مقالة منهجية
يصف هذا البروتوكول إعادة البناء على نطاق واسع من السكان العصبية انتقائية، وصفت بعد الإصابة الوراء مع فيروس داء الكلب المعدلة ويعبرون عن علامات الفلورسنت، ومستقلة، مجموعة مشاركات التحليلات التي تمكن توصيف شامل من المقاييس المورفولوجية بين الفئات الفرعية العصبية متميزة.
ويحدد هذا البروتوكول إعادة البناء على نطاق واسع من الخلايا العصبية جنبا إلى جنب مع استخدام التجميع مستقلة وغير منحازة التحليلات لإنشاء مسح شامل لالخصائص المورفولوجية لوحظ بين السكان العصبية انتقائية. الجمع بين هذه التقنيات يشكل نهجا رواية لجمع وتحليل البيانات تشريحي عصبي. معا، وتمكن هذه التقنيات على نطاق واسع، وبالتالي أكثر شمولا، وأخذ عينات من السكان العصبية انتقائية وتحدد الأساليب الكمية مشاركات لوصف الطبقات العصبية فريدة شكليا ضمن مجموعة من السكان.
يحدد البروتوكول استخدام فيروس داء الكلب المعدلة لتسمية انتقائي الخلايا العصبية. G-حذف أفعال فيروس داء الكلب مثل التتبع الوراء بعد الحقن التجسيمي في بنية الدماغ الهدف من الفائدة وبمثابة وسيلة لإيصال والتعبير عن EGFP في الخلايا العصبية. يصاب عدد كبير من الخلايا العصبية باستخدام هذاتقنية والتعبير عن GFP طوال التشعبات، وإنتاج يملأ كاملة من الخلايا العصبية الفردية "جولجي مثل". وفقا لذلك، ويحسن طريقة تتبع الوراء بوساطة فيروس على تقنيات تتبع الوراء التقليدية قائم على الأصباغ التي تنتج يملأ داخل الخلايا كاملة.
ويتم اختيار الفردية الخلايا العصبية معزولة جيدا تغطي جميع مناطق منطقة الدماغ تحت الدراسة لإعادة الإعمار من أجل الحصول على عينة تمثيلية من الخلايا العصبية. يحدد البروتوكول إجراءات لإعادة بناء أجسام الخلايا وإكمال أنماط تشجر شجيري من الخلايا العصبية المسماة تمتد أقسام الأنسجة المتعددة. يتم استخراج البيانات الشكلية، بما في ذلك مواقف كل الخلايا العصبية داخل بنية الدماغ، لمزيد من التحليل. واستخدمت وظائف البرمجة القياسية لأداء مجموعة مستقلة التحليلات والتقييمات العنقودية على أساس المقاييس المورفولوجية. للتحقق من جدوى هذه التحليلات والتقييم الإحصائي لPERFO التحليل العنقوديrmed على 160 الخلايا العصبية بناؤها في النواة الشبكية المهادية من المهاد (TRN) من قرد المكاك كان. كل من التحليل العنقودي الأصلي والتقييمات الإحصائية يؤديها هنا تشير إلى أن يتم فصل الخلايا العصبية TRN إلى ثلاث مجموعات سكانية فرعية، لكل منها خصائصها المورفولوجية فريدة من نوعها.
التشريح هي واحدة من أسس علم الأعصاب 1 والفائدة الأخيرة في "connectomics" جددت الحماس لفهم التنوع الصرفي من السكان العصبية والروابط بين الخلايا العصبية الخاصة 2. طرق لوضع العلامات والخلايا العصبية إعمار قد تحسنت بشكل كبير مع الابتكارات الحديثة، بما في ذلك وراثي وبوساطة فيروس تتبع الدائرة النهج 3، 4، تمكين استطلاعات المورفولوجية أشمل من السكان العصبية 5. وبالإضافة إلى التحسينات في وصفها الخلايا العصبية الفردية، وظهرت تقنيات تحليل البيانات الكمية أيضا أن تتيح تصنيف مستقل وغير متحيز من الخلايا العصبية ف....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
ملاحظة: تم إعداد الأنسجة فحصه في هذه الدراسة كجزء من دراسة منفصلة 5. لذلك، كل من الطرق التجريبية التي تنطوي على استخدام الحيوانات تم وصفها بالتفصيل في القسم طرق التجريبية من بريغز وآخرون. (2016). وقد وافق جميع الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات التي أجريت كجزء من دراسة سابقة من قبل لجان رعاية الحيوان واستخدام المؤسسية. ويصف الخطوات لحقن الفيروس في dLGN ومعالجة النسيجي للأنسجة المخ أدناه لفترة وجيزة في أقسام 1-2.
