مقالة منهجية

الإنتاج والإدارة العلاجية الجذعية الوسيطة / اللحمية الخليوي (MSC) الأجسام الشبه الكروية معبى في الثقافات 3-D تحت ظروف كره خالية

11.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/55126

⸱

مارس 18, 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Mary Hardin-Baylor, 2Department of Pediatrics, University of Texas Medical Branch, 3Multi-Organ Support Technology Task Area, U.S. Army Institute of Surgical Research, 4Internal Medicine, Texas A&M University Health Science Center

في هذه المقالة

ملخص

إن الإمكانات العلاجية للخلايا الجذعية / اللحمية المتوسطة (MSCs) موثقة جيدا ، ولكن أفضل طريقة لإعداد الخلايا للمرضى لا تزال مثيرة للجدل. هنا ، نقوم بتوصيل بروتوكولات لتوليد وإدارة المجاميع الكروية العلاجية أو "الكرويات" من الخلايا الجذعية الجذعية المعدة في ظل ظروف خالية من xeno للتطبيقات التجريبية والسريرية.

الملخص

الجذعية الوسيطة / الخلايا اللحمية (اللجان الدائمة) على وعود كبيرة في الهندسة الحيوية والطب التجديدي. اللجان الدائمة يمكن عزلها عن أنسجة البالغين متعددة عبر الالتزام القوي للالبلاستيك زراعة الأنسجة ومن ثم مزيد من التوسع في المختبر، والأكثر شيوعا باستخدام مصل بقري جنيني (FBS). منذ FBS يمكن أن يسبب اللجان الدائمة لتصبح مناعة، وجودها في الثقافات MSC يحد كلا التطبيقات السريرية والتجريبية من الخلايا. لذلك، دراسات توظيف تعريف كيميائيا (XF) وسائل الاعلام خالية من XENO للثقافات MSC قيمة للغاية. وقد أرجع العديد من الآثار المفيدة للاللجان الدائمة لقدرتها على تنظيم الالتهاب والمناعة، وذلك أساسا من خلال إفراز العوامل المناعية مثل نخر الورم حفز عامل الجينات 6 (TSG6) والبروستاغلاندين E2 (PGE2). ومع ذلك، اللجان الدائمة تتطلب تفعيل لإنتاج هذه العوامل ومنذ أثر من اللجان الدائمة في كثير من الأحيان عابرة، برز اهتمام كبير لاكتشاف طرق من قبل تنشيط خلايا PRIOr لاستخدامها، وبالتالي القضاء على الوقت الضائع لالتنشيط في الجسم الحي. هنا نقدم بروتوكولات لتفعيل كفاءة أو اللجان الدائمة الرئيسية في ثلاثي الأبعاد (3D) الثقافات في ظل ظروف XF محددة كيميائيا وإدارة هذه اللجان الدائمة تفعيلها مسبقا في الجسم الحي. على وجه التحديد، وصفنا أولا طرق لتوليد MSC كروية الأنسجة الصغيرة أو "الكروية" في شنقا قطرات باستخدام XF المتوسطة وشرح كيفية المجالات والمتوسطة مكيفة (CM) يمكن حصاده لمختلف التطبيقات. ثانيا، نحن تصف شاشات التعبير الجيني في المختبر المقايسات الفنية لتقييم بسرعة على مستوى تفعيل لجنة السلامة البحرية في الكروية، مع التركيز على إمكانات المضادة للالتهابات ومضاد للسرطان من خلايا. ثالثا، نحن تصف طريقة رواية لحقن الكروية MSC سليمة في التجويف البريتوني الماوس في الجسم الحي اختبار فعالية. وعموما، فإن البروتوكولات التغلب على هذه الوثيقة التحديات الكبرى للحصول على اللجان الدائمة تفعيلها مسبقا تحت تعريف كيميائيا يخدع XFditions وتوفر نظاما مرنا لإدارة الكروية MSC للعلاج.

المقدمة

وقد أظهرت الجذعية الوسيطة / خلايا انسجة (اللجان الدائمة) إمكانات كبيرة لمختلف النهج الطب التجديدي. تم عزل اللجان الدائمة في البداية باعتبارها عنصرا انسجة نخاع العظام ولكن تم الحصول عليها منذ من العديد من أنسجة البالغين الأخرى، بما في ذلك الأنسجة الدهنية 1، 2، 3. ومن المثير للاهتمام، تحتضن طريقة العزلة الرئيسي خاصية رائعة من اللجان الدائمة التمسك بإحكام على البلاستيك زراعة الأنسجة في وجود مصل بقري جنيني (FBS). بينما تسمح هذه التقنية العزلة التقليدية التوسع السهل والسريع من اللجان الدائمة في ثنائية الأبعاد (2D) ثقافة، بل هو أيضا الاصطناعي للغاية ويتجاهل أهمية البيئة المحلية ثلاثي الأبعاد (3D) مما أدى إلى خسارة محتملة من الخصائص الخلوية مهمة 4، 5 (6). ولذلك، فإن دراسة اللجان الدائمة في الثقافات 3D، التيأكثر الفسيولوجية من الثقافات 2D التقليدية، ظهرت في البحث عن خصائص MSC "فقدت / تقلص". وعلاوة على ذلك، ارتفع اهتماما كبيرا لتحديد الشروط (XF) خالية من XENO محددة كيميائيا للثقافة MSC والتنشيط، وبالتالي تجعل الخلايا أكثر تقبلا للتطبيقات السريرية.

وقد نشرت العديد من الدراسات يدل على ثقافة 3D من اللجان الدائمة في كل من المواد الحيوية وكما الركام كروية أو الكروية. وقد صممت اللجان الدائمة في المواد الحيوية في البداية لنهج هندسة الأنسجة لاستبدال الأنسجة التالفة مع السقالات خلية المصنفة، في حين شوهدت الثقافات كروي من اللجان الدائمة وسيلة لفهم السلوك MSC في الجسم الحي بعد تناوله من الخلايا للعلاج في التجارب ما قبل السريرية أو الإكلينيكية 4 و 5 و 7. ومن المثير للاهتمام، اللجان الدائمة شكل الكروية بشكل عفوي عندما التمسك البلاستيك زراعة الأنسجة غير مسموح8، 9، 10. تقليديا، تم تسهيل تجميع الخلية عن طريق أساليب قارورة الدوار أو تقنيات تراكب السائلة وطرق استخدامها في البداية في بيولوجيا السرطان في جهود محاولة لتقليد المكروية الورم. وفي الآونة الأخيرة، ظهرت طرق إضافية التي تثبت تجميع الخلايا في أطباق ثقافة ما قبل المغلفة بمواد كيميائية محددة لمنع الخلية الى البلاستيك التصاق 4، 5، 6. واحد من أبسط وأكثر اقتصادا وسائل لتوليد الأجسام الشبه الكروية MSC هو ثقافة لهم في شنقا قطرات، وهي تقنية تستخدم غالبا للإنتاج الهيئات مضغي من الخلايا الجذعية الجنينية. مع شنقا تقنية ثقافة الإفلات، يتم منع التقيد الخلية إلى البلاستيك زراعة الأنسجة من خلال تعليق الخلايا في قطرة من المتوسط ​​على الجانب السفلي من غطاء الأنسجة صحن الثقافة والسماح خطورة لتسهيل aggreg خليةأوجه في قمة الهبوط. حجم كروي يمكن التلاعب بها بسهولة عن طريق تغيير تركيز الخلية أو حجم الانخفاض، مما يجعل انخفاض الثقافات شنقا سهلة جدا السيطرة.

