الخلايا في الخلايا الملتصقة واحدة 8. غشاء poration من الخلايا الملتصقة واحدة يمكن أيضا أن تنتج عن طريق استخدام فقاعات جنبا إلى جنب ولدت ليزر في طبقة السائل رقيقة تحتوي على امتصاص ضوء التريبان حل الأزرق 14، أوقبل فقاعة غاز تتأرجح الناتجة عن نبضات الليزر ميكروثانية اضاءة من خلال الركيزة استيعاب بصريا في microchambers 15. بالمقارنة، الركيزة استيعاب بصريا لديها ميزة على التريبان حل الزرقاء تمتص الليزر لأن هذه الأخيرة هي سامة على الخلايا. الأهم من ذلك، فقاعات ولدت ليزر هي أكثر يمكن السيطرة عليها من حيث حجم فقاعة، والمكان من فقاعات متحمس سمعيا. ومع ذلك، في كل هذه الدراسات السابقة، لم تسيطر على شكل الخلية، والتوجه، وشروط الانضمام التي قد تؤثر بشكل كبير على استجابة الخلايا وbioeffects التي تنتجها الضغوط الميكانيكية 16.

للتغلب على هذه العوائق في الدراسات السابقة، وقد وضعنا مؤخرا نظام تجريبي لتوليد فقاعة، الزخرفة الخلية، والتفاعلات فقاعة فقاعة خلايا، في الوقت الحقيقي واختبارات بيولوجية من استجابة الخلايا في شريحة ميكروفلويديك شيدت باستخدام مزيج فريد من ميتاليك التصنيع الدقيقiques. ثلاثة السمات الرئيسية التي تميز نظام تجريبي لدينا من الآخرين في هذا المجال هي: 1) الزخرفة من النقاط الذهب ميكرون الحجم على الركيزة الزجاج لتمكين امتصاص الليزر الموضعي لتوليد فقاعة 17؛ 2) الزخرفة من الجزر ميكرون الحجم من المصفوفة خارج الخلية (ECM) للالتصاق الخلية على الركيزة نفسه للسيطرة على كل من الموقع وهندسة الخلايا الفردية. و3) ضغط البعد عن مجال التفاعل فقاعة فقاعة خلية من 3D إلى الفضاء 2D شبه لتسهيل التصور في الطائرة من التفاعلات فقاعة فقاعة، النفث مجالات التدفق، تشوه الخلايا، وbioeffects، كل المأسورة في واحد تسلسل التصوير مبسط (1D الشكل).

figure-introduction-1
الشكل 1: رقاقة ميكروفلويديك والخطط من فحوصات مختلفة. أ) رقاقة ميكروفلويديك تجميعها مع قنوات مليئة بالحبر الأزرق التصور. ب) المنطقة داخل رقاقة ميكروفلويديك مع خلايا المزخرفة والنقاط الذهب (المسافة بين النقاط ذهبيتين في القرب هو 40 ميكرون). العديد من الأزواج من وحدات العمل يمكن ترتيبها في القناة. ج) عن قرب صورة وحدة عمل واحدة تتكون من زوج من النقاط الذهبية وخلية هيلا انضمت إلى المنطقة خلية الزخرفة. د) تخطيطي لعملية الجهاز. خلية واحدة تلتزم وينتشر على "H" جزيرة على شكل المغلفة مع فبرونيكتين. ويتم إنتاج زوج من فقاعات التجويف (جنبا إلى جنب فقاعة) مع المضادة للمرحلة التذبذب التي كتبها إلقاء الضوء على أشعة الليزر نابض على النقاط الذهب (انظر الشكل 4A)، مما يؤدي إلى توليد طائرة سريعة والمحلية تتجه نحو الخلية المستهدفة في مكان قريب. قد تكون مشوهة الخلية، porated لامتصاص الجزيئات، و / أو حفز مع استجابة الكالسيوم، تبعا للمسافة المواجهة (S د) من الخلية إلى فقاعة جنبا إلى جنب.و = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55106/55106fig1large.jpg" الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

هذا البرنامج يمكن زيادة جنبا إلى جنب مع فحوصات مضان والخرز functionalized تعلق على سطح الخلية لbioeffects الناجم عن التجويف. على وجه الخصوص، هذه المنصة تفتح الطريق لفحوصات موثوقة وقابلة للقياس على مستوى خلية واحدة. حتى الآن، وقد استخدمنا جهاز لتحليل الناجم عن فقاعة، جنبا إلى جنب تشوه غشاء الخلية، poration الخلية وامتصاص الخلايا، والسلامة، موت الخلايا المبرمج، والاستجابة الكالسيوم داخل الخلايا. في بروتوكول التالية، ونحن وصف عملية رقاقة تلفيق وإجراءات لتحليل مختلف bioeffects المذكورة أعلاه. وعلاوة على ذلك، تم وصفها أيضا عمليات رقاقة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. التصنيع الدقيق