1. التجسيمي الحقن
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
لقد أظهرنا سابقا أن إعادة البناء على نطاق واسع من الخلايا العصبية داخل الكتلة السكانية الانتقائي هي حقن يلي ممكن من فيروس داء الكلب المعدلة في dLGN 5. مؤخرا، تم استخدام نفس النسيج لإعادة بناء 160 خلية عصبية في قطاع المرئي للTRN (براج وآخرون، في الاستعراض؛. الشكل 2A-B) باتباع الخطوات المنهجية التفصيلية المذكورة أعلاه. في دراسة TRN، ثلاث مجموعات فريدة من الخلايا العصبية TRN تم تحديدها على أساس تحليل مستقل.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
ظلت الدراسات تشريحي عصبي أحد أعمدة علم الأعصاب والفائدة الأخيرة في connectomics والعلاقات هيكل الوظائف وجدد الحماس لالتوصيف المورفولوجي مفصل من السكان العصبية انتقائية. تقليديا، وقد اعتمدت الدراسات تشريحي عصبي في التصنيفات النوعية من الخلايا العصبية إلى طبقات متميزة شكليا من الخلايا العصبية التي يحددها neuroanatomists الخبراء. مع التقدم في تقنيات إعادة بناء الخلايا العصبية واستخراج البيانات الشكلية، فمن الممكن الآن للاستفادة من أساليب تحليل البيانات أكثر تطورا والكمية لتصنيف الطبق.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
ونود أن نشكر الدكاترة. إد كلوي ومارتي Usrey على إتاحة الفرصة لنا لاستخدام الأنسجة أعدت كجزء من دراسة سابقة وليبي Fairless وشياوان الباحث ليو للمساعدة في إعادة بناء الخلايا العصبية. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (نيى: EY018683) ومؤسسة وايت هول.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| SAD & دلتا; مختبر G-EGFP | E.M. Callaway ، معهد | من إعداد الدكتور ف. أوساكادا. يتوفر فيروس داء المحذوف G من خلال قطب التسجيل الأساسي الفيروسي لمعهد سالك | |
| : البلاتين / الإيريديوم أو التنجستن | FHC | UEPSGGSE1N2M | قم بزيارة الموقع الإلكتروني (www.fh-co.com) للحصول على مواصفات الطلبات البديلة |
| Nanoject II | Drummod Scientific | 3-000-204 ، 110V | البدائل: picospritzer ، حقنة هاميلتون |
| تجميد ميكروتوم | Thermo Scientific | ||
| DAB | Sigma Aldrich | D5905-50TAB | 3،3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride ، قرص ، ركيزة 10 مجم لكل قرص. تحذير: مادة مسرطنة - يجب تبييضها قبل التخلص |
| من السيتوكروم C | Sigma Aldrich | C2037-100MG | |
| Catalase | Sigma-Aldich | C9322-5G | |
| Rabbit anti-GFP | Life Technologies / Thermo Fisher | #A-11122 | الجسم المضاد الأولي |
| مختبرات ناقلات | الماعز المضادة للأرانب | البيوتينيلية#BA-1000 | نظام الأجسام المضادة الثانوية |
| Neurolucida | MicroBrightField | لتتبع الخلايا العصبية وتحليلها. http://www.mbfbioscience.com/neurolucida | |
| Neurolucida Explorer | MicroBrightField | برنامج تصدير البيانات | |
| Microfire Camera ؛ | كاميرا مجهر ملونة حقيقية Optronics | 2 ميجابكسل. http://www.simicroscopes.com/pdfs/microfire.pdf | |
| نيكون E800 مجهر | نيكون إنسترومنتس. | مجهر البحوث البيولوجية. http://www.microscopyu.com/museum/eclipseE800.html | |
| Matlab | The MathWorks Inc. | برنامج الرياضيات الحاسوبية المستند إلى المصفوفة. http://www.mathworks.com | |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | Spreadsheet |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن