Method Article

طريقة لتصور وتحليل غشاء متبادلة البروتينات التي نقل المجهر

DOI:

10.3791/55148

⸱

March 5th, 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biosciences and Nutrition, Karolinska Institutet, 2School of Technology and Health, KTH Royal Institute of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تؤدي العديد من البروتينات وظيفتها عند ربطها بأسطح الغشاء. يمكن تصوير ارتباط البروتينات الخارجية على أغشية الأقراص النانوية بشكل غير مباشر عن طريق المجهر الإلكتروني للإرسال. نوضح أن التكديس المميز (رولو) للأقراص النانوية الناجم عن وصمة عار الصوديوم السلبية فوسفوتنجستات يتم منعه عن طريق ارتباط البروتين الخارجي.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمارس البروتينات أحادية الموضع وظيفتها عند ربطها بسطح الغشاء ، وتعتمد هذه التفاعلات على تركيبة الدهون المحددة وعلى توافر مساحة كافية لأداء الوظيفة. تستخدم الأقراص النانوية لتوفير سطح غشاء بحجم متحكم فيه ومحتوى دهوني. في حالة عدم وجود بروتينات خارجية مرتبطة ، تظهر الأقراص النانوية الملطخة بفوسفوتنجستات الصوديوم على شكل أكوام من العملات المعدنية عند عرضها من الجانب بواسطة المجهر الإلكتروني للإرسال (TEM). لذلك تم تصميم هذا البروتوكول لتعزيز التراص عن قصد; وبالتالي ، يمكن تفسير منع التكديس على أنه ارتباط البروتين المرتبط بالغشاء بالقرص النانوي. في خطوة أخرى ، يمكن معالجة صور TEM لمجمعات البروتين والأقراص النانوية باستخدام طرق قياسية أحادية الجسيم لإنتاج هياكل منخفضة الدقة كأساس لعمل cryoEM عالي الدقة. علاوة على ذلك ، توفر الأقراص النانوية عينات مناسبة إما للرحلان الكهربائي للهلام غير المتغير. لتوضيح الطريقة ، يتم تقديم الارتباط الناجم عن Ca2 + ل 5-lipoxygenase على الأقراص النانوية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في البحوث الطبية، وتركز الكثير من الاهتمام على بروتينات الغشاء، داخلية كانت أم خارجية، والمشاركة في مجموعة متنوعة من التفاعلات الدهون. العمل مع البروتينات التفاعل الدهون يتضمن إما اختيار بديلا عن الدهون، مثل المنظفات، amphipols 1، أو بروتينات صغيرة 2، أو إيجاد بديل غشاء التي تحافظ على بروتين قابل للذوبان ونشطة. وتشمل بدائل غشاء ليبويك الجسيمات الشحمية وnanodiscs (ND) 3، 4.

Nanodiscs هي منصات غشاء شبه الأم التي وضعتها الهندسة الجزء البروتين، وبرنامج عمل ألماتي-1، من البروتين الدهني عالي الكثافة (HDL) التي تحدث بشكل طبيعي في الدم. برنامج عمل ألماتي-1 هو سلسلة 243 بقايا طويلة من قصيرة متقابلة الزمر α-اللوالب، ولها التشكل للذوبان خالية من الدهون. في المختبر في وجود الدهون، نسختين من البروتين برنامج عمل ألماتي-1 إعادة ترتيب تلقائيا إلى تطويق HYDRophobic جزء سلسلة أسيل من الدهن طبقة ثنائية التصحيح 5. النسخ المهندسة لبرنامج عمل ألماتي-1 وتسمى عادة بروتينات الغشاء السقالات (MSP)، وعدد متزايد متاح تجاريا باسم البلازميدات أو تنقية البروتينات. التكرار أو الحذف من α-اللوالب في برنامج عمل ألماتي-1 نتيجة في أطول 6 أو أقصر البروتينات السقالات 7 الغشاء. وهذا بدوره يجعل من الممكن لتشكيل أقراص حوالي 6 نانومتر إلى 17 نانومتر 7 8 في قطر. وهناك أنواع مختلفة من التطبيقات لnanodiscs 3 و 9. التطبيق الأكثر شيوعا هو لتوفير بيئة غشاء شبه أصلي لتحقيق الاستقرار في بروتين الغشاء لا يتجزأ 8، سبق استعراضها 3 و 9. واستخدام أقل استكشافها هو لتوفير سطح غشاء النانو لدراسة البروتينات 10، 11، 12، 13، 14، 15، 16، 17 غشاء الطرفية. المادة 1 من البروتوكول يتصور تحت الإجراء لصنع nanodiscs تتألف من الدهون الفوسفاتية والبروتين غشاء السقالات.

تحضير عينات هو عنق الزجاجة في معظم الطرق. عينات طريقة محددة قد تضيف معلومات معينة، ولكنها أيضا إجراء مقارنات النتائج صعوبة. وبالتالي، فمن أبسط عندما العينات المتعدد الوسائط، ويمكن استخدامها مباشرة في العديد من الطرق المختلفة. ميزة واحدة مع استخدام nanodiscs هي صغر حجم nanodisc بالمقارنة مع الجسيمات الشحمية (على سبيل المثال، وعينات يمكن استخدامها مباشرة لكل من تيم وعدم تغيير طبيعة الكهربائي للهلام، كما هو الحال في هذا البروتوكول).