يتم تنفيذ جميع إجراءات التصنيع الدقيق في غرف الأبحاث: ملاحظة. تم تصميم قناع الكروم قبل التصنيع الدقيق، انظر الشكل 2.

figure-protocol-1
الشكل 2: رسم تخطيطي للتصميم القناة في رقاقة ميكروفلويديك وأبعاد وحدات العمل. أ) تصميم قناع و microchannels محاذاة PDMS (الخضراء) وأنماط على الركيزة الزجاج (الأزرق والأحمر). ب) صورة مكبرة لتصميم قناع في قسم التمثيل في صفوف وحدة العمل. ج) رسم تخطيطي لوحدة عمل واحد تبين وجود نمط الخلية (الأزرق) وزوج من النقاط الذهب (الحمراء). وترد جميع المقاييس طول على اليمين السفلي. الرجاء انقر هنا لعرض لارنسخة الالماني من هذا الرقم.

  1. الذهب نقطة الزخرفة
    ملاحظة: تبلغ مساحة كل نقطة الذهب تم تصميمه ليكون ضمن 25-30 ميكرون 2، بحيث تكون كبيرة بما يكفي لاستيعاب طاقة الليزر لتوليد فقاعة، ولكن صغيرة بما يكفي لتجنب الخلايا الفردية التمسك بها. ويظهر رسم تخطيطي للذهب نقطة تلفيق في الشكل 3A.
    1. شريحة زجاجية تنظيف (في غطاء الكيميائية)
      1. مسح شريحة زجاجية مع الأسيتون تليها ايزوبروبيل (IPA)، ثم جففه مع تدفق N 2.
      2. نقع الشريحة في حل سمكة البيرانا (H 2 SO 4: H 2 O 2 = 4: 1) لمدة 10 دقيقة.
      3. اخراج الشريحة، شطفه بالماء DI، ثم جففه مع تدفق N 2.
      4. خبز شريحة زجاجية على موقد في 120 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
      5. علاج الشريحة في آشر البلازما في 100 واط لمدة 90 ثانية.
    2. تدور طلاء (غطاء محرك السيارة تدور الطلاء)
      1. بدوره على موقد والانتظار حتى تكون درجة الحرارة مستقرة عند 95 درجة مئوية.
      2. اتبع الإجراء طلاء:
        1000 دورة في الدقيقة لمدة 5 ق مع 500 دورة في الدقيقة / ق منحدر.
        ثم 3000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية مع 1000 دورة في الدقيقة / ق المنحدر.
      3. إصلاح شريحة زجاجية تنظيف على المغطي تدور عن طريق تطبيق فراغ.
      4. تغطية سطح الشريحة مع P-20 وبدء صفة طلاء.
      5. كرر العملية لطلاء مقاوم الضوء NFR سلبية.
      6. خبز الشرائح في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 60 ثانية وانتظر حتى يبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
    3. الليثوغرافيا الضوئية
      1. جبل قناع الكروم على اليجنر قناع وتأكد من أن الجانب نمط لأسفل نحو الشريحة.
      2. تعيين صفة ضوئيه إلى وضع التعرض الثابت مع 9 الصورة من التعرض للأشعة فوق البنفسجية وبسرعة محاذاة الركيزة الزجاج مع القناع.
      3. بعد إجراء التعرض للأشعة فوق البنفسجية، خبز الشرائح في 956؛ مئوية لمدة 1 دقيقة، ثم اتركها تبرد في درجة حرارة الغرفة.
    4. تطوير
      1. تطوير نمط على الشريحة في حل المطور لمدة 60 ثانية.
      2. إزالة الشريحة من المطور، تدفق بالماء DI، وجففه مع تدفق N 2.
      3. تحقق هندسة نمط تحت المجهر، وقياس وتسجيل حجم الميزة.
    5. ترسب الذهب (شعاع E التبخر) ورفع حالا
      1. خبز الشرائح عند 120 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وندعه يبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
      2. تنظيف الشريحة مع البلازما في الجهاز رد الفعل ايون النقش (ري) لمدة 90 ق ب 500 عربة و 100 W.