أظهرت الدراسات المبكرة على الثقافة 3D من اللجان الدائمة اختلافات جذرية في خصائص الخلايا في 3D مقارنة مع نظرائهم 2D 6، 8، 9. وفي الوقت نفسه، أظهرت التقارير أن التأثيرات المفيدة للاللجان الدائمة في الجسم الحي تعتمد على قدرتها على أن تصبح تفعيلها من خلال الاشارات الصغيرة البيئية، وردا على ذلك، لإنتاج المضادة للالتهابات والمناعية عوامل 11. ومن المثير للاهتمام، تم إنتاج العديد من هذه العوامل مثل البروستاغلاندين E2 (PGE2)، نخر الورم حفز عامل الجينات 6 (TSG6)، وعامل النمو الكبدية (HGF) بكميات أكبر بكثير من الكروية MSC من اللجان الدائمة 2D التقليدية مما يمهد الطريق ل فكرة عناستخدام الثقافات 3D لتنشيط الخلايا 8 و 12 و 13. وعلاوة على ذلك، يبدو تفعيل الجين في الثقافات 3D لألخص الآليات، على الأقل جزئيا، من تنشيط الخلايا بعد حقن الفئران إلى 12. من خلال تفعيل اللجان الدائمة السابقة لاستخدامها في التجارب، والآثار المترتبة على خلايا يمكن أن تكون طويلة وأكثر بروزا في كثير من الأحيان يتم تأخير تأثير MSC التقليدي في الجسم الحي وعابرة، ويمكن وصفها بأنها "الكر والفر". خلال السنوات العديدة الماضية، وقد أثبتت الدراسات وظيفية هامة باستخدام الكروية MSC يتمكنوا من قمع الاستجابات الالتهابية وتعدل مناعة في الجسم الحي من خلال التأثير على الخلايا المستجيب مثل الضامة، والخلايا الجذعية، العدلات، والخلايا T جعل الكروية وشكل جذاب من اللجان الدائمة تستعد 2 3. وبالإضافة إلى ذلك، إنتاج جزيئات مضادة للسرطان، مثل كثافة العملياتerleukin 24 (IL-24)، ونخر الورم المتعلقة عامل يحفز الخلايا يجند (تريل)، وزاد في الثقافات 3D من اللجان الدائمة بالنسبة للأحادي الطبقة اللجان الدائمة، وهي الظاهرة التي يمكن استغلالها لعلاجات السرطان تستهدف 8 و 10 و 14.

وبما أن الثقافة لجنة السلامة البحرية التقليدية تتطلب ليس فقط استخدام البلاستيك زراعة الأنسجة ولكن أيضا FBS، عقبة أخرى لجعل الكروية MSC أكثر قابلية للاستخدام السريري كان لا بد من التغلب عليها. لمعالجة هذه العقبة، وأظهرت مؤخرا تشكيل الكروية MSC في ظل ظروف محددة XF محددة كيميائيا وأثبت أن الكروية MSC مما أدى تم تفعيلها لإنتاج نفس الجزيئات المضادة للالتهابات ومضادة للسرطان حيث الكروية ولدت في ظروف مع FBS 14. هنا، يتم عرض هذه النتائج في عدة بروتوكولات وإجراءات تفصيلية التي تبرهن على جيل من اللجان الدائمة تفعيلها مسبقا في الثقافات 3D باستخدام XFوسائل الإعلام. وبالإضافة إلى ذلك، يتم عرض البروتوكولات التي تصف طرق فعالة لتقييم مستويات تفعيل اللجان الدائمة في ما يخص المضادة للالتهابات، المناعية والمضادة للسرطان آثارها، جنبا إلى جنب مع وسيلة عملية لتقديم الكروية سليمة في الفئران.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. عزل MSC والتوسع

  1. الحصول على اللجان الدائمة مرور وقت مبكر من مركز إعداد وتوزيع الخلايا الجذعية البالغة ( http://medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html ) 15 قارورة كما المجمدة. بدلا من ذلك، عزل اللجان الدائمة من aspirates نخاع العظم بعد بروتوكول روتيني 14 وتخزين قوارير كما المجمدة.
  2. إعداد مستنبت الكامل (CCM)، وهو الحد الأدنى ألفا المتوسط ​​الأساسية (αMEM) تستكمل مع 15-20٪ قسط تحديد FBS، 2 مم L-الجلوتامين، و1X البنسلين ستربتومايسين. تعقيم المتوسطة عن طريق الترشيح.
  3. ضع 30 مل من CCM في طبق خلية ثقافة 150 ملم واحتضان الطبق لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب يحتوي على 5٪ CO 2.
  4. احتضان القارورة المجمدة تحتوي على ما يقرب من 10 6 اللجان الدائمة لمدة 2 دقيقة في 37 ° C حمام الماء.
  5. نقل محتويات القارورة إلى الطبق الثقافة باستخدام الماصة 5 مل المصلية ويغسل عدة مرات قنينة مع 1-2 مل CCM من طبق لالتقاط الخلايا المتبقية. ضع بين عشية وضحاها الطبق في حاضنة مناسبة.
  6. تغسل بعناية الثقافة مرتين مع درجة حرارة الغرفة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وفصل اللجان الدائمة مع 3 مل من / ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA) حل 0.25٪ التربسين قبل تحسنت. مفرزة عادة ما يستغرق حوالي 3-4 دقيقة في الحاضنة.
  7. تحييد التربسين في صحن مع 6 مل CCM قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية، ونقل تعليق الخلية في أنبوب مخروطي 50 مل. تتحد مع يغسل من برنامج تلفزيوني لتعظيم العائد الخلية.
  8. الطرد المركزي الخلايا (450 x ج) لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ونضح طاف.
  9. إعادة تعليق الخلايا في كمية صغيرة من CCM وعد خلايا قابلة للحياة باستخدام عدادة الكريات والأزرق التريبان.
  10. البذور عدد مناسب من الأطباق 150 ملم في 100 خلية / سم 2 في 30 مل من CCM الدافئ واحتضان الثقافات حتى ما يقرب من 70-80٪ متموجة، عادة 7 أيام مع متوسط ​​يتغير كل 2-3 أيام وقبل 24-48 ساعة لحصاد.
  11. حصاد الخلايا على النحو الوارد أعلاه مع التربسين / EDTA والجمع بين جميع خلايا في أنبوب مخروطي الشكل واحد مع وسيلة مناسبة. الطرد المركزي مرة أخرى وإعادة تعليق الخلايا في كمية صغيرة من نفس المتوسطة لعدد الخلايا. استخدام CCM القياسية (التي تحتوي على FBS) أو المختلفة المتاحة تجاريا XF التركيبات وسائل الإعلام، ويشار هنا إلى أنه XF المتوسطة 1 (XFM-1) وXF المتوسطة 2 (XFM-2)، مع وبدون ألبومين المصل البشري (HSA، 13 ملغ / مل) مكملات.