الصورة = "jove_content"> وقد استخدمت الحويصلات والجسيمات الشحمية وقتا طويلا لفهم وظيفة من البروتينات التفاعل الغشاء. للدراسات الهيكلية والتصور، ومثال على تقرير الهيكلي للبروتين الغشاء في الجسيمات الشحمية متاح 18. ومع ذلك، فقد تم نشر أية عالية الدقة هيكل 3D من بروتين الغشاء monotopic جزءا لا يتجزأ من على غشاء الحويصلية بعد، بقدر ما نعرف. جزيئات الذهب أو الأجسام المضادة يمكن استخدامها لتصور البروتينات ملزمة لالليبوزومات أو حويصلات باستخدام تيم 19. على الرغم من أن هذه التحقيقات هي محددة للغاية، لأنها قد تتداخل مع البروتينات ملزم الغشاء الحجاب الموقع غشاء ملزم أو عن طريق اخفاء المجالات ذات الاهتمام مع أجزاء مرنة. الذهب المسمى أو ربما يمكن أن تحلل البروتينات المعقد الأجسام المضادة على هلام، ولكن هذا من شأنه أن يزيد من تكلفة التجربة.

على الرغم من الجسيمات الشحمية هي منصة ممتازة، لا يمكن للمرء أن يكون على يقين من أن البوبulation لديها نسبة معينة من البروتين لكل الحويصلية، وهي الميزة التي يمكن استكشافها عن طريق استخدام nanodiscs 20. في الحويصلية، العوامل المساعدة وركائز يمكن محاصرين في الداخل القابلة للذوبان. والمواد التي هي غشاء للذوبان في مشاركة نفس مصير لكلا النوعين من محاكيات الغشاء. على الرغم من ذلك، حيث أن منطقة طبقة ثنائية أصغر في nanodiscs، مطلوب كمية أقل من مادة لتشبع الأغشية nanodisc.

وكانت وظيفة البروتين فهم من خلال تحديد التركيب الذري أساسيا للعديد من مجالات البحث. وتشمل وسائل لتحديد بنية البروتين الأشعة السينية 21؛ الرنين المغناطيسي النووي (NMR) 22، 23؛ وانتقال المجهر الإلكتروني (تيم) 24 في درجات الحرارة المبردة، cryoEM. القرار الذي cryoEM تمت في الآونة الأخيرة قد تحسنت إلى حد كبير، ويرجع ذلك أساسا إلى استخدام المباشر الإلكترون ديtectors 25 و 26. يتم تصوير الجزيئات في رقيقة، زجاجي الجليد 27 في حالة شبه الأصلي. ولكن نظرا لتباين منخفض الجزيئات البيولوجية، فإنها تصبح من الصعب كشف في حجم مجموعة من 100-200 كيلو دالتون. للحصول على عينات بحجم مناسب، وجمع البيانات يمكن أن تكون وسيلة لإعادة الإعمار جسيم واحد يمكن تطبيقها للحصول على هيكل 28.

ومع ذلك، فإن تحديد بنية البروتين عن طريق تيم هو عملية متعددة الخطوات. وعادة ما يبدأ تقييم عينة monodispersity بواسطة وصمة عار السلبية تيم 29 باستخدام أملاح المعادن الثقيلة مثل phosphotungsten (PT) 30 أو اليورانيوم 31. إعادة بناء نموذج منخفضة الدقة من جزيء ملطخة سلبا يتم عادة ويمكن أن تسفر عن معلومات هامة عن التركيب الجزيئي 29. بالتوازي،جمع البيانات باستخدام cryoEM قد تبدأ. ينبغي توخي الحذر عند تقييم البيانات تيم وصمة عار السلبية لتجنب سوء الفهم من تشكيل الحرفية. واحد الحرفية خاص هو تأثير وصمة عار PT على الدهون الفوسفاتية والجسيمات الشحمية 32، مما أدى إلى تشكيل قضبان طويلة تشبه رزمة من النقود ينظر اليها من الجانب 33. وقد لوحظت هذه "رولو" أو "أكوام" (الرمز الآخرة بأنها "أكوام") في وقت مبكر لHDL 34، وبعد ذلك أيضا لnanodiscs 35.

قد يحدث التراص وإعادة تشكيل الأغشية لأسباب عديدة. على سبيل المثال، يمكن أن تحدثها العوامل المشتركة مثل النحاس ويتضح من التصوير تيم في الأمونيوم كربونات صمة عار 36. وجزء من نسبة الدهون في غشاء في الجسيمات الشحمية احتوى على مجموعة حمض رئيس iminodiacetic محاكاة complexation المعدنية بنسبة EDTA، وبالتالي التراص الجسيمات الشحمية بعد إضافة أيونات النحاس 36. التراص يمكن أن يكون أيضا نتيجة لتفاعل البروتين البروتين بواسطة بروتين في أو على طبقات ثنائية الدهون (وصمة عار المستخدمة لم يرد ذكرها) 37. وقد لوحظ تشكيل كومة من الدهون الفوسفاتية من قبل حزب العمال في وقت مبكر. ومع ذلك، فقد تركز العمل في وقت لاحق على إزالة أو إلغاء هذا التشكيل قطعة أثرية 38.

هنا، نقترح طريقة للاستفادة من nanodisc يسببها نابت التراص لدراسة البروتينات ملزم الغشاء بواسطة تيم. وباختصار، فإن بروتين ملزمة على nanodiscs منع nanodiscs من التراص. على الرغم من أن أسباب التراص ليست واضحة، اقترح 39 أن هناك تفاعل الكهربائي بين الدهون الفوسفاتية ومجموعة فسفوريل من حزب العمال، مما تسبب في أقراص التمسك بعضها البعض (الشكل 1A). فرضية وراء بروتوكول لدينا هي أنه عندما يتحد بروتين لnanodisc، معظم سطح فوسفورية ليس عن توافر بليه للتفاعل مع حزب العمال بسبب عائق الفراغية من البروتين. وهذا من شأنه منع تشكيل كومة (الشكل 1B). نتيجتين يمكن استخلاصها. أولا، منع التراص يعني أن البروتين من الفائدة وبد أن الغشاء. ثانيا، مجمع البروتين ND يمكن علاجها مع أساليب المعالجة جسيم واحد القياسية 24 و 40 للحصول على التشكل الخام من المجمع. وعلاوة على ذلك، يحلل بأساليب مثل عدم تغيير طبيعة هلام الكهربائي أو ديناميكية تشتت الضوء لا يمكن أن يؤديها.