      3. إيداع 5 نانومتر من منظمة الشفافية الدولية و 15 نانومتر من الاتحاد الافريقي على الشريحة باستخدام المبخر شعاع E 17.
      4. نقع الشريحة بين عشية وضحاها في كوب زجاجي يحتوي مقاومة للضوء مزيل المذيبات لإزالة يستريح الذهب على رأس NFR مقاومة.
      5. استرداد الشريحة، أنا دافقر مع الأسيتون تليها IPA، وجففه مع تدفق N 2.
      6. تجف الشريحة على طبق ساخن عند 115 درجة مئوية قبل تنظيفه في آشر البلازما الأكسجين في 100 واط لمدة 90 ثانية.
  2. الجزيئي التجمع الزخرفة من قبل انطلاقه (MAPL)
    ملاحظة: يتم تعيين مساحة كل جزيرة المغلفة فبرونيكتين أن يكون في حدود 700-900 ميكرون 2 لتسهيل الخلية هيلا كافية تنتشر في منطقة مربعة مع التقليل من فرص عدة خلايا تجميع في الجزيرة. ويظهر رسم تخطيطي لإعداد الجزر خلية الزخرفة في الشكل 3B.
    1. طلاء تدور
      1. كرر الخطوة 1.1.2، ولكن استخدام مقاومة للضوء S1813 إيجابية ودرجة حرارة 115 درجة مئوية.
    2. ضوئيه الانحياز
      1. جبل قناع الكروم على اليجنر قناع والتأكد من أن جنب مع نمط لأسفل نحو الشريحة معالنقاط الذهب.
      2. تعيين صفة ضوئيه إلى وضع التعرض الثابت مع 9 الصورة من التعرض للأشعة فوق البنفسجية.
      3. محاذاة قناع العلوي مع الشريحة السفلية باستخدام علامات المحاذاة، الواقعة على بعد نحو حافة قناع، كمرجع المكانية.
      4. تحقق الجزء المركزي من القناع والتحقق من أن ملامح نمط تتماشى بشكل صحيح.
      5. استكمال التعرض للأشعة فوق البنفسجية دون ما بعد خبز.
    3. تطوير
      1. كرر الخطوة 1.1.3 ولكن مع 45 ق التنمية قبل أن تجف على موقد والحفاظ في N 2 التخزين.
  3. علاج كيميائي
    1. إعداد الحل تخميل: 0.5 ملغ / مل PLL-ز-PEG في 10 العازلة HEPES ملم.
    2. استرداد الشريحة من N 2 تخزين وتنظيفه باستخدام ري مع إعداد المعلمة: 500 عربة الضغط، قوة 100 واط، و 90 ق المدة.
    3. ماصة قطرة واحدة من تخميل حل على قطعة من فيلم البارافين.
    4. ساندويتش الحل مع الفيلم والشرائح، والتأكد من أن جنب مع نمط ملامح لأسفل نحو الفيلم؛ تجنب تشكيل فقاعات.
    5. الانتظار لمدة 45 دقيقة قبل إزالة الشريحة من الفيلم.
    6. نقع الشريحة على التوالي في مزيل مقاومة للضوء، مزيل مقاومة للضوء وDI المياه (1: 1)، والماء DI، وتستنهض الهمم في حمام بالموجات فوق الصوتية لمدة 90 ق لكل نقع.
    7. تجف الشريحة على موقد لإزالة الرطوبة قبل أن ينتزع ذلك في مجفف وتخزينها في الثلاجة.
  4. التجمع رقاقة
    1. كرر الخطوات من 1.1.1-1.1.4، ولكن مع مقاومة للضوء، SU8-2025 سلبية وإعداد المعلمة المشار يسمى بروتوكول Microchem 18، لإعداد قالب السيليكون مع الضوئية الرئيسية.
    2. افتعال متناهية PDMS (40 مم × 25 مم × 5 مم، ث ل س س ح) ولوح PDMS صغير (800 هيكل الأخدود على نطاق ميكرون) باستخدام الطباعة الحجرية الناعمة.
    3. لكمة microchanneلتر بالنسبة للمنافذ وصول السوائل وتنظيفه مع الشريط وبعد ذلك مع IPA.
    4. حماية منطقة منقوشة الركيزة الزجاج مع بلاطة PDMS، وتطبيق ري (100 واط، 500 mTorr، 60 ثانية) لإزالة PLL-ز-PEG من المنطقة الحدودية.
    5. علاج متناهية مع جرعة مخفضة من ري (25 ث، 500 mTorr، 25 ق)، ثم محاذاته إلى الركيزة الزجاج المزخرفة (مع PDMS لوح صغير إزالتها)؛ جلب متناهية والركيزة الزجاج المزخرف في اتصال امتثالي تحت المجسام.

