توفر هذه المخطوطة البروتوكولات التي تستخدم في الرحم Electroporation لل(IUE) لوصف الربط الهيكلي للخلايا العصبية على مستوى وحيدة الخلية واستثارة الخلايا العصبية fluorescently المسمى. يستخدم الأنسجة لتوصيف شجيري والتوقعات محور عصبي. يستخدم تسجيل كامل الخلية في شرائح حادة لتحقيق استثارة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
في الرحم النهج Electroporation لللدراسة استثارة الخلايا العصبية القطعان والربط وحيدة الخلية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ويتكون الجهاز العصبي من مجموعة ضخمة من أنواع الخلايا العصبية واضحة. وتتميز هذه القطعان العصبية، من بين الميزات الأخرى، الأشكال التضاريسية شجيري المتميزة، أنماط محددة من الربط محور عصبي، وردود اطلاق انتقائية بهم. لا تزال غير مفهومة الآليات الجزيئية والخلوية المسؤولة عن هذه الجوانب من التمايز خلال التنمية.
هنا، نحن تصف بروتوكولات مشتركة لوضع العلامات وتميز الربط الهيكلي واستثارة الخلايا العصبية القشرية. تعديل في الرحم Electroporation لل(IUE) بروتوكول يسمح بوضع العلامات على عدد سكانها قليل من الخلايا العصبية. وهذا، بدوره، تمكن من تحديد وتعقب من التشعبات والمحاور من الخلايا العصبية الفردية، والتوصيف الدقيق للموقع الصفحي من التوقعات محور عصبي، وتحليل المورفومترية. ويمكن أيضا IUE استخدامها لتحقيق التغييرات في استثارةالبرية من نوع (WT) أو الخلايا العصبية المعدلة وراثيا عن طريق الجمع بين ذلك مع تسجيل خلية كاملة من شرائح حادة من العقول electroporated. وتساهم هذه التقنيات اثنين إلى فهم أفضل للاقتران الربط الهيكلي والوظيفي والآليات الجزيئية التي تتحكم في التنوع العصبية خلال التنمية. هذه العمليات التنموية لها آثار مهمة على الأسلاك محور عصبي، والتنوع الوظيفي للخلايا العصبية، وعلم الأحياء من الاضطرابات المعرفية.
المقدمة
تطوير الهياكل الشجرية ومحور عصبي هو أحد الجوانب الهامة من تنظيم الدائرة في الجهاز العصبي، بما في ذلك في القشرة الدماغية. انها تلعب دورا حاسما خلال الأسلاك انتقائيا من القطعان العصبية المختلفة. وأظهر عدد من التقارير الأخيرة أنه، بالإضافة إلى الاتصال، وينعكس التنوع الجزيئي للخلايا العصبية التي كتبها اقتناء وسائل محددة للغاية لإطلاق النار. ومع ذلك، فإن آليات تحديد استثارة والتواصل بين الأنواع الفرعية العصبية متميزة خلال التنمية، وكذلك درجة من التنسيق، لا تزال غير مفهومة 1 و 2.
في الجسم الحي loss-....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقد وافق جميع الإجراءات الحيوانية في مجتمع مدريد رعاية الحيوان واستخدام اللجنة، وفقا للتشريعات الوطنية والأوروبية (PROEX 118/14، 331/15 PROEX). الحفاظ على ظروف معقمة أثناء العملية.
1. في الرحم Electroporation لل
ملاحظة: تعديل هذا البروتوكول لIUE من الآخرين التي تم نشرها سابقا 5، 6، 7. توضح هذه المخطوطة بروتوكول لIUE من E15.5 الأجنة، مع تعديلات في الاستراتيجية المراسل أن تسمح لدراسة مورفولوجية ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
لوصف التغيرات المورفولوجية من الخلايا العصبية في التفاصيل وطوال التنمية، لا بد من تسمية الخلايا العصبية قليلة. يسمح هذا النظام لجنة المساواة العرقية recombinase المخفف للتعبير عن الجينات في المصالح في عدد سكانها قليل من الخلايا العصبية، بحيث فقط تلك الخلايا العصبية التي تتضمن هذا الانزيم تعبر عن GFP (الشكل 1A). باستخدام هذه الاستراتيجية، والتي تستهدف الطبقة II-III وصفت من قبل IUE في E15.5. CAG-DsRed2 في 1 ميكروغرام / ميكرولتر، ويبع.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يصف هذا البروتوكول بالتفصيل كيفية تسمية الخلايا العصبية في القشرة الحسية الجسدية من C75BL / 6 الفئران من أجل تحليل الارتباط واستثارة بهم. وفيما يتعلق بأساليب القائمة، فإنه يتصور جوانب تميز من الاتصال، مثل عدد من فروع محور عصبي في الخلايا العصبية، والطوبوغرافيا على وجه الدقة، وموقعها التشريحي. عن طريق تغيير موقف الأقطاب، فمن الممكن لاستهداف السكان الخلايا العصبية الأخرى، مثل القشرة الحزامية (الحفاظ على نفس الزاوية بين الأقطاب والدماغ، ولكن تغيير اتجاه القطبين) أو قرن آمون
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
أعلن المؤلفون أنه لا يوجد اختلاف في الاهتمامات.