لإثبات هذه الفرضية، استخدمنا ملزم غشاء البروتين 5 أكسيجيناز شحمية (5LO)، التي تشارك في العديد من الأمراض الالتهابية 41، 42. يتطلب هذا البروتين 78 كيلو دالتون أيونات الكالسيوم إلى ربط الغشاء 43. على الرغم من هذا الارتباط غشاء وقد درس على نطاق واسع باستخدام الجسيمات الشحميةالصورة = "XREF"> 44، 45، 46 و كسور غشاء 47، وهذه لا يمكن استخدامها لتحليل تيم وتقرير الهيكل.

إعداد nanodiscs يبدأ عن طريق خلط MSP مع الدهون معلق في كوليت المنظفات الصوديوم. بعد مرور فترة الحضانة على الجليد لمدة 1 ساعة، وإزالة المنظفات ببطء من خليط إعادة استخدام الراتنج مكثف. في كثير من الأحيان يتم إجراء هذا النوع من المواد من البوليسترين شكل إلى حبات صغيرة. هم مسعور نسبيا ولها تفضيل قوي لالمنظفات ملزمة مقارنة مع الدهون 48. بعد إزالة حبات مسعور وأداء توضيح باستخدام الطرد المركزي، وتنقية nanodiscs بواسطة اللوني حجم الاستبعاد (SEC). يتم خلط nanodiscs تنقيته مع بروتين monotopic غشاء (والعوامل المساعدة الممكنة) في نسبة متساوي المولية (أو عدة نسب لالمعايرة) ويترك إلى react (15 دقيقة). ويتم تحليلها من قبل تيم من خلال تطبيق ميكرولتر كميات من العينة على وشبكات الكربون المغلفة يتوهج تفريغها ومن ثم عن طريق أداء تلطيخ السلبية مع نابت. نفس العينة من عندما طبقت قسامات إلى شبكات تيم يمكن استخدامها لتحليل من قبل غير تغيير طبيعة أو SDS PAGE هلام الكهربائي، فضلا عن أنواع مختلفة من قياسات النشاط، دون أي تغييرات جوهرية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد Nanodiscs

  1. التعبير وتنقية البروتين الغشاء السقالات 8، 35
    1. تعبير عن MSP1E3D1 صاحب الموسومة في كولاي BL21 (DE3) T1R pRARE2 السلالة في قوارير. إعداد ثقافة 50 مل بداية ليلة وضحاها مع متوسط ​​LB تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل الكانامايسين عند 37 درجة مئوية. تمييع الثقافة بداية ليلة وضحاها في 2 لتر من مرق المتوسطة رائع تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل الكانامايسين.
    2. تنمو الخلايا عند 37 درجة مئوية حتى الكثافة البصرية في 600 نانومتر (OD 600) يبلغ حوالي 3. الحث على التعبير البروتين مع 0.5 ملي الآيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) لمدة 3 ساعات في 18 درجة مئوية.
    3. إعداد العازلة تحلل (100 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0؛ 100 مم كلوريد الصوديوم، و 10٪ الجلسرين). إضافة 1 ملم TCEP مباشرة قبل الاستعمال.
    4. بعد 3 ساعات من تحريض على 18 درجة مئوية، وحصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 4500 x جو 4 درجات مئوية. تجاهل طاف، وزن الخلايا تحصد، وإعادة تعليق عليها في تحلل العازلة على نسبة 2 مل من تحلل العازلة في غرام من الخلايا.
    5. ليز الخلايا عن طريق صوتنة نابض (معدل التكرار: 4 ق ON، 4 ثانية OFF) لمدة 3 دقائق في 80٪ السعة.
    6. الطرد المركزي لست] لمدة 20 دقيقة في 49000 x ج و 4 درجات مئوية. تجاهل بيليه من هذا الطرد المركزي.
    7. حقن طاف في 5 مل ني + عمود مخلبية متصلة النظام اللوني السائل الآلي أبقى يفضل عند 4 درجات مئوية.
    8. قبل الخطوة شطف (الخطوة 1.1.9)، وغسل العمود مع مخازن 1-3 أدناه لإزالة جميع البروتينات باستثناء صاحب الموسومة-MSP. رصد محتوى البروتين في 280 نانومتر لمتابعة عملية تنقية. تسجيل الأشعة فوق البنفسجية في 280 نانومتر يجب أن تعود إلى خط الأساس بعد كل غسل.
      1. يغسل غسل العازلة 1: 40 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، و 300 ملي مول كلوريد الصوديوم، ايميدازول 10 ملم، و 1٪ تريتون، ودرجة الحموضة 8.0.
      2. يغسل غسل العازلة 2: 40 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، و 300 مليكلوريد الصوديوم، و 20 ملي ايميدازول، و 50 ملي كوليت الصوديوم، ودرجة الحموضة 8.0.
      3. يغسل مع العازلة غسل 3: 40 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، و 300 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 50 ملي إيميدازول، ودرجة الحموضة 8.0.
    9. أزل MSP مع 40 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، و 300 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 500 ملي ايميدازول، ودرجة الحموضة 8.0.
    10. تغيير عازلة لحركة مجتمع السلم عازلة معيار (20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5؛ 100 مم كلوريد الصوديوم، و 0.5 ملي EDTA) من هلام الترشيح 8، 35؛ يجب أن يكون العائد لكل دفعة نحو 7 ملغم لتر -1.
  2. إعداد محلول المخزون فوسفورية
    1. إضافة 305 ميكرولتر من 1 بالميتويل-2-oleoyl- التعطيل -glycero-3-phosphocholine (POPC) الذائب في الكلوروفورم بتركيز 25 ملغ / مل إلى الدورق الزجاجي وتتبخر الكلوروفورم قبل تطهيره مع تيار لطيف من النيتروجين . تجف ليلة وضحاها الدهون في مجفف فراغ. ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة لإزالة المذيب من الدهون، مما يترك طبقة رقيقة من الدهون في الجزء السفلي من كوب زجاجي.
    2. Resuspend وكعكة الدهون في 200 ميكرولتر من العازلة القياسية MSP تحتوي على 100 ملي كوليت الصوديوم قبل vortexing الأنبوب حتى يصبح الحل شفافة. هذا سيوفر الحل مع تركيز POPC من 50 ملم.
      ملاحظة: بشكل عام، يجب أن تكون نسبة المولي من الدهون إلى المنظفات في هذه المرحلة 1: 2 (الدهون: المنظفات) 8. هذا المزيج الدهون المنظفات يمكن تخزينها في -80 درجة مئوية لمدة ما يقرب من 2 أشهر.
  3. إعداد حبات مسعور لإزالة المنظفات
    1. ضع 5 غرام من حبات (الوزن الجاف) في أنبوب 50 مل.
    2. تغسل حبات مع 30 مل من الميثانول بنسبة 100٪ وبعد ذلك مع 40 مل من الماء عالى النقاء.
    3. تغسل حبات مع 10 مل من MSP عازلة القياسية. وأخيرا، تخزين حبات مع 15 مل من العازلة مستوى MSP في 4 درجات مئوية.
  4. Nanodisc إعادة
    1. الاستغناء عن 190 ميكرولتر من MSP1E3D1 (0.124 ملم) في أنبوب microfuge وإضافة 61.5 ميكرولتر من محلول المخزون فوسفورية (50 ملي فOPC) إلى نفس الأنبوب. احتضان الخليط إعادة على الجليد الرطب لمدة 1 ساعة. ملاحظة: هذا يساوي نسبة المولي 1: 130 (MSP1E3D1: POPC).
    2. إضافة حبات مسعور عند تركيز 0.5 غرام من حبات لكل مليلتر من خليط إعادة لبدء عملية التجميع الذاتي. احتضان في حاضنة دوارة لمدة 16 ساعة عند 4 درجات مئوية.
    3. بعد الحضانة، الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 13000 x ج و 4 درجات مئوية لإزالة الرواسب والركام. تجاهل بيليه وحفظ طاف.
    4. تتوازن العمود حجم الإقصاء اللوني (التي شنت على نظام اللوني السائل الآلي) مع العازلة MSP مستوى حتى الامتصاصية في 280 نانومتر مستقرة. حقن طاف في العمود وجمع الكسور الذروة.
    5. قياس تركيزات nanodiscs في الكسور الذروة عند 280 نانومتر. استخدام معامل الانقراض المولي من MSP1E3D1 (ε = 29910 سم -1 م -1) لحساب تركيز nanodisc. لاحظ الويمكن قياس عدد من الدهون في nanodisc من خلال مزيج من الدهون رديولبلد وتحليل فوسفات 4 أو عن طريق تحليل الفوسفات وحدها.