figure-protocol-2
الشكل (3): الرسوم التخطيطية للالتصنيع الدقيق ورقاقة التجمع. أ) نمط من النقاط الذهب على الركيزة الزجاج. ب) إعداد الركيزة الزجاج لتنميط الخلية عبر MAPL. ج) جمعية قناة ميكروفلويديك مع الرابطة البلازما. الرجوع إلى قائمة المواد للتعريفات سو الاختصارات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. مرفق الخلية
    يتم الاحتفاظ خلايا هيلا بشكل روتيني في DMEM تستكمل مع FBS 10٪ و 1٪ مضاد حيوي / مضاد التفتل حل في حاضنة الثقافة الخلية: ملاحظة. ويظهر رسم تخطيطي للمرفق التجميع رقاقة وخلية في الشكل 3C.
    1. رئيس رقاقة مع برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في 1 ميكرولتر / دقيقة، ثم ينقع حل فبرونيكتين (50 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني، 1 ميكرولتر / دقيقة) لمدة 45 دقيقة.
    2. في الوقت الذي تنتظر، ويعرض للتريبسين زراعة الخلايا مع 0.25٪ التربسين-EDTA، بغسلها في مستنبت، والخلايا الفردية أجهزة الطرد المركزي، وإعادة تشكيل تعليق خلية في قبل تحسنت (37 درجة مئوية) مستنبت في 5X10 6 خلايا / مل.
    3. استبدال حل فبرونيكتين مع برنامج تلفزيوني وتدفق رقاقة في 10 ميكرولتر / دقيقة لمدة 5 دقائق.
    4. حقنتعليق الخلية مستعد في رقاقة، ووقف تدفق، المشبك منفذ، والحفاظ على رقاقة في حاضنة الثقافة خلية لمدة 30 دقيقة.
    5. الافراج عن منفذ وتدفق رقاقة مع مستنبت الخلية في 10 ميكرولتر / دقيقة لمدة 5 دقائق. خفض معدل تدفق نضح من مستنبت إلى 0.75 ميكرولتر / دقيقة، والحفاظ على زراعة الخلايا لمدة 2 ساعة في الحاضنة.

2. الجيل فقاعة والتصور تدفق

ملاحظة: يتم عرض تخطيطي من الإعداد التجريبية في الشكل 4A لتوليد جنبا إلى جنب فقاعة والتفاعل تدفق الناتجة مع خلية واحدة نمت في مكان قريب في قناة ميكروفلويديك.

  1. جيل من جنبا إلى جنب مع اثنين من فقاعات الليزر والتحكم توقيت
    1. وضع رقاقة ميكروفلويديك على مرحلة مجهر مقلوب ومحاذاة بؤر اثنين نابض الثانية: ليزر YAG (λ = 532 نانومتر، 5-NS مدة النبضة) على زوج من النقاط الذهبية المزخرفة فصل بص 40 ميكرون.
    2. استخدام مولد تأخير الرقمية لتحريك الليزر اثنين مع تأخير الوقت حوالي 2.5 ميكرو ثانية لانتاج اثنين من الفقاعات التي بدأت في النقاط الذهب.
    3. ضبط انتاج الليزر الطاقة (~ 10 μJ) لإنتاج القطر الأقصى من فقاعات داخل 50 ± 2 ميكرون.
    4. مزامنة كاميرا عالية السرعة (التعرض 200 نانو ثانية و2000000 لقطة في الثانية (fps)) إلى أشعة الليزر والتقاط ديناميات التوسع فقاعة والانهيار، والتفاعل فقاعة فقاعة، وتشكيل طائرة.
  2. الكمي لسرعة الطائرة
    1. تسجيل موقف من طرف طائرة (J 1) في نهاية القريبة من فقاعة الأولى (ب 1) ونهاية البعيدة للب 1، بدءا من جيل الفقاعة الثانية (ب 2) وتنتهي مع هبوط من J 1 في نهاية البعيدة ب 1؛ انظر التخطيطي في الشكل 5A.
    2. تناسب خطيا على مدار الساعة من موقف للبوتح الداني (نصيحة طائرة) وينتهي البعيدة. حساب المنحدر من موقف طرف مقابل منحنى الوقت لنهاية القريبة لتحديد سرعة الطائرة. تقاطع هذين الخطين يشير إلى وقت هبوط الطائرة. مزيد من التفاصيل يمكن العثور عليها في المرجع 19.
  3. التصور للمجال تدفق الناجم عن فقاعة جنبا إلى جنب
    1. إعداد 1 ميكرون من البوليسترين (PS) تعليق حبة في الماء DI (2.6٪ ث / ت) وحقن الخرز في رقاقة ميكروفلويديك.
    2. توليد فقاعات جنبا إلى جنب كما هو موضح في الخطوة 2.1.1-2.1.3.
    3. تسجيل ديناميات جنبا إلى جنب فقاعة باستخدام كاميرا فيديو عالية السرعة بمعدل تأطير 5 M إطارا في الثانية مع زمن التعرض 100 نانو ثانية.
    4. تحميل تسلسل الصور المكتسبة في برنامج التعريف الشخصية التجاري.
    5. تقسيم كل صورة في النوافذ الاستجواب أصغر من 16 × 16 بكسل (بكسل) مع تداخل 75٪.
    6. تطبيق متعددة تمر التكرار والمرشحات الإقليمية للحد من الأخطاء في حساب سرعة الميدان، وإخراج النتائج في خريطة سرعة النواقل.