2. إعداد المنشط MSC الأجسام الشبه الكروية في 3-D شنقا الثقافات قطرة تحت ظروف XF

  1. لتوليد الأجسام الشبه الكروية من حوالي 25،000 الخلايا، يخفف من اللجان الدائمة التي تحصد في CCM، XFM-1، XFM-1 + HSA (13 ملغ / مل)، XFM-2، أو XFM-2 + HSA (13 ملغ / مل) في 714 الخلايا / ميكرولتر.
  2. ماصة 35 ميكرولتر / قطرات من الخلايا علىالجانب السفلي من 150 ملم ثقافة المقلوب طبق غطاء. قطرات متعددة يمكن pipetted بسهولة باستخدام ماصة الأقنية.
    ملاحظة: إذا رغبت الكروية أكبر أو أصغر، تغيير تركيز الخلية أو حجم الانخفاض (25-45 ميكرولتر) بشكل مناسب.
  3. نقل 20 مل من درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني في قاعدة الطبق وفي حركة مستمرة وثابتة واحدة الوجه الغطاء، الذي يحتوي على قطرات، حتى أن قمم انخفاض تواجه الهبوط. وضع غطاء بعناية على قاعدة الطبق الثقافة.
  4. نقل الطبق في الحاضنة لمدة 3 أيام من دون إزعاج ذلك للسماح التجمع المجال المناسب.
  5. بعد 72 ساعة، يبدأ الحصاد كروي عن طريق إزالة الغطاء بعناية وعكس ذلك بحيث قطرات، مرة أخرى، تواجه التصاعدي.
  6. زاوية الغطاء لحوالي 10-20 درجة، ودفع قطرات، التي تحتوي على الكروية، إلى حافة صفيحة باستخدام رافع الخلية.
  7. نقل المجالات والمتوسطة في أنبوب مخروطي 15 مل مع أنبوب 1000 ميكرولترتتي. استخدام درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني وماصة مع نفس الطرف لغسل لوحة وضمان استرداد الحد الأقصى من الكروية.
  8. في الوقت الحقيقي المقايسات PCR (بروتوكول 3)، الطرد المركزي تعليق المجال في 450 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ونضح طاف. غسل الكروية مع برنامج تلفزيوني وكرر كل من الطرد المركزي والطموح الخطوات. للتسليم في الحيوانات (بروتوكول 8)، والسماح المجالات ليستقر في قاع الأنبوب (~ 3-4 دقيقة) دون الطرد المركزي.

3. في الوقت الحقيقي PCR من علامات المضادة للالتهابات ومضاد للسرطان

  1. استخدام عدة استخراج الحمض النووي الريبي مع الأعمدة الخالط ومجموعة الدناز ريبونوكلياز خالية لعزل الحمض النووي الريبي خالية من الحمض النووي الكلي من اللجان الدائمة أحادي الطبقة (بروتوكول 1) والكروية MSC (بروتوكول 2) التي تم غسلها مع برنامج تلفزيوني وطرد.
  2. ليز لا يقل عن 100،000 اللجان الدائمة أحادي الطبقة و 20 الكروية من كل شرط في منفصلة أنابيب مخروطية 15 مل مع العازلة RLT تحتوي على β-المركابتويثانول (1: 100).
  3. عبرفر ولست] مختلطة تماما في أنابيب 1.5 مل ريبونوكلياز حرة ووضع في الثلاجة (-80 درجة مئوية) لمدة لا تقل عن 3 ساعة للمساعدة في تحلل كروي.
  4. ذوبان الجليد في الخلية لست] على الجليد، دوامة لفترة وجيزة، واتبع تعليمات الشركة المصنعة لعزل الحمض النووي الريبي باستخدام المتاحة تجاريا الثدييات مجموع عدة RNA العزلة.
  5. قياس وتقييم جودة من الحمض النووي الريبي معزولة باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
  6. استخدام عالية السعة كدنا] النسخ العكسي كيت أو ما يعادلها وفقا لتعليمات الشركة الصانعة لتوليد كدنا] في الوقت الحقيقي PCR.
  7. وضع عينات كدنا]، تصميم تجاريا في الوقت الحقيقي الاشعال PCR / المسابير (فحوصات الجينات)، وPCR ميكس ماستر على الجليد. استخدام بادئات / تحقيقات لGAPDH (السيطرة)، PTGS2 (COX-2، المضادة للالتهابات)، TNFAIP6 (TSG6، المضادة للالتهابات)، TRAIL (المضادة للسرطان)، و IL-24 (المضادة للسرطان).
  8. إعداد الوقت الحقيقي تفاعلات PCR وفقا لتعليمات الشركة الصانعة للفحوصات الجينات وUnive السريعrsal ميكس ماستر.
  9. اتبع الإرشادات لفي الوقت الحقيقي PCR أداة لتوليد الوثائق تجربة وأداء التشغيل.
  10. تحليل البيانات باستخدام طريقة ΔΔC T عن طريق حساب التغيرات النسبية (كمية النسبية، RQ) في التعبير الجيني باستخدام GAPDH، والتحكم وأحادي الطبقة من اللجان الدائمة المحلية كأساس 8 و 14.