2. إعداد البروتين Monotopic 5 أكسيجيناز شحمية 35

  1. إعداد الثقافة بداية ليلة وضحاها. تكملة 50 مل من المتوسط ​​LB مع 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين. تطعيم المتوسطة مع كولاي BL21 (DE3) التي تحتوي على البلازميد من الجين 5-أكسيجيناز شحمية (ALOX5). تمييع الثقافة بداية ليلة وضحاها في المتوسط التعبير التي تحتوي على 42 ملي نا 2 هبو 4، 24 ملم KH 2 PO 4، 9 مم كلوريد الصوديوم، و 19 ملي NH 4 CL، 1 ملي MgSO 4، 0.1 ملي CaCl 2، 0.2٪ D-الجلوكوز، 0.1 ٪ و 5 ميكرومتر FeSO 4، و 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين. تنمو الخلايا حتى OD 600 غير ~ 0.5 عند 25 درجة مئوية. حمل تعبير البروتين مع 0.2 ملي IPTG لمدة 16 ساعة عند 20 درجة مئوية (35).
  2. الحصاد بواسطة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 7000 x ج و 4 درجات مئوية، وتجاهل طاف. وزن بيليه وجدت في الجزء السفلي من الأنبوب الذي يحتوي على خلايا المقطوع و resuspend الخلايا التي تحصد في تحلل العازلة (100 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0؛ 100 مم كلوريد الصوديوم، و 10٪ الجلسرين، و 1 ملي TCEP) التي تحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني و 0.5 ملغ / مل 35 الليزوزيم في نسبة 2 مل من تحلل العازلة في غرام من الخلايا.
  3. ليز الخلايا عن طريق صوتنة ل5 × 15 ثانية في 80٪ السعة. إزالة الحطام الخلية بواسطة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 7000 x ج و 4 درجات مئوية. أداء الأمونيوم كبريتات هطول الأمطار إلى 30 - 60٪ التشبع لترسيب البروتينات في حل 35. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 16000 x ج و 4 درجات مئوية. ملاحظة: بيليه 5LO يمكن تجميد بسرعة وتخزينها في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
  4. Resuspend وبيليه مع 20 مل من تحلل العازلة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 40000 x ج و 4 درجات مئوية.
  5. احتضان طاف على عمود الاغاروز اعبي التنس المحترفين في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. غسل العمود مرة واحدة مع العمود حجم واحد من تحلل العازلة التي تحتوي على 0.5 M كلوريد الصوديوم. أزل 5LO مع 20 ملي اعبي التنس المحترفين في تحلل العازلة التي تحتوي على 10 ميكرومتر FeSO 4 و 20 ميكروغرام / مل الكاتلاز. أداء هلام الترشيح اللوني لإزالة ATP 35.
    ملاحظة: إن 5LO غير مستقرة، وينبغي استخدامها على الفور بعد تنقيتها. خلاف ذلك، فمن المستحسن أن وقف في خطوة لهطول الأمطار كبريتات الأمونيوم (راجع الملاحظة بعد الخطوة 2.1.3).