figure-protocol-3
الشكل 4: رسم تخطيطي من الإعداد التجريبية وتسجيل الصورة. أ) إعداد التجريبي لتوليد جنبا إلى جنب فقاعة. ب) تسلسل الوقت تستخدم لأنواع مختلفة من عمليات الاستحواذ التصوير. فلوريدا: المجهري مضان، BF: حقل مشرق، IFT: الوقت interframe. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. وحيد الخلية تحليل وBioeffects

ملاحظة: يتم إنتاج فقاعة جنبا إلى جنب المقبل إلى الخلايا المستهدفة، ودرس bioeffects الناتجة في الطريقة التي تعتمد على المسافة المواجهة. ويصور التسلسل الزمني لأنواع مختلفة من عمليات الاستحواذ الصورة في الشكل 4B.

  1. poration الغشاء وامتصاص الجزيئات
    ملاحظة: امتصاص الجزيئات خارج الخلية إلى الخلية المستهدفة تتميز نشر التدريجي من يوديد غشاء impermeant propidium (PI) من خلال الموقع poration على غشاء الخلية.
    1. الخطوة التالية 1.5، استبدال مستنبت منتظمة (أي DMEM) مع الحل PI (100 ميكروغرام / مل في DMEM) على التوالي في معدل تدفق نضح من 0.5 ميكرولتر / دقيقة في كافة مراحل التجربة.
    2. برنامج برنامج التحكم المجهر لتحديد تلقائيا المكعب الفلورسنت PI على برج الدورية وتزامن توقيت كاميرا CCD مع الإثارة PI مضان لالتقاط الصور مضان مع ومدة التعرض من 200 مللي ثانية.
    3. بعد يتم محاذاة البؤر ليزر اثنين إلى زوج من النقاط الذهبية بجانب الخلية المستهدفة، سجل كل من حقل مشرق (BF) ومضان (فلوريدا) صور قبل العلاج جنبا إلى جنب فقاعة.
    4. استخدام برنامج حاسوبي لمراقبة المجهر لمباشرةبدء الوقت الفاصل بين تسجيل صورة مضان من الخلية المستهدفة بعد وقت قصير من الخطوة 2.1 لالتقاط تاريخ PI امتصاص.
  2. غشاء تشوه
    1. إعداد حبات 1 ميكرومتر (1٪ ث / ت، تفعيلها مع carbodiimide للذوبان في الماء) وfunctionalize لهم الببتيد 2000 (100 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني).
    2. الخطوة التالية 1.5، احتضان الخلايا المرفقة مع الخرز functionalized في كثافة 1X10 9 حبات / مل عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    3. كرر الخطوة 2.1 لإنتاج فقاعات جنبا إلى جنب بجوار الخلية المستهدفة وتسجيل تشوه الخلايا مع كاميرا فائقة السرعة تعمل بمعدل تأطير 5000000 إطارا في الثانية.
    4. تحديد ثالوث 3 حبات التي تبقى على طائرة التصوير في كافة مراحل التجربة وتجميع وظائفهم، حيث (س 1، ص 1) (س 2، ص 2)، و (× 3، ص 3) الإحداثيات في التجربة.
    5. حساب مساحة ثالوث قبل وبالعربيةثالثا العلاج جنبا إلى جنب فقاعة باستخدام المعادلة التالية:
      figure-protocol-4
    6. حساب سلالة المنطقة على النحو التالي:
      figure-protocol-5
    7. وبناء على إحداثيات رؤوسه الثلاثة قبل وبعد العلاج فقاعة جنبا إلى جنب، وحساب المحلي الرئيسي سلالة ومنطقة سلالة التالية البروتوكولات المعمول 20،21.
  3. سلامة وموت الخلايا المبرمج
    ملاحظة: FITC Annexin V التسميات الخلايا، بما في ذلك تلك التي أفكارك، من خلال تخريج فسفاتيديل (مخضر). PI تسميات نوى الخلايا الميتة (مضان أحمر). يستخدم التصوير مشرق الميدان لتوثيق مورفولوجيا الخلايا وللمساعدة في تحديد بقاء الخلية وموت الخلايا المبرمج.
    1. تسجيل موقف كل خلية المعالجة في قناة ميكروفلويديك (بتسهيل من تسميات عنوان في القناة، انظر الشكل 2B
    2. احتضان الخلايا المعالجة في مستنبت الخلايا لمدة 2 ساعة أخرى قبل perfusing رقاقة مع الحل FITC Annexin V لمدة 15 دقيقة. خلايا الإيجابية عرض مخضر.
    3. كرر الخطوة 3.3.2 24 ساعة بعد العلاج جنبا إلى جنب فقاعة لدراسة bioeffects على المدى الطويل في الخلايا المستهدفة.
  4. استجابة الكالسيوم
    1. مزيج 3 ميكرولتر من FURA-02:00 المحلول (1 ملغ / مل في DMSO) مع 3 ميكرولتر من 10٪ ث / ت Pluronic F-127 في 500 ميليلتر من انخفاض سيرم لإعداد حل وضع العلامات النهائية (6 ميكرومتر).
    2. الخطوة التالية 1.5، استبدال خلية ثقافة المتوسط ​​مع الحل وضع العلامات واحتضان تحت درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 40 دقيقة (1 ميكرولتر / دقيقة معدل نضح).
    3. إعادة ملء القناة مع سيرم انخفاض (0.75 ميكرولتر / دقيقة معدل نضح) قبل بدء التجربة الخلية.
    4. بدء التصوير ratiometric (الطول الموجي: 340/380 نانومتر، والتعرض 50 مللي ثانية)الخلية الهدف باستخدام نظام الوكالة التجارية.
    5. بعد 10 ثانية من التصوير ratiometric من الخلية عند مستوى الراحة، تنتج فقاعات جنبا إلى جنب كما في الخطوة 2.1. السجل الاول مع الوقت interframe (IFT) من 0.1 الصورة لمدة 1 دقيقة، ثم زيادة IFT إلى 1 الصورة لدقيقة أخرى، وزيادة أخرى إلى 5 ثوان بعد 2 دقيقة.
    6. استخدام برنامج الوكالة لحساب نسبة R = F340 / F380 في المنطقة ذات الاهتمام (ROI)، الذي يتناسب مع تركيز الكالسيوم داخل الخلايا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