4. جمع CM لفحوصات من المناعية ومكافحة السرطان المحتملة

  1. حصاد الكروية وسم كما هو موضح أعلاه في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل، وذلك باستخدام رافع الخلية وماصة، ومع ذلك، لا يغسل الأغطية الطبق مع برنامج تلفزيوني حيث سيؤدي ذلك إلى إضعاف سم.
  2. أجهزة الطرد المركزي في 450 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وجمع بعناية طاف خالية من الخلايا مع ماصة، ونقل طاف في أنابيب 1.5 مل.
  3. أجهزة الطرد المركزي في 10000 x ج لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وجمع بعناية البنودCM arified مع ماصة، ونقل سم في الجديدة 1.5 مل أنابيب لتخزين في الثلاجة (-80 درجة مئوية). إعداد aliquots من مجلس الوزراء قبل التجميد عند استخدامه لفحوصات متعددة.
    ملاحظة: قبل إجراء المقايسات المصب، PGE2 تركيز، وهو مؤشر جيد للإمكانات المضادة للالتهابات من سم، ويمكن تحديد باستخدام طقم ELISA التجارية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تركيز TSG6 يمكن تحديد باستخدام بروتوكول نشر 14.

5. بلعم الفحص لتقييم إمكانات المضادة للالتهابات من MSC-CM

  1. إعداد المتوسطة بلعم، والذي يتألف من المتوسطة Dulbecco لتعديل النسر (DMEM) التي تحتوي على L-ألانيل-L-الجلوتامين وتستكمل مع 10٪ قسط تحديد FBS و1X البنسلين ستربتومايسين. تصفية تعقيم المتوسطة.
  2. الحصول على قارورة المجمدة الضامة الماوس ما يقرب من 10 6 J774 واحتضان القارورة لمدة 2 دقيقة في 37 ° C حمام الماء.
    3. نقل محتويات القارورة في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل، إضافة 9 مل من المتوسط ​​بلعم، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق على 200-300 x ج وفي درجة حرارة الغرفة.
  3. نضح طاف، تعليق الضامة في 1 مل من المتوسط ​​بلعم، ونقل الضامة إلى 150 مم طبق بتري تحتوي على 30 مل من المتوسط ​​بلعم.
  4. تغيير المتوسطة كل أيام 2 و احتضان الخلايا في الحاضنة حتى ما يقرب من 70-80٪ متموجة.
    ملاحظة: الضامة لا تلتزم بإحكام على طبق بتري، وبالتالي ينبغي الحرص على عدم فقدان الخلايا مع تغيير المتوسطة.
  5. حصاد الضامة عن طريق الرش المتوسط ​​بلعم على الخلايا مع ماصة. نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 50 مل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق على 200-300 x ج ودرجة حرارة الغرفة.
  6. نضح طاف وتعليق الخلايا في كمية صغيرة من متوسطة بلعم لعدد الخلايا مع عدادة الكريات. ضبط تركيز إلى 200000 خلية / مل مع البلاعم ليdium.
  7. لبدء انشاء لفحص بلعم، إضافة 480 ميكرولتر من المتوسطة بلعم في آبار من لوحة ال 12 أيضا.
  8. إضافة 20 ميكرولتر من المتوسطة بلعم في الآبار غير حفز تحكم و 20 ميكرولتر من غير مكيفة أو مكيفة MSC-المتوسطة، أعدت أعلاه، في الآبار التجريبية. خلط المتوسطة في الآبار عن طريق النقر على لوحة.
  9. نقل 500 ميكرولتر من تعليق خلية بلعم إلى الآبار غير حفز السيطرة البلاعم.
  10. تحفيز الضامة المتبقية مع إضافة 1: 500-1: 1000 من 0.1 ملغ / مل lipopolysaccharide في (LPS) واحتضان 5-10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  11. نقل 500 ميكرولتر من الضامة حفز في الآبار مع المتوسطة غير مكيفة أو مكيفة لجنة السلامة البحرية. مزيج من الآبار التي تعصف بشكل مطرد لوحة عدة مرات.
  12. نقل لوحة لحاضنة لل16-18 ساعة.
  13. حصاد المتوسطة مكيفة البلاعم وأجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  14. تحويلطاف في أنابيب جديدة وفحص لعامل نخر الورم ألفا (TNF-α) و (IL-10) محتوى انترلوكين 10 من قبل مجموعات ELISA التجارية باتباع إرشادات الشركة المصنعة.

6. خلية طحالية الفحص لتقييم إمكانات المناعية من الجسم الشبه الكروي-CM

  1. إعداد المتوسطة خلية طحالية كامل، والذي يتكون من معهد Rosewell من الحديقة التذكارية (RPMI) -1640 المتوسطة تستكمل مع المعطل للحرارة بنسبة 10٪ FBS، 1X البنسلين ستربتومايسين، و 2 المركابتويثانول. تصفية تعقيم المتوسطة.
  2. الطحال الحصاد من الموت الرحيم للذكور الفئران BALB / ج من خلال شق أعد على الجانب الأيسر من البطن فوق الطحال، حوالي منتصف الطريق بين الجبهة وهند الساقين 14. نقل الطحال لمصفاة الخلية 70 ميكرون لعزل splenocytes 14.
  3. عزل splenocytes / الخلايا الليمفاوية عن طريق دفع الطحال من خلال مصفاة 70 ميكرومتر إلى العقيمة النقيب طبق بتريز المطاط لينة / نهاية بلاستيكية من المكبس من 2-3 مل حقنة 14. استخدام حركة دائرية طحن لفصل الطحال.
  4. غسل مصفاة الخلية عدة مرات مع برنامج تلفزيوني الباردة ونقل الخلايا من طبق بتري إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. ملء الأنبوب مع برنامج تلفزيوني الباردة وأجهزة الطرد المركزي (500 x ج) في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  5. نضح طاف ومسح الخلايا من كريات الدم الحمراء من قبل الحضانة مع 5-10 مل من محلول أحمر خلايا الدم تحلل (في الطحال) لمدة 5-10 دقائق.
  6. وقف تحلل بإضافة برنامج تلفزيوني الباردة إلى الأنبوب وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5-10 دقيقة في 500 x ج وفي 4 درجات مئوية.
  7. تعليق الخلايا المعزولة في وسط خلية طحالية الكامل، تصفية من خلال مصفاة 40 ميكرون، وعدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. إضافة المتوسطة خلية طحالية إلى تعليق الخلية لتحقيق تركيز الخلية النهائي من 10 6 خلية / مل
    ملاحظة: هذه التقنية عادة ينتج حوالي 3 × 10 7 splenocytes في الطحال الماوس.
  8. تحفيز العدد المناسب من splenocytes مع 2 ميكروغرام / مل المضادة للأجسام المضادة CD3e لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: كمية من splenocytes المطلوبة يعتمد على عدد من الشروط التجريبية كما هو محدد من قبل المحقق (راجع الخطوة 6.9). لكل عينة تجريبية / جيد، يطلب 10 6 splenocytes.
  9. نقل 10 6 splenocytes (حفز أو غير حفز) في الآبار من 12 لوحة جيدا وإضافة غير مكيفة (الضوابط) أو MSC-CM في الآبار في التخفيف النهائي من 1: 10-1: 20.
  10. حصاد CM خلية طحالية بعد 24 ساعة وأجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  11. نقل طاف في أنابيب جديدة وفحص للانترفيرون غاما (IFN-γ) المحتوى من قبل عدة ELISA التجارية باتباع إرشادات الشركة المصنعة.