3. إعداد مجمع Nanodisc البروتين

  1. إعداد إجمالي حجم 100 ميكرولتر من المجمع. خلط 0.8 ميكرومتر ND و 0.8 ميكرومتر 5LO مع الحاضر ملي كا 2+ 1 في المخزن المؤقت القياسية MSP (20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5؛ 100 مم كلوريد الصوديوم، 0.5 ملي EDTA، و 1.5 ملي CaCl 2)، واحتضان لمدة 10 دقيقة على الجليد. ملاحظة: يمكن تخزين عينة لمدة تصل إلى شهر واحد في 4 درجات مئوية (35).
ove_title "> 4. تحليل العينات

  1. هلام الكهربائي
    1. غير تغيير طبيعة-الكهربائي
      1. مزيج 15 ميكرولتر من العينة مع 5 ميكرولتر من العازلة تحميل (50 ملي BisTris، 6 N حمض الهيدروكلوريك، 50 مم كلوريد الصوديوم، و 10٪ (ث / ت) الجلسرين، و 0.001٪ الشقائقية S، ودرجة الحموضة 7.2) 49 وتحميله على 4 - 16٪ مكرر تريس هلام لأداء الكهربائي.
      2. ملء خزان الكاثود مع العازلة ضوء الكاثود (50 ملي مكرر تريس و 50 ملي Tricine، ودرجة الحموضة 6.8، و 0.002٪ Coomassie G-250) وخزان الأنود مع العازلة تشغيل (50 ملي مكرر تريس و 50 ملي Tricine، ودرجة الحموضة 6.8). بدء الفصل باستخدام التيار الكهربائي المستمر في 150 V.
      3. وقف الفصل الكهربي عندما تصل الجبهة Coomassie نهاية هلام.
      4. وصمة عار الجل مع معيار بروتوكول الأزرق Coomassie.
    2. تغيير طبيعة الكهربائي
      1. مزيج 40 ميكرولتر من العينة مع 10 ميكرولتر من العازلة تحميل تحتوي على SDS (0.05٪ (ث / ت) برموفينول الأزرق؛ 0.2 M تريس، حمض الهيدروكلوريك،الرقم الهيدروجيني 6.8. 20٪ (ت / ت) الجلسرين. 10٪ (ث / ت) SDS. و10 ملم 2-المركابتويثانول) وتحميله على 4-20٪ تريس هلام الجلايسين لأداء الكهربائي.
      2. ملء الكاثود والأنود الدبابات مع العازلة تشغيل (25 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 6.8 و 200 ملي الجلايسين، و 0.1٪ (ث / ت) SDS). بدء الفصل باستخدام التيار الكهربائي المستمر في 150 V.
      3. وقف الفصل الكهربي عندما تصل الجبهة صبغ تحميل نهاية هلام.
      4. وصمة عار الجل مع معيار بروتوكول الأزرق Coomassie.
  2. إعداد الحل نابت
    1. حل 1 غرام من الملح فسفوتنغستات الصوديوم في 50 مل من الماء عن طريق التحريض في درجة حرارة الغرفة لتعطي 2٪ (ث / ت) المحاليل الحمضية.
    2. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع 1 M هيدروكسيد الصوديوم. إزالة الجسيمات باستخدام فلتر حقنة 0.22 ميكرون. تخزين الحل في درجة حرارة الغرفة أو في 4 درجات مئوية.
  3. إعداد عينة للتحليل تيم
    1. توهج التفريغ شبكات النحاس المطلي الكربون (400 شبكة) لمدة 20 ق في 30 مللي أمبير لتقديم شبكات ماء قبل الامتزاز من العينة. ضع 3.5 ميكرولتر من العينة (0.8 ميكرومتر فيما يتعلق nanodiscs) على الشبكة، واحتضان لمدة 30 ثانية. ملاحظة: حجم تطبيقها قد تختلف بين 2.5 و 5 ميكرولتر، اعتمادا على تركيز العينة. مجموعة تركيز مناسب لnanodiscs هو 0،5-1 ميكرومتر.
    2. وصمة عار من فائض الحل باستخدام ورق الترشيح.
    3. وصمة عار على الفور الشبكة مع انخفاض بنسبة 2٪ نابت لمدة 30 ثانية. وصمة عار قبالة حل الزائدة وترك الشبكة على الهواء الجاف.
    4. تقييم الشبكات التي كتبها تيم. المجهر مع 120-200 كيلو يتسارع الجهد يكفي لتقدير مدى التراص. ملاحظة: للحصول على هذا البروتوكول، تم استخدام معايرة انتقال المجهر الالكتروني، ومجهزة على بعد 200 كيلو بندقية انبعاث المجال.
    5. تسجيل صور تيم. للصور تظهر مداخن طويلة، لا عملية أخرى. الصور تظهر مجمع nanodiscs، مع بروتين خارجي التي قد تحتوي على عدد قليلأكوام قصيرة، ولكن معظم الجسيمات في المجمع. سجل العديد من الصور والعملية هذه وفقا للطرق القياسية للحصول على الدرجة المتوسطات ومنخفضة الدقة، 3 نموذج الأبعاد للمجمع.
      ملاحظة: للحصول على جمع البيانات وصمة عار السلبية، أدلى الشبكات على الأقل في ثلاث أيام مختلفة. كل يوم، أدلى حضانات عينة جديدة (كما في الخطوة 3.1) قبل تطبيق وصمة عار السلبية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

طريقة نقترح يعتمد على إعداد nanodiscs لتوفير سطح الغشاء لmonotopic ملزمة غشاء من البروتين. حيث لا يوجد بروتين الغشاء جزءا لا يتجزأ في طبقة ثنائية nanodisc الدهون، وهنا يرمز لnanodiscs باسم "nanodiscs فارغة" (الشكل 2A). هذه لها حساب الوزن الجزيئي 256 كيلو دالتون لتكوين اثنين من البروتينات MSP1E3D1 السقالات ونحو 260 من جزيئات POPC 8. باستخدام هذا البروتين: نسبة الدهون لإعادة، ذروة رئيسية واحدة (الشكل 2...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن فصل طريقة إلى ثلاثة أجزاء: إعادة تشكيل nanodiscs فارغة، وإعداد المجمعات البروتين nanodisc، وتلطيخ السلبية للتيم من هذه المجمعات. وسيتم تناول كل جزء بشكل منفصل بشأن القيود المفروضة على هذه التقنية، والخطوات الحاسمة، وتعديلات مفيدة.