منصة ميكروفلويديك الموصوفة في هذا العمل يمكن أن تستخدم لتحقيق التفاعل فقاعة فقاعة وتحليل مجموعة متنوعة من bioeffects الناجم عن التجويف على مستوى خلية واحدة. هنا، نقدم العديد من الأمثلة للتدليل مجموعة متنوعة من دراسات واختبارات بيولوجية التجريبية التي يمكن القيام بها في نظام تجريبي لدينا. سوف نوضح أولا تفاعلات عابرة من فقاعات جنبا إلى جنب مع تشكيل طائرة، التصور للمجال تدفق الناتجة، وحساب سرعة طائرة (الشكل 5A). وسوف أمثلة ذلك الحين ا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحليل وحيدة الخلية، بالاشتراك مع التصوير الخلية الحية، وتتعزز بشكل كبير من فهمنا للعمليات ديناميكية ومتغيرة في كثير من الأحيان في الخلايا الفردية، مثل تطوير النمط الظاهري والاستجابة المناعية 23. وعلى النقيض من زراعة الخلايا التقليدية في أطباق أو قوارير، تمكن أنظمة الموائع الدقيقة مراقبة دقيقة من المكروية، وصولا الى مستوى خلية واحدة، في الوقت الحقيقي. ونتيجة لذلك، فإن التقدم في تكنولوجيا الموائع الدقيقة والتقنيات قد تحسنت إلى حد كبير سرعة نقل واستنساخ تحليل وحيدة الخلية....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نعرب عن تقديرنا لاستخدام مرفق الغرفة النظيفة SMIF في جامعة ديوك. نود أيضا أن نشكر Hao Qiang على مساعدته في قياس سرعة النفاثة. يشكر المؤلفون تود رومبو من Hadland Imaging على توفير كاميرا Shimadzu HPV-X المستخدمة في هذه الدراسة. تم تمويل العمل جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة من خلال المنح 5R03EB017886-02 و 4R37DK052985-20.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<قوي >كاشف / مواد< / قوي>75
مم × 38 مم شرائح مجهر عاديكورنينج2947-75X38
أسيتونسيجما ألدريتش ، كو.320110كاشف ACS, & 99.5٪
كحول الأيزوبروبيلسيجما ألدريتش ، شركة.W292907 99.7٪ ، لجنة الاتصالات الفيدرالية ، FG
حمض الكبريتيكسيجما ألدريتش ، شركة.كاشف ACS 320501، 95.0-98.0٪
بيروكسيد الهيدروجينSigma Aldrich، Co.21676330 بالوزن في H2< / sub>O
Primer P-20MicrochemMCC Primer 80/20
NFR مقاوم للضوءJSRNFR016D2
قناع ضوئيPhotoplotstoreN / A4x4 قناع الكتابة المباشر
MF-319 المطورShipley (Rohm and Haas)Microposit MF-319
1165 مزيل الضوءDow Chemical ، Co. DEM-100180731-methyl-2-pyrrolidinone
القائم على S1813 مقاوم للضوءShipley (Rohm and Haas)S1813
PLL-g-PEGSuSoSPLL (20) -g [3.5] - PEG (2)
HEPESThermoFisher Scientific15630080
فيلم البارافينHACH251764
SU-2025 مقاوم للضوءMicrochemSU-2025
PDMSداو كورنينج184 سيل ELAST كيت 0.5 كجم
أنابيب صغيرةسانت جوبين بي بي إل كورب.S-54-HL
دبابيس معدنية نيوإنجلاند أنبوب صغيرNE-1300-01أنبوب مقطوع (مستقيم) ، 0.025 " OD × 0.017 بوصة معرف × 0.50 بوصة
منشأة ثقافة خلايا ديوك لخلاياهيلا الطويلة (307-CCL-2) هيلا ، ص 148
DPBS (1x) عازلةThermoFisher Scientific14190144
ثقافة DMEM وسطThermoFisher Scientific11995065
بروتين بقري فيبرونيكتين ، بلازماThermoFisher Scientific33010018
0.25٪ Trypsin-EDTA (1x)ThermoFisher 25200056
بروبيديوم يوديدThermoFisher ScientificP21493
كربوكسيل ميكروفير 1.00   ؛ مو مPolysciences, Inc08226-15
الكريات المجهرية الكربوكسيلات 2.00  مو مPolysciences، Inc18327-10
EDC (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride) ThermoFisherScientific22980
Sulfo-NHSSulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)24510
Peptite-2000Advanced BioMatrix5020-5MG
FITC Annexin VThermoFisher ScientificA13199
Fura-2 ، AMThermoFisher ScientificF1221
DMSOSigma Aldrich، Co.D2650
F-127invitrogenP68660.2 & micro; م مفلتر (محلول 10٪ في الماء)
وسائط المصل  ThermoFisher Scientific11058021