7. سرطان البروستاتا الفحص لتقييم إمكانات المضادة للسرطان من الجسم الشبه الكروي-CM

  1. إعداد الكامل المتوسطة النمو RPMI التي متوسطة RPMI-1640 تستكمل مع 10FBS٪، 1X البنسلين ستربتومايسين.
  2. الحصول على قارورة المجمدة من خلايا سرطان البروستاتا LNCaP واحتضان القارورة لمدة 2 دقيقة في حمام مائي 37 درجة مئوية.
  3. نقل محتويات القارورة في طبق ثقافة تحتوي على 30 مل من متوسط ​​النمو RPMI كاملة باستخدام pipettor الآلية و 5 مل الماصة المصلية. يغسل عدة مرات قنينة مع المتوسط ​​من الطبق ووضع الطبق في الحاضنة.
  4. قبل الخلايا تصل confluency، وغسل الثقافة مرتين مع درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني وفصل الخلايا LNCaP مع 3 مل من قبل تحسنت 0.25٪ حل التربسين / EDTA.
  5. تحييد التربسين في صحن مع متوسط ​​نمو RPMI كاملة ونقل الخلايا جنبا إلى جنب مع يغسل في أنبوب مخروطي 50 مل.
  6. الطرد المركزي الخلايا في 450 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ونضح طاف.
  7. إعادة تعليق الخلايا في حجم صغير من متوسط ​​النمو RPMI الكامل والاعتماد على الخلايا السرطانية باستخدام عدادة الكريات.
    8. نقل خلايا LNCaP في صحن 96-جيدا في 5000 خلية / جيدا في 120 ميكرولتر من اكتمال النمو المتوسطة RPMI تحتوي على 25٪ من غير مكيفة أو كروي سم. احتضان في الحاضنة لمدة 72 ساعة.
  8. لإجراء فحص نمو الخلايا باستخدام طقم فحص تكاثر الخلايا، ونضح المتوسط ​​من الآبار ونقل لوحة في الثلاجة (-80 درجة مئوية) لمدة لا تقل عن 3 ساعة.
    1. ذوبان الجليد لوحة وليز الخلايا في كل بئر بإضافة 100 ميكرولتر من كاشف خلية تحلل تحتوي على 180 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، و 0.2 ملغ / مل ريبونوكلياز أ.
    2. لمنحنى القياسية، مبالغ ليز الخلايا LNCaP كما هو موضح أعلاه.
    3. بعد 1 ساعة، إضافة 100 ميكرولتر من 1X العازلة خلية تحلل تحتوي على 1: 100 التخفيف من انتشار الخلايا الفحص الكاشف وقياس مضان في كل بئر لتحديد كمية الخلايا.