إعادة تشكيل nanodiscs فارغة. الخطوات والحدود الحرجة في إنتاج واستخدام nanodiscs.

لإعداد nanodiscs فارغة، لا بد من ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفان بالشكر إلى مجلس السويدية بحوث، مجلس مقاطعة ستوكهولم، وصناديق KI لدعمهم. تم إجراء التعبير وتنقية MSP في معهد كارولينسكا / SciLifeLab البروتين مرفق العلوم الأساسية (http://PSF.ki.se). فإن الكتاب أود أيضا أن أشكر الدكتور باسي Purhonen والدكتور ماتيلدا سوبيرغ لتبادل الخبرات الفنية ولما قدموه من مساعدة في الوقت المناسب.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
مجهر إلكتروني الإرسال: JEOL2100FJEOL
CCDنظام معالجة الفيديو والتصوير Tiez GmbH ، ألمانيا
مفرغ التوهجشبكة Baltec
TEM: 400 شبكةTAABGM016 / C
حجم اللونيات الاستبعاد: Agilent SEC-5Agilent Technologies5190-2526
Superdex 200 HR 10/300GE علوم الحياة للرعاية الصحية17-5172-01
البلازميد: MSP1E3D1Addgene20066
البكتيريا: BL21DE3NEBC2527H
البكتيريا: BL21 (DE3) T1R pRARE2مرفق علوم البروتين ، كنتاكي ، مصفوفة تنقية Solna
: ATP agaroseSigma AldrichA2767
مصفوفة التنقية: HisTrap HP-5 ملGE Healthcare Life Sciences17-5247-01
الدهون: POPCAvanti Polar Lipids850457C25 مجم / مل في الكلوروفورم
حبات مسعورة: Bio-Beads ، SM-2 ResinBio-Rad1523920
مرشح حقنة 13 مم: 0.2 & mu ؛ mPall Life SciencesPN 4554T
وصمة عار: فوسفوتنجستات الصوديوم ثلاثي القاعدة هيدراتسيجما ألدريتش31648
2-mercaptoethanolSigma AldrichM3148-250ML
كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS)Bio-Rad161-0301
كوكتيل مثبط البروتيازSigma Aldrich4693132001
TCEPمنظف646547
: هيدرات كولات الصوديومسيجما ألدريتشC6445-10G
كولات500 ملي مولار كولات الصوديوم. يعلق في ماء ميلي كيو ويخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
مخزون50 ملي مولار POPC ، 100 ملي كولات الصوديوم ، 20 ملي Tris-HCl درجة الحموضة 7.5 ، 100 ملي كلوريد الصوديوم يخزن في 4 درجات ؛ ج لمدة أسبوع. أو
متجر -80 درجة ؛ ج لمدة شهر ، بعد تطهير المحلول بالنيتروجين.
قياسي MSP20 ملي Tris-HCl ، درجة الحموضة 7.5 ، 100 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.5 ملي EDTA.
يخزن في درجة حرارة 4
الرحلان الكهربائي غير القابل للإزالة الأنود العازلةالحرارية فيشر ScientificBN200150 ملي متر Bis-Tris ، 50 ملي متر تريسين ، درجة الحموضة 6.8
الكهربائي غير المدهش الكاثود العازلةالحرارية فيشر العلميBN200250 ملي مبل بيس تريس ، 50 ملي متر تريسين ، درجة الحموضة 6.8 ، 0.002٪ Coomassie G-250
الرحلان الكهربائي غير المنشط 4x تحميل العينة العازلةالحرارية فيشر العلميةBN200350 ملي مولار بيس تريس ، درجة الحموضة 7.2 ، 6 نيوتن حمض الهيدروكلوريك ، 50 ملي كلوريد الصوديوم ، 10٪ (وزن / حجم) جلسرين ، 0.001٪ بونسو إس
Denaturaing الرحلان الكهربائي الجري الوصفةالداخلية: 25 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك ، درجة الحموضة 6.8 ، 200 ملي جليسين ، 0.1٪ (وزن / حجم) SDS
Denaturaing Electrophorese 5x تحميل العينة المخزن المؤقتوصفة داخلية: 0.05٪ (وزن / حجم) بروموفينول بلو ، 0.2 م تريس حمض الهيدروكلوريك ، درجة الحموضة 6.8 ، 20٪ (حجم / حجم) جلسرين ، 10٪ (وزن / حجم) SDS ، 10 ملي مولار 2-ميركابتو إيثانول
مرقالتربتون - 12.0 جم ، مستخلص الخميرة - 24.0 جم ، 100 مل 0.17 م KH 2< / sub>PO4< / sub> و 0.72 M K2< / sub>HPO4< / sub> ، تم تحضير الجلسرين - 4 مل
التربتون ومستخلص الخميرة والجلسرين إلى 900 مل وتم تعقيمها بشكل منفصل. تم إعداد KH2PO4 و K2HPO4 وتعقيمها بشكل منفصل. تم خلط كلاهما قبل استخدام الوسيط.
كاميرا سيجما ألدريتش الصوديوم الدهون مخزن مؤقت درجات مئوية. الرحلان رائع