<قوي>الاسم<قوي>الشركة رقم الكتالوجتعليقات
Equipment
Plasma asherEmitechK-1050XO2 / Ar رماد البلازما من مقاوم للضوء والمواد العضوية
الأخرى قناع التقويمSUSS MicroTec  Karl Suss MA6 / BA6
E-beam المبخرCHA IndustriesCHA Industries Solution E-Beam
RIETrion Technology Trion Technology Phantom II(أكسيد / نيتريد / بوليمر) نقش
مجسمAmScopeأمريكان سكوپ SM-4TZ-FRLمجهر ستيريو
مضخة حقنةChemyx Incحاضنة
NuAireAutoFlow NU-8500 سترة مائية CO2 < / sub> حاضنة
خزانات السلامة البيولوجيةNuAireNU-425-400
حمام مائيVWR1122s
جهاز طرد مركزيIECCentra CL2
مجهرZeissAxio Observer Z1
Nd: YAG laser  (ليزر 1)الموجة الجديدة للأبحاثعاصفة
Nd: YAG ليزر  (ليزر 2)الموجة الجديدة لأبحاثالجبار
Berkeley Nucleonics BNC 565-8c
مصباح فلاشDyna-LiteML1000 الألياف المقترنة فلاش
كاميرا عالية السرعةDRS Hadland  كاميرا ايماكون 200
عالية السرعةكاميرا شيمادزوHPV-X
عاليةVision ResearchPhantom V7.3
PIVLaVisionDaVis 7.2
CameraZeissAxioCam MRc 5
CamerasZeissAxioVision
PTI systemHoribaS / N: 1705 RAM-X
برنامج EasyRatioHoribaEasy Ratio Pro2 الإصدار 2.3.125.86
63 & مرة الهدفZeiss LD Plan Neofluar
العلميانخفاض ثقافة الخلايا NanoJet مولد تأخير كاميرا السرعة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, D., Bodovitz, S. Single cell analysis: the new frontier in 'omics. Trends Biotechnol. 28 (6), 281-290 (2010).
  2. Weaver, W. M., et al. Advances in high-throughput single-cell microtechnologies. Curr Opin Biotechnol. 25, 114-123 (2014).
  3. Gossett, D. R., et al. Hydrodynamic stretching of single cells for large population mechanical phenotyping. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (20), 7630-7635 (2012).
  4. Spiller, D. G., Wood, C. D., Rand, D. A., White, M. R. H. Measurement of single-cell dynamics. Nature. 465 (7299), 736-745 (2010).
  5. Lecault, V., White, A. K., Singhal, A., Hansen, C. L. Microfluidic single cell analysis: from promise to practice. Curr Opin Chem Biol. 16 (3-4), 381-390 (2012).
  6. Kennedy, J. E. High-intensity focused ultrasound in the treatment of solid tumours. Nat Rev Cancer. 5 (4), 321-327 (2005).
  7. Zhu, S., Cocks, F. H., Preminger, G. M., Zhong, P. The role of stress waves and cavitation in stone comminution in shock wave lithotripsy. Ultrasound Med Biol. 28 (5), 661-671 (2002).
  8. Fan, Z., Liu, H., Mayer, M., Deng, C. X. Spatiotemporally controlled single cell sonoporation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (41), 16486-16491 (2012).
  9. Itah, Z., et al. Hydrodynamic cavitation kills prostate cells and ablates benign prostatic hyperplasia tissue. Exp Biol Med. 238 (11), 1242-1250 (2013).
  10. Kosar, A., Sesen, M., Oral, O., Itah, Z., Gozuacik, D. Bubbly cavitating flow generation and investigation of its erosional nature for biomedical applications. IEEE Trans Biomed Eng. 58 (5), 1337-1346 (2011).
  11. Li, Z. G., Liu, A. Q., Klaseboer, E., Zhang, J. B., Ohl, C. D. Single cell membrane poration by bubble-induced microjets in a microfluidic chip. Lab Chip. 13 (6), 1144-1150 (2013).
  12. Li, F. F., Chan, C. U., Ohl, C. D. Yield Strength of Human Erythrocyte Membranes to Impulsive Stretching. Biophys J. 105 (4), 872-879 (2013).
  13. Li, F., M, M., Ohl, C. .D. . Shear stress induced stretching of red blood cells by oscillating bubbles within a narrow gap. Bull Am Phys Soc. 58, (2013).
  14. Sankin, G. N., Yuan, F., Zhong, P. Pulsating tandem microbubble for localized and directional single-cell membrane poration. Phys. Rev. Lett. 105 (7), 078101(2010).
  15. Fan, Q., Hu, W., Ohta, A. T. Laser-induced microbubble poration of localized single cells. Lab Chip. 14 (9), 1572-1578 (2014).
  16. Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
  17. Yuan, F., Sankin, G., Zhong, P. Dynamics of tandem bubble interaction in a microfluidic channel. J Acoust Soc Am. 130 (5), 3339-3346 (2011).
  18. Microchem, SU-8 2000 Processing Guidelines. , Available from: http://www.microchem.com/pdf/SU-82000DataSheet2000_5thru2015Ver4.pdf (2000).
  19. Yang, C. Analysis of Tandem Bubble Interaction and Jet Formation in a Microfluidic Channel. , Duke University. (2013).
  20. Simon, S. I., Schmid-Schonbein, G. W. Cytoplasmic strains and strain rates in motile polymorphonuclear leukocytes. Biophys J. 58 (2), 319-332 (1990).
  21. Barbee, K. A., Macarak, E. J., Thibault, L. E. Strain measurements in cultured vascular smooth muscle cells subjected to mechanical deformation. Ann Biomed Eng. 22 (1), 14-22 (1994).
  22. Yuan, F., Yang, C., Zhong, P. Cell membrane deformation and bioeffects produced by tandem bubble-induced jetting flow. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (51), E7039-E7047 (2015).
  23. Yin, H., Marshall, D. Microfluidics for single cell analysis. Curr Opin Biotechnol. 23 (1), 110-119 (2012).
  24. Tay, S., et al. Single-cell NF-kappa B dynamics reveal digital activation and analogue information processing. Nature. 466 (7303), 267-271 (2010).
  25. Rand, R. P., Burton, A. C. Mechanical Properties of the Red Cell Membrane: I. Membrane Stiffness and Intracellular Pressure. Biophys J. 4 (2), 115-135 (1964).
  26. Lim, C. T., Dao, M., Suresh, S., Sow, C. H., Chew, K. T. Large deformation of living cells using laser traps. Acta Mater. 52 (7), 1837-1845 (2004).
  27. Puig-de-Morales-Marinkovic, M., Turner, K. T., Butler, J. P., Fredberg, J. J., Suresh, S. Viscoelasticity of the human red blood cell. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (2), C597-C605 (2007).
  28. Kudo, N., Okada, K., Yamamoto, K. Sonoporation by single-shot pulsed ultrasound with microbubbles adjacent to cells. Biophys J. 96 (12), 4866-4876 (2009).
  29. van Wamel, A., et al. Vibrating microbubbles poking individual cells: Drug transfer into cells via sonoporation. J Control Release. 112 (2), 149-155 (2006).
  30. Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. Membrane perforation and recovery dynamics in microbubble-mediated sonoporation. Ultrasound Med Biol. 39 (12), 2393-2405 (2013).
  31. Dijkink, R., et al. Controlled cavitation-cell interaction: trans-membrane transport and viability studies. Phys Med Biol. 53 (2), 375-390 (2008).
  32. Rau, K. R., Quinto-Su, P. A., Hellman, A. N., Venugopalan, V. Pulsed laser microbeam-induced cell lysis: Time-resolved imaging and analysis of hydrodynamic effects. Biophys J. 91 (1), 317-329 (2006).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microfluidic SystemSurface PatterningCavitation BubbleTandem BubblesSingle Cell AnalysisHigh Speed ImagingParticle Image VelocimetryCell Membrane PorationIntracellular Calcium ResponseGold Dot Patterning

Related Articles