شكر وتقدير
ونحن ممتنون لر غوتييريز وA. موراليس للحصول على مساعدة فنية ممتازة والى لوس انجليس فايس للتحرير. ويتم تمويل CGB من قبل الإسبان MINISTERIO دي Ciencia ه Innovación (MICINN)، FPI-بيز-2012-056011. وقد تم تمويل هذا العمل من خلال منحة من مؤسسة BBVA وSAF2014-58598-جين (MINECO) لم. نافاريتي وبمنحة من مؤسسة Areces رامون والمنح SAF2014-52119-R وBFU2014-55738-REDT (من MINECO) ل م نييتو.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| pCAG-Cre | Addgene | 13775 | |
| pCALNL-GFP | Addgene | 13770 | |
| pCAG-DsRed2 | Addgene | 15777 | |
| pCAG-GFP | Addgene | 11150 | |
| Fast Green | Carl Roth | 301.1 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Carprofen (Rimadyl) | فايزر جي إم بي إتش | 1615 ESP | |
| إيزوفلوران (إيزوفلو) أبوت | (إستيف) | 1385 ESP | |
| كيتامين (إيمالجين) | ميريال | 2528-ESP | |
| زيلازين (زيلاجيسك) كاليير | 0682-ESP | ||
| بوفيدون يود | ميدا | 694109.6 | |
| مرهم العين (ليبولاك) أنجليني | 65.277 | ||
| محلول الملح المتوازن من هانكس (HBSS) | جيبكو من لايف تكنولوجيز | 24020-091 | |
| مقبض مشرط البنسلين الستربتومايسين | سيجما -ألدريتش | P4333 | |
| # 3 - 12 سم | أدوات العلوم الدقيقة | 10003-12 | |
| شفرات مشرط # 10 | أدوات العلوم الدقيقة | 10010-00 | |
| ملقط أدسون مسنن - مستقيم 12 سم | أدوات العلوم الدقيقة | 1106-12 | |
| مقص ناعم مقوى - أدوات علوم دقيقة مستقيمة مقاس 11 سم | 14090-11 | ||
| مقص Mezenbaum-Nelson منحني L = 14.5 سم | Teleflex | PO143281 | |
| أطراف منحنية رفيعة - نمط 7 Dumoxel | Dumont | 0303-7-PO | |
| Dumont # 5 Fallps-Inox | Fine Science | Tools 11251-20 | |
| حامل إبرة Mathieu - | مسنن ناعم أدوات العلوم | 12010-14 | |
| AutoClip Applier | Braintree العلمي ، Inc | ACS & nbsp ؛ APL | |
| 9 ملم AutoClips | MikRon Precision، Inc. | 205016 | |
| خيوط - Polysorb 6-0 | Covidien | UL-101 | |
| ماكينة حلاقة كهربائية | باناسونيك | ER 240 | |
| الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات (100 مم ، 1.0 / 0.58 القطر الخارجي / الداخلي) شركة | World Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
| مجموعات أنابيب الشفاط للماصات الشعرية الدقيقة المعايرة | Sigma -Aldrich | A5177-5EA | |
| Gauze (Aposan) | Laboratorios Indas ، SAU | C.N. 482232.8 | |
| مسحات قطنية (ستار كوت) إبرة | الباسا | ||
| 25 جم (BD Microlance 3) | Becton و Dickinson and Company | 300600 | |
| Sucrose | Sigma -Aldrich | S0389 | |
| Paraformaldehyde | Sigma -Aldrich | 158127 | |
| OCT Compound | Sakura | 4583 | |
| طبق زراعة الأنسجة 100 × 20 مم | فالكون | 353003 | |
| GFP العلامة الأجسام المضادة متعددة النسيلة | الحرارية فيشر العلمية | A-11122 | |
| الجسم المضاد الثانوي ، Alexa Fluor 488 المترافق | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 ؛ | |
| مصل الأبقار الجنيني | ثيرمو فيشر العلمي | 10270106 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Electroporator ECM 830 ؛ | BTX Harvard Apparatus | 45-0002 | |
| أقطاب كهربائية بلاتينية 650P 7 مم | Nepagene | CUY650P7 | |
| المجهر للتصوير الفلوري - MZ10F | Leica-VIP | ||
| 3000 Isofluorane Vaporizer | |||
| المسح بالليزر | Leica-Axiovert | ||
| 200 مجهر | Zeiss-Cryostat | ||
| - CM 1950 | Leica-P-97 | ||
| Micropette Puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| تحليل مشبك التصحيح softwarw (p-Clamp Clampfit 10.3) | برامج اقتناء الأجهزة | ||
| (MultiClamp 700B Amplifier) | الأجهزة الجزيئية | DD1440A | |
| مناور دقيق بمحركات + قاعدة دوارة ؛ | أداة سوتر | MP-225 | |
| طاولة هواء | نيوبورت | مضخات | |
| تمعجية مصغرة | WPI- |
المراجع
- Dehorter, N., et al. Tuning of fast-spiking interneuron properties by an activity-dependent transcriptional switch. Science. 349 (6253), 1216-1220 (2015).
- Rodriguez-Tornos, F. M., et al. Cux1 Enables Interhemispheri....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