8. التسليم داخل الصفاق من الأجسام الشبه الكروية سليمة

  1. إعداد اللجان الدائمة كروي على النحو المبين أعلاه (بروتوكول 2) و resuspend رانه الكرات في محلول الملح المعقم هانك المتوازن (HBSS) تستكمل مع 0.2-0.5٪ هائل سعيد أنعم للحفاظ على ظروف XF. HSA في حل يساعد على منع التصاق المجال إلى البلاستيك خلال الحقن.
  2. نقل 40-120 الكروية في أنابيب مخروطية 15 مل وغسل الخلايا عن طريق إضافة 6 مل HBSS / هائل سعيد أنعم للأنابيب. السماح 3-4 دقيقة على مناطق النزول. إعداد أنبوب مخروطي مستقلة عن الكروية لكل حيوان. أيضا، إعداد أنابيب إضافية من الكروية لفحوصات تحديد الاحتفاظ كروي (انظر 8.18 أدناه)، وإنتاج العوامل العلاجية بعد نقل (انظر 8.19 أدناه) إذا رغبت في ذلك.
  3. نضح طاف، تراكب الكروية مع 100-200 ميكرولتر من العقيمة HBSS تستكمل مع 0.2-0.5٪ هائل سعيد أنعم، ووضع أنابيب على الجليد.
  4. تخدير لفترة وجيزة الحيوانات مع 2٪ الأيزوفلورين في الأكسجين 100٪ حتى اختفاء منعكس قرصة أخمص القدمين لحوالي 2 دقيقة في غرفة الاستقراء.
  5. وضع الحيوان داخل BSL-2 لمجلس الوزراء، اسبي الظهريةCT أسفل (الجانب البطني تواجه متابعة)، مع استمرار تدفق 1.5٪ خليط الأيزوفلورين / الأكسجين عبر مخروط الأنف.
  6. تنظيف أسفل البطن الماوس مع مطهر مثل الكحول 70٪.
  7. إزالة الغطاء من 20 G عن طريق الوريد (IV) القسطرة وإجراء حقن داخل الصفاق مع الجمعية القسطرة خنجر. استخدم يدا واحدة لعقد الجلد الماوس وآخر لأداء الحقن. تحديد نقطة الحقن تقريبا في منتصف خط الاصطناعي الذي يربط منطقة الركبة استعرضوا المشتركة والتناسلية مع طرف الإبرة تشير نحو خط الوسط.
    ملاحظة: التجمع القسطرة خنجر لديه مقاومة أعلى من الإبرة العادية، لذلك يهمني يجب أن يؤخذ لا لحقن إبرة عميق جدا في البطن، مما قد يؤدي إلى وقوع إصابات في الأعضاء الداخلية. يمكن أن يرى اختراق الجلد والعضلات ثم / الغشاء البريتوني خلال وضع القسطرة.
  8. إزالة بلطف خنجر المعادن / إبرة من الجمعية القسطرة خنجر. إيكولوجياك على خنجر للدم والبول والبراز وتخلص منه. الدم على الإبرة يشير ثقب عضو داخلي (ق).
  9. عقد القسطرة البلاستيكية في وضع مستقيم أثناء الحقن للسماح تدفق السوائل.
  10. تأكيد التنسيب المناسب للقسطرة بلاستيكية عن طريق حقن ما يقرب من 100 ميكرولتر من العقيمة HBSS / هائل سعيد أنعم عن طريق القسطرة باستخدام ماصة مع طرف 100-200 ميكرولتر. وضع نهاية للطرف ماصة داخل محول القسطرة حقنة تشكيل ختم مشددة. ببطء حقن السوائل داخل التجويف البريتوني.
    ملاحظة: سيتم السوائل في القسطرة وضعه بشكل صحيح تتدفق بحرية داخل التجويف البريتوني مع تعديل طفيف فقط من القسطرة. وضع غير لائق من القسطرة (تحت الجلد أو داخل الأمعاء، أو إذا كان رأس الإبرة بجروح أجهزة البريتوني مثل الكلى) ستزيد المقاومة والحد من التدفق. ووضع تحت الجلد يؤدي إلى تشكيل "فقاعة" واضحة تحت الجلد.
  11. جمع رانه ماجستير الكروية، الذي أعد 100-200 ميكرولتر من HBSS / هائل سعيد أنعم (الخطوة 8.3)، وذلك باستخدام 200 ميكرولتر ماصة، ونقل وحدة التخزين بالكامل من المجالات (40-120 المجالات) في التجويف البريتوني عن طريق القسطرة كما هو موضح أعلاه.
  12. غسل الأنبوب الذي يحتوي المجالات مع 100 ميكرولتر من HBSS / هائل سعيد أنعم باستخدام نفس معلومات سرية على النحو الوارد أعلاه لجمع أي الكروية المتبقية وضخها في التجويف البريتوني.
  13. (اختياري) حقن في 100 ميكرولتر إضافية من HBSS / هائل سعيد أنعم في التجويف البريتوني لغسل القسطرة.
  14. وضع الشاش غارقة في مطهر خلال القسطرة وإزالة ببطء القسطرة من التجويف البريتوني وتخلص منه.
  15. تدليك بلطف التجويف البريتوني مع الأصابع لضمان التوزيع العادل للالكروية.
  16. السماح للحيوان استرداد تحت إشراف دقيق ومشاهدة لنزيف من موقع الحقن.
  17. تفقد القسطرة وأنبوب 15 مل لأي الكروية المتبقية. فمن الطبيعي أن مراعاة بعض المجالات فيقسطرة / أنبوب.
    ملاحظة: هذه التقنية وصفها لجنة السلامة البحرية تسليم كروي يمكن اعتمادها للاستخدام في الحيوانات العادية أو في مجموعة متنوعة من النماذج الاصابة. وقد استخدمت هذه التقنية بنجاح لحقن الكروية في الماوس إصابة القرنية ونماذج endotoxemia، وكذلك في يسببها زيموزان نموذج التهاب الصفاق 8.
  18. لتحديد عدد الكروية المدورة (اختياري)، واستخدام المعتمدة على الحمض النووي عدد الخلايا الكمي طقم / كاشف. عقد القسطرة المستخدمة عبر أنبوب 15 مل والاستغناء بقوة HBSS / هائل سعيد أنعم عن طريق القسطرة لإجبار أي المجالات المتبقية مرة أخرى في أنبوب 15 مل.
    1. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 15 مل في 500 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ونضح طاف. نقل الأنبوب الذي يحتوي على بيليه كروي في الثلاجة (-80 درجة مئوية) لمدة لا تقل عن 3 ساعة.
    2. ذوبان الجليد أنبوب وليز المجالات وذلك بإضافة 500 ميكرولتر من كاشف خلية تحلل تحتوي على 180 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، و 0.2 ملغ / مل ريبونوكلياز أ.
    3. لعنصر تحكم، الصحائفإز وليز كمية معروفة من الكروية (أي ما يعادل يفضل أن عدد الكروية على استعداد لحقنة واحدة) كما هو موضح أعلاه.
    4. بعد 1 ساعة، ونقل 100 ميكرولتر من المحللة الخلية، في نسختين، في صفيحة 96-جيدا، ويضاف إلى كل بئر 100 ميكرولتر من 1X العازلة خلية تحلل تحتوي على 01:50 التخفيف من انتشار الخلايا الفحص الكاشف من هذه المجموعة. بعد 10 دقيقة، وقياس مضان في كل بئر لتحديد عدد من المجالات التي لم تحقن عن طريق مقارنة العينة التجريبية (s) مع عينة السيطرة.
  19. تقييم مستوى تفعيل الكروية التي أعدت لحقن (اختياري) عن طريق قياس تركيز PGE2 وTSG6 التي تنتجها المجالات المنقولة. نقل 40-120 المجالات عن طريق القسطرة، كما هو موضح أعلاه، إلى 12 جيدا أو 6 جيدا لوحة تحتوي على 1 أو 2 مل αMEM تستكمل مع 2٪ FBS و1X البنسلين / الستربتومايسين. وضع لوحات في الحاضنة لمدة 6 ساعات.
    1. نقل متوسطة منالآبار بعد 6 ساعات إلى 1.5 أو 15 مل من أنابيب وأنابيب الطرد المركزي في 450 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    2. نقل طاف خالية من الخلايا إلى الطازجة 1.5 مل أنابيب باستخدام ماصة وأجهزة الطرد المركزي في 10000 x ج لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    3. نقل أوضح سم (طاف) في الجديدة 1.5 مل الأنابيب وفحص للتركيز PGE2 (مؤشر جيد على إمكانات المضادة للالتهابات من سم) باستخدام مجموعة ELISA التجارية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تركيز TSG6 يمكن تحديد باستخدام بروتوكول نشر 14.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في العمل الحالي، كانوا يعملون شنقا الثقافات قطرة لتوليد المدمجة كروية الأنسجة الصغيرة أو "الكروية" من اللجان الدائمة تفعيلها في ظل ظروف XF. خارطة الطريق الفحص في الشكل 1 يصور أن يتم تشجيع اللجان الدائمة في تقرير المصير، تجميع في الكروية عندما علقت في شنقا قطرات لمدة 72 ساعة، وبعد ذلك الكروية، أو CM محملة العوامل العلاجية المستمدة المجال، يمكن جمعها ويحتمل أن تستخدم في كل من البحوث والتطبيقات السريرية. يمكن الحصول على عدد ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

لجنة السلامة البحرية المثلى لاستخدامها في بعض التطبيقات البحثية والسريرية يجب تفعيلها للغاية لتحقيق أقصى قدر من مصلحتهم، وعلى استعداد تفضيلي في ظل ظروف XF محددة كيميائيا للحد من وصول المستضدات المحتملة من مكونات المتوسطة xenogeneic مثل FBS. في البروتوكولات المذكورة هنا، لقد أظهرنا طرق ل1) تفعيل اللجان الدائمة في الثقافة 3D عن طريق تشكيل الأجسام الشبه الكروية، 2) تحقيق تفعيل 3D من اللجان الدائمة في ظل ظروف XF، 3) تقييم مستويات تفعيل اللجان الدائمة كروي في ما يخص مكافحة بهم التهابات...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

تم تمويل هذا العمل جزئيا من خلال P40RR17447 منحة من المعهد الوطني للصحة وجائزة RP150637 من معهد الوقاية من السرطان وأبحاثه في تكساس. نود أن نشكر الدكتور داروين ج. بروكوب على دعمه للمشروع.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
MEM- & ألفا; (الحد الأدنى من ألفا المتوسط الأساسي)ThermoFisher / Gibco12561049 ؛ 12561056 ؛ 12561072الحد الأدنى من الوسط الأساسي لإعداد وسط نمو MSC (CCM) FBS
(مصل الأبقار الجنينية) ، ممتاز اختيارAtlanta BiologicalsS11595 ؛ S11510 ؛ S11550; S11595-24مكون من وسائط الثقافة الكاملة لجميع أنواع الخلايا
L-glutamineThermoFisher / Gibco25030081 ؛ 25030149 ؛ مكون 25030164من وسائط الثقافة الكاملة لجميع أنواع الخلايا
البنسلين / الستربتومايسينThermoFisher / Gibcoمكون 15070063من وسائط الثقافة الكاملة لجميع أنواع الخلايا
وحدات تصفية التعقيم ، 0.22 & م غشاء PESMilliporeSigmaSCGPU01RE ؛ SCGPU02RE. SCGPU05RE. SCGPU10RE. SCGPU11REتعقيم الوسائط
150 مم طبق ثقافة الخليةNuncD8554 & nbsp ؛ ثقافة الخلايا
Thermo Forma CO2< / sub> حاضنة مرطبةThermo FisherModel 3110حضانة الخلايا المستنبتة
MCSs للممر المبكرلإعداد وتوزيع الخلايا الجذعية البالغة في Texas A& amp; مركز العلوم الصحية M ، كلية الطب ، معهد الطب في Scott & amp إعداد NA الأبيضللثقافات ثنائية الأبعاد و 3D من MSCs
حمام مائيVWR89501-468وسائط الاحترار إلى 37 درجة ؛ C
PipettesEppendorf492000904مناولة السوائل اليدوية
Pipete-AidDrummond Scientific Company4-000-300مناولة الماصات السيريولوجية
Costar الماصة المصلية المعقمة (5 و 10 و 25 و 50 مل)Corning4487 ؛ 4101 ؛ 4251 ؛ 4490مناولة السوائل
PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات) ، درجة الحموضة 7.4ThermoFisher / Gibco10010023 ؛ 10010072 ؛ 10010031; معالجةثقافة الخلايا
10010049 0.25٪ محلول التربسين / EDTAThermoFisher / Gibco25200056 ؛ 25200072 ؛ 25200114رفع الخلايا الملتصقة وتشتيت مجاميع الخلايا
15 مل أنبوب مخروطيCorning / BD Falcon352097خلية الطرد المركزي
50 مل أنبوب مخروطيCorning / BD Falconالطرد المركزي للخلايا
352098 Eppendor جهاز طرد مركزي مبردEppendorf / Fisher ScientificModel 5810Rمقياس الدم بالطرد المركزي للخلايا
فيشر Scientific26716عد الخلايا
الأزرقSigma-AldrichT8154 SIGMAاستبعاد الخلايا الميتة أثناء عد الخلايا في مقياس الدم
محدد xenofree MSC medium -1 (XFM-1)ThermoFisher / GibcoA1067501وسائط خالية من Xeno مصممة خصيصا لنمو وتوسع الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية
تعريف xenofree MSC medium-2 (XFM-2)الخلايا الجذعية5420محدد وخالي من xeno للخلايا الجذعية الوسيطة البشرية
HSA (ألبومين مصل بشري)Gemini800-120مكون من وسائط MSC الخالية من xeno
rHSA (ألبومين مصل بشري مؤتلف)Sigma-AldrichA9731   ؛ SIGMAمكون من وسائط MSC الخالية من xeno
Total RNA Isolated MiniQiagen74104إجمالي استخراج الحمض النووي
الريبي QiashredderQiagen79654تجانس العينة قبل الاستخراج الكلي للحمض النووي
مجموعة DNase الخالية من RNAse  Qiagen79254إزالة الحمض النووي على العمود أثناء استخراج الحمض النووي الريبي الكلي
& -mercaptoethanol   ;سيجما ألدريتشM6250  تثبيط ALDRICH للحمض النووي الريبي في المخزن المؤقت RLT
VortexVWR97043-562عينة الخلط
مقياس الطيف الضوئيBioradNAتركيز وجودة
مجموعة النسخ العكسي (cDNA) عالية السعةThermoFisher / Applied Biosystemsنسخ 4368814إجمالي الحمض النووي الريبي في
فحوصات التعبير الجينيThermoFisher / Applied Biosystemsيختلفمزيج التمهيدي / المسبار في الوقت الفعلي ل PCR
سريع العالمي PCR Master MixThermoFisher / Applied Biosystems4352042 ؛ 4364103 ؛ 4366073 ؛ 4367846مزيج رئيسي لتفاعل PCR في الوقت الفعلي
PCR في الوقت الحقيقي (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System)ABI PrizmNAفي الوقت الحقيقي PCR
1.5 مل أنبوب الطرد المركزيEppendorf22364111الطرد المركزي للخلايا وجمع العينات وتخزينها
(-80 درجة ؛ ج) الفريزرThermo FisherModel Thermo Forma 8695تخزين العينات
PGE2 (Prostaglandin E2) ELISA KitR & أنظمة KGE004Bتقدير تركيز السيتوكين في عينة
DMEM (Dulbecco' ق النسر المعدل متوسط)ThermoFisher / Gibco10566-016 ؛ 10566-024 ؛ 10566-032وسائط ثقافة البلاعم
J774 البلاعم الفأرATCCTIB-67الفأر البلاعم خط خلية
12 بئر لوحةCorning3513in vitro< / em> تحفيز البلاعم
LPS (عديدات السكاريد الدهنية)Sigma-aldrichL4130in vitro< / em> تحفيز البلاعم
الفأر TNF-a ELISA kitR & D SystemsMTA00Bتقدير تركيز السيتوكين في عينة
الفأر IL-10 (إنترلوكين 10) مجموعة ELISAR & D SystemsM1000Bتقدير تركيز السيتوكين في العينة
RPMI-1640 متوسطThermoFisher / Gibco11875-085وسائط ثقافة خلايا الطحال
BALB / c الفئرانمختبر جاكسون651in vivo< / em> توصيل كروي. تحضير خلايا الطحال
مضاد للفأر CD3e درجة وظيفية منقىeBioscience145-2C11in vitro < / em > تحفيز خلايا الطحال
70 & م مصفاة Corning352350تحضير خلايا الطحال
محلول تحلل خلايا الدم الحمراء (1x)Affymetrix eBioscience00-4333إزالة خلايا الدم الحمراء أثناء عزل خلايا الطحال
Mouse IFN- &# 947 ؛ (إنترفيرون جاما) مجموعة ELISAR & D SystemsMIF 00تقدير تركيز السيتوكين في عينة
خلايا سرطان البروستاتا LNCaP  ATCCCRL-1740تأثير الخلايا الجذعية ثلاثية الأبعاد على خطوط الخلايا السرطانية في المختبر < / em>
مجموعة فحص تكاثر الخلايا القائمة على الحمضThermoFisherC7026قياس عدد الخلايا بناء على محتوى الحمض النووي
NaClSigma-AldrichS5150من كاشف التحلل
EDTA (حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك)ThermoFisherFERR1021مخلب الكالسيوم ، مكون من كاشف التحلل
Rnase AQiagen19101تحلل الحمض النووي الريبي لقياس
قارئ الصفائح الدقيقة متعدد الأوضاع القائم على مرشحالحمض النووي BMG TechnologyNAفحوصات الصفيحة الدقيقة (ELISA ، القياس الكمي للخلية ، وما إلى ذلك < / em>)
HBSS (محلول الملح المتوازن Hanks) ، بدون كالسيوم ، بدون مغنيسيوم ، بدون فينول أحمرThermoFisher / Gibco14175079إعادة تركيب المركبات الحلقية الجذعية الجذعية قبل الحقن in vivo < / em>
IsofluraneMWI Vet Supply502017التخدير لحقن in vivo < / em>
الأكسجين والغاز المضغوطPraxairNAللاستخدام مع خزانة الأيزوفلوران
Thermo Forma BSL-2Thermo FisherModel 1385ثقافة الخلايا المعقمة
سلامة القسطرة IV / خنجر الإبرة ، 20 جم ، 1 بوصةTerumoSR * FNP2025توصيل shperoids إلى التجويف البريتوني
أطراف ماصة دقيقة معقمةيختلف Eppendorfفي التعامل مع السوائل / الخلايا
SIGMA مركز تقنيات وسيط Kit الريبي (cDNA) نظام D دراسة النووي مكون