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kleinschmidt, J. H., Popot, J. L. Folding and stability of integral membrane proteins in amphipols. Arch Biochem Biophys. 564, 327-343 (2014).
  2. Frauenfeld, J., et al. A saposin-lipoprotein nanoparticle system for membrane proteins. Nat Methods. 13 (4), 345-351 (2016).
  3. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins. Nat Struct Mol Biol. 23 (6), 481-486 (2016).
  4. Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Self-Assembly of Discoidal Phospholipid Bilayer Nanoparticles with Membrane Scaffold Proteins. Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).
  5. Jonas, A., Steinmetz, A., Churgay, L. The number of amphipathic alpha-helical segments of apolipoproteins A-I, E, and A-IV determines the size and functional properties of their reconstituted lipoprotein particles. J Biol Chem. 268 (3), 1596-1602 (1993).
  6. Grinkova, Y. V., Denisov, I. G., Sligar, S. G. Engineering extended membrane scaffold proteins for self-assembly of soluble nanoscale lipid bilayers. Protein Eng Des Sel. 23 (11), 843-848 (2010).
  7. Hagn, F., Etzkorn, M., Raschle, T., Wagner, G. Optimized phospholipid bilayer nanodiscs facilitate high-resolution structure determination of membrane proteins. J Am Chem Soc. 135 (5), 1919-1925 (2013).
  8. Ritchie, T. K., et al. Methods in Enzymology. Duzgunes, N. ejat 464, Academic Press. 211-231 (2009).
  9. Schuler, M. A., Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs as a new tool to examine lipid-protein interactions. Methods Mol Biol. 974, 415-433 (2013).
  10. Nasr, M. L., et al. Membrane phospholipid bilayer as a determinant of monoacylglycerol lipase kinetic profile and conformational repertoire. Protein Sci. 22 (6), 774-787 (2013).
  11. Yokogawa, M., et al. NMR analyses of the interaction between the FYVE domain of early endosome antigen 1 (EEA1) and phosphoinositide embedded in a lipid bilayer. J Biol Chem. 287 (42), 34936-34945 (2012).
  12. Wan, C., et al. Insights into the molecular recognition of the granuphilin C2A domain with PI(4,5)P2. Chem Phys Lipids. 186, 61-67 (2015).
  13. Zhang, P., et al. An Isoform-Specific Myristylation Switch Targets Type II PKA Holoenzymes to Membranes. Structure. 23 (9), 1563-1572 (2015).
  14. Grushin, K., Miller, J., Dalm, D., Stoilova-McPhie, S. Factor VIII organisation on nanodiscs with different lipid composition. Thromb Haemost. 113 (4), 741-749 (2015).
  15. Baylon, J. L., Lenov, I. L., Sligar, S. G., Tajkhorshid, E. Characterizing the membrane-bound state of cytochrome P450 3A4: structure, depth of insertion, and orientation. J Am Chem Soc. 135 (23), 8542-8551 (2013).
  16. Mazhab-Jafari, M. T., et al. Oncogenic and RASopathy-associated K-RAS mutations relieve membrane-dependent occlusion of the effector-binding site. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (21), 6625-6630 (2015).
  17. Mazhab-Jafari, M. T., et al. Membrane-dependent modulation of the mTOR activator Rheb: NMR observations of a GTPase tethered to a lipid-bilayer nanodisc. J Am Chem Soc. 135 (9), 3367-3370 (2013).
  18. Wang, L., Sigworth, F. J. Structure of the BK potassium channel in a lipid membrane from electron cryomicroscopy. Nature. 461 (7261), 292-295 (2009).
  19. Ackerson, C. J., Powell, R. D., Hainfeld, J. F. Site-specific biomolecule labeling with gold clusters. Methods Enzymol. 481, 195-230 (2010).
  20. Boldog, T., Grimme, S., Li, M., Sligar, S. G., Hazelbauer, G. L. Nanodiscs separate chemoreceptor oligomeric states and reveal their signaling properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (31), 11509-11514 (2006).
  21. Moraes, I., Evans, G., Sanchez-Weatherby, J., Newstead, S., Stewart, P. D. Membrane protein structure determination - the next generation. Biochim Biophys Acta. 1838 (1 Pt A), 78-87 (2014).
  22. Dias, D. M., Ciulli, A. NMR approaches in structure-based lead discovery: recent developments and new frontiers for targeting multi-protein complexes. Prog Biophys Mol Biol. 116 (2-3), 101-112 (2014).
  23. Viegas, A., Viennet, T., Etzkorn, M. The power, pitfalls and potential of the nanodisc system for NMR-based studies. Biol Chem. , (2016).
  24. Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A primer to single-particle cryo-electron microscopy. Cell. 161 (3), 438-449 (2015).
  25. Wu, S., Armache, J. P., Cheng, Y. Single-particle cryo-EM data acquisition by using direct electron detection camera. Microscopy (Oxf). 65 (1), 35-41 (2016).
  26. Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
  27. De Carlo, S., Adrian, M., Kalin, P., Mayer, J. M., Dubochet, J. Unexpected property of trehalose as observed by cryo-electron microscopy. J Microsc. 196 (1), 40-45 (1999).
  28. Nogales, E. The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique. Nat Methods. 13 (1), 24-27 (2016).
  29. Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol Proced Online. 6, 23-34 (2004).
  30. Forte, T. M., Nordhausen, R. W. Electron microscopy of negatively stained lipoproteins. Methods Enzymol. 128, 442-457 (1986).
  31. Zhao, F. Q., Craig, R. Capturing time-resolved changes in molecular structure by negative staining. J Struct Biol. 141 (1), 43-52 (2003).
  32. Zhang, L., et al. Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy. J Lipid Res. 52 (1), 175-184 (2011).
  33. Zhang, L., et al. An optimized negative-staining protocol of electron microscopy for apoE4 POPC lipoprotein. J Lipid Res. 51 (5), 1228-1236 (2010).
  34. Matz, C. E., Jonas, A. Micellar complexes of human apolipoprotein A-I with phosphatidylcholines and cholesterol prepared from cholate-lipid dispersions. J Biol Chem. 257 (8), 4535-4540 (1982).
  35. Kumar, R. B., et al. Structural and Functional Analysis of Calcium Ion Mediated Binding of 5-Lipoxygenase to Nanodiscs. PLoS One. 11 (3), e0152116(2016).
  36. Waggoner, T. A., Last, J. A., Kotula, P. G., Sasaki, D. Y. Self-assembled columns of stacked lipid bilayers mediated by metal ion recognition. J Am Chem Soc. 123 (3), 496-497 (2001).
  37. Kovacs, E., et al. Analysis of the Role of the C-Terminal Tail in the Regulation of the Epidermal Growth Factor Receptor. Mol Cell Biol. 35 (17), 3083-3102 (2015).
  38. Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy. J Vis Exp. (90), e51087(2014).
  39. Zhang, L., Tong, H., Garewal, M., Ren, G. Optimized negative-staining electron microscopy for lipoprotein studies. Biochim Biophys Acta. 1830 (1), 2150-2159 (2013).
  40. Cong, Y., Ludtke, S. J. Single particle analysis at high resolution. Methods Enzymol. 482, 211-235 (2010).
  41. Radmark, O., Werz, O., Steinhilber, D., Samuelsson, B. 5-Lipoxygenase, a key enzyme for leukotriene biosynthesis in health and disease. Biochim Biophys Acta. 1851 (4), 331-339 (2015).
  42. Anwar, Y., Sabir, J. S., Qureshi, M. I., Saini, K. S. 5-lipoxygenase: a promising drug target against inflammatory diseases-biochemical and pharmacological regulation. Curr Drug Targets. 15 (4), 410-422 (2014).
  43. Radmark, O., Samuelsson, B. Regulation of the activity of 5-lipoxygenase, a key enzyme in leukotriene biosynthesis. Biochem Biophys Res Commun. 396 (1), 105-110 (2010).
  44. Noguchi, M., Miyano, M., Matsumoto, T., Noma, M. Human 5-lipoxygenase associates with phosphatidylcholine liposomes and modulates LTA4 synthetase activity. Biochim Biophys Acta. 1215 (3), 300-306 (1994).
  45. Pande, A. H., Qin, S., Tatulian, S. A. Membrane fluidity is a key modulator of membrane binding, insertion, and activity of 5-lipoxygenase. Biophys J. 88 (6), 4084-4094 (2005).
  46. Pande, A. H., et al. Modulation of human 5-lipoxygenase activity by membrane lipids. Biochemistry. 43 (46), 14653-14666 (2004).
  47. Wong, A., Hwang, S. M., Cook, M. N., Hogaboom, G. K., Crooke, S. T. Interactions of 5-lipoxygenase with membranes: studies on the association of soluble enzyme with membranes and alterations in enzyme activity. Biochemistry. 27 (18), 6763-6769 (1988).
  48. Rigaud, J. L., Levy, D., Mosser, G., Lambert, O. Detergent removal by non-polar polystyrene beads. European Biophysics Journal. 27 (4), 305-319 (1998).
  49. Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
  50. Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy. J Vis Exp. (90), e51087(2014).
  51. Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size. J Am Chem Soc. 126 (11), 3477-3487 (2004).
  52. Hornschemeyer, P., Liss, V., Heermann, R., Jung, K., Hunke, S. Interaction Analysis of a Two-Component System Using Nanodiscs. PLoS One. 11 (2), 0149187(2016).
  53. Degrip, W. J., Vanoostrum, J., Bovee-Geurts, P. H. Selective detergent-extraction from mixed detergent/lipid/protein micelles, using cyclodextrin inclusion compounds: a novel generic approach for the preparation of proteoliposomes. Biochem J. 330 (Pt 2), 667-674 (1998).
  54. Martin, D. D., Budamagunta, M. S., Ryan, R. O., Voss, J. C., Oda, M. N. Apolipoprotein A-I assumes a "looped belt" conformation on reconstituted high density lipoprotein. J Biol Chem. 281 (29), 20418-20426 (2006).
  55. Cerione, R. A., Ross, E. M. Reconstitution of receptors and G proteins in phospholipid vesicles. Methods Enzymol. 195, 329-342 (1991).
  56. Shaw, A. W., McLean, M. A., Sligar, S. G. Phospholipid phase transitions in homogeneous nanometer scale bilayer discs. FEBS Lett. 556 (1-3), 260-264 (2004).
  57. Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. Membrane lipids: where they are and how they behave. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (2), 112-124 (2008).
  58. Civjan, N. R., Bayburt, T. H., Schuler, M. A., Sligar, S. G. Direct solubilization of heterologously expressed membrane proteins by incorporation into nanoscale lipid bilayers. Biotechniques. 35 (3), 553-562 (2003).
  59. Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. A step-by-step method for the reconstitution of an ABC transporter into nanodisc lipid particles. J Vis Exp. (66), e3910(2012).
  60. Brooks, S. P., Storey, K. B. Bound and determined: a computer program for making buffers of defined ion concentrations. Anal Biochem. 201 (1), 119-126 (1992).
  61. Gilbert, N. C., et al. The structure of human 5-lipoxygenase. Science. 331 (6014), 217-219 (2011).
  62. Radmark, O. 5-lipoxygenase-derived leukotrienes: mediators also of atherosclerotic inflammation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (7), 1140-1142 (2003).
  63. Gao, Y., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action. Nature. 534 (7607), 347-351 (2016).
  64. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Self-assembly of single integral membrane proteins into soluble nanoscale phospholipid bilayers. Protein Sci. 12 (11), 2476-2481 (2003).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Transmission Electron MicroscopyNanodisc PreparationMembrane Protein BindingNegative Stain TEMSize Exclusion ChromatographyNon denaturing Gel ElectrophoresisPhosphotungstate StainingMonotopic Protein AnalysisNanodisc StackingProtein Nanodisc Complex

Related Articles