المراجع

  1. Keating, A. Mesenchymal stromal cells: New directions. Cell Stem Cell. 10 (6), 709-716 (2012).
  2. English, K., Wood, K. J. Mesenchymal stromal cells in transplantation rejection and tolerance. Cold Spring Harb Perspect.Med. 3 (5), a015560(2013).
  3. Le Blanc, K., Mougiakakos, D. Multipotent mesenchymal stromal cells and the innate immune system. Nat.Rev.Immunol. 12 (5), 383-396 (2012).
  4. Follin, B., Juhl, M., Cohen, S., Perdersen, A. E., Kastrup, J., Ekblond, A. Increased Paracrine Immunomodulatory Potential of Mesenchymal Stromal Cells in Three-Dimensional Culture. Tissue Eng.Part B.Rev. , (2016).
  5. Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Int. , 9176357(2016).
  6. Achilli, T. M., Meyer, J., Morgan, J. R. Advances in the formation, use and understanding of multi-cellular spheroids. Expert Opin.Biol. Ther. 12 (10), 1347-1360 (2012).
  7. Sart, S., Tsai, A. C., Li, Y., Ma, T. Three-dimensional aggregates of mesenchymal stem cells: cellular mechanisms, biological properties, and applications. Tissue Eng.Part B.Rev. 20 (5), 365-380 (2014).
  8. Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 107 (31), 13724-13729 (2010).
  9. Potapova, I. A., et al. Mesenchymal stem cells support migration, extracellular matrix invasion, proliferation, and survival of endothelial cells in vitro. Stem Cells. 25 (7), 1761-1768 (2007).
  10. Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Eng.Part C.Methods. 16 (4), 735-749 (2010).
  11. Lee, R. H., et al. Intravenous hMSCs Improve Myocardial Infarction in Mice because Cells Embolized in Lung Are Activated to Secrete the Anti-inflammatory Protein TSG-6. Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).
  12. Bartosh, T. J., Ylostalo, J. H., Bazhanov, N., Kuhlman, J., Prockop, D. J. Dynamic compaction of human mesenchymal stem/precursor cells into spheres self-activates caspase-dependent il1 signaling to enhance secretion of modulators of inflammation and immunity (PGE2, TSG6, and STC1). Stem Cells. 31 (11), 2443-2456 (2013).
  13. Ylostalo, J. H., Bartosh, T. J., Coble, K., Prockop, D. J. Human mesenchymal stem/stromal cells cultured as spheroids are self-activated to produce prostaglandin E2 that directs stimulated macrophages into an anti-inflammatory phenotype. Stem Cells. 30 (10), 2283-2296 (2012).
  14. Ylostalo, J. H., Bartosh, T. J., Tiblow, A., Prockop, D. J. Unique characteristics of human mesenchymal stromal/progenitor cells pre-activated in 3-dimensional cultures under different conditions. Cytotherapy. 16 (11), 1486-1500 (2014).
  15. Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White. , http://www.medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html (2016).
  16. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
  17. Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat.Rev.Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
  18. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  19. Fontaine, M. J., Shih, H., Schafer, R., Pittenger, M. F. Unraveling the Mesenchymal Stromal Cells' Paracrine Immunomodulatory Effects. Transfus.Med.Rev. 30 (1), 37-43 (2016).
  20. Nemeth, K., et al. Bone marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their interleukin-10 production. Nat.Med. 15 (1), 42-49 (2009).
  21. Prockop, D. J. Concise review: two negative feedback loops place mesenchymal stem/stromal cells at the center of early regulators of inflammation. Stem Cells. 31 (10), 2042-2046 (2013).
  22. Krampera, M. Mesenchymal stromal cell 'licensing': a multistep process. Leukemia. 25 (9), 1408-1414 (2011).
  23. Saleh, F. A., Genever, P. G. Turning round: multipotent stromal cells, a three-dimensional revolution? Cytotherapy. 13 (8), 903-912 (2011).
  24. Tsai, A. C., Liu, Y., Yuan, X., Ma, T. Compaction, fusion, and functional activation of three-dimensional human mesenchymal stem cell aggregate. Tissue Eng.Part A. 21 (9-10), 1705-1719 (2015).
  25. Yeh, H. Y., Liu, B. H., Hsu, S. H. The calcium-dependent regulation of spheroid formation and cardiomyogenic differentiation for MSCs on chitosan membranes. Biomaterials. 33 (35), 8943-8954 (2012).
  26. Lee, E. J., et al. Spherical bullet formation via E-cadherin promotes therapeutic potency of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood for myocardial infarction. Mol.Ther. 20 (7), 1424-1433 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PGE2 TSG6

مقالات ذات صلة