يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

توليف 1،2-Azaborines وإعداد مجمعات البروتين مع T4 الليزوزيم المسوخ

7.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/55154

⸱

مارس 25, 2017

 , 
1Department of Chemistry, Boston College

في هذه المقالة

ملخص

< p class = 'jove_content'> يتم تقديم بروتوكول لتخليق 1،2-azaborines وإعداد مجمعات البروتين الخاصة بهم مع طفرات الليزوزيم T4.

الملخص

نصف توليفا عاما ل 1،2-azaborines باستخدام تقنيات قياسية خالية من الهواء وتحضير مركب البروتين مع طفرات الليزوزيم T4 عن طريق انتشار البخار. يتم تحضير المركبات الحساسة للأكسجين والرطوبة وعزلها تحت جو خامل (N2) باستخدام مشعب غاز مفرغ أو صندوق قفازات. كمثال على تخليق الآزابورين ، نوضح تخليق وتنقية N-H-B-ethyl-1،2-azaborine المتطاير من خلال تسلسل من خمس خطوات يتضمن التقطير وكروماتوغرافيا العمود لعزل المنتجات. يتم التعبير عن طفرات الليزوزيم T4 L99A و L99A / M102Q بسلالة الإشريكية القولونية RR1. توفر البروتوكولات القياسية لتحلل الخلايا الكيميائية متبوعا بالتنقية باستخدام عمود التبادل الأيوني للكربوكسي ميثيل بروتينا عالي النقاء بدرجة كافية للتبلور. يتم إجراء تبلور البروتين بتركيزات مختلفة من الترسيب في نطاقات مختلفة من الأس الهيدروجيني باستخدام طريقة انتشار بخار القطرة المعلقة. يتم التحضير المعقد مع الجزيئات الصغيرة بطريقة نشر البخار تحت جو خامل. يوفر تحليل حيود الأشعة السينية للمركب البلوري دليلا هيكليا لا لبس فيه على تفاعلات الربط بين موقع ربط البروتين و 1،2-azaborines.

المقدمة

وضعت البورون النيتروجين التي تحتوي على حلقات غير متجانسة (أي 1،2-azaborines) في الآونة الأخيرة اهتماما كبيرا كما isosteres من أرينية. هذا isosterism يمكن أن يؤدي إلى تنويع الأشكال الهيكلية القائمة لتوسيع مساحة الكيميائية 2، 3، 4. Azaborines لها فائدة محتملة لتطبيقها في البحوث الطبية الحيوية 5، 6، 7، 8، خصوصا في مجال الكيمياء الطبية التي الكيميائيين إجراء توليف مكتبات هيكليا والجزيئات ذات الصلة وظيفيا. إلى حد كبير، ومع ذلك، في حين أن هناك العديد من طرق اصطناعية متطورة إلى الجزيئات التي تحتوي على دآرين المتاحة، تم الإبلاغ سوى عدد محدود من الطرق لتركيب azaborines 9، 10، 11، 12، 13. ويرجع ذلك أساسا إلى عدد محدود من الخيارات لمصدر البورون والجوي وطبيعة رطوبة الحساسة من جزيء في مرحلة مبكرة من تسلسل الاصطناعية.

في الجزء الأول من هذه المقالة، فإننا سوف تصف توليفة نطاق متعدد غرام من N -TBS- ب -Cl-1،2-azaborine (3) باستخدام تقنيات خالية من الهواء القياسية. يخدم هذا المركب كمادة وسيطة تنوعا التي يمكن زيادة functionalized لهيكليا أكثر تعقيدا الجزيئات 14 و 15. بدءا من 3، وسيتم وصف التوليف وتنقية N -H- ب -ethyl-1،2-azaborine (5) لاستخدامها في دراسات ملزمة البروتين. نظرا لتقلب 5، عزلتها فعالة تتطلب مراقبة دقيقة من درجة حرارة التفاعل، والوقت، وشعبة نظماستنتاج الظروف.

في الجزء الثاني، وبروتوكولات للتعبير البروتين وعزل المسوخ T4 الليزوزيم (L99A وL99A / M102Q) 17، 18، 19، وستقدم 20، تليها بلورة البروتين وإعداد المجمعات الكريستال البروتين يجند. وقد تم اختيار المسوخ T4 الليزوزيم L99A وL99A / M102Q كما نظم نموذج البيولوجية لدراسة قدرة الرابطة الهيدروجينية من NH تحتوي على جزيئات azaborine 17. استخدام معيار بروتوكول البيولوجيا الجزيئية، ويتم التعبير عن هذا البروتين في سلالة كولاي RR1 والتي يسببها مع الآيزوبروبيل-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). ويتم تنقية البروتين خارج باستخدام التبادل الأيوني العمود اللوني. يتم تنفيذ البروتين تبلور مع الحل عالية التركيز النقي البروتين (> 95٪ نقاء من قبل الكهربائي للهلام) باستخدام شنقاإسقاط طريقة نشر بخار. ونظرا لحساسية بروابط هذه الدراسة إلى الأكسجين، يتم إعداد المجمعات البروتين يجند في ظل ظروف خالية من الهواء.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: تم تنفيذ جميع التلاعب الأكسجين وحساسة للرطوبة في ظل جو خامل (N 2) باستخدام تقنيات خالية من الهواء القياسية أو علبة القفازات. THF (رباعي هيدرو الفوران)، إت 2 O (إثيل الأثير)، CH 2 الكلورين 2 (ثنائي كلورو ميثان)، التولوين، والبنتان وتنقيته عن طريق تمرير من خلال عمود الألومينا محايد تحت الأرجون. وقد جفت الأسيتونتريل على CAH 2 (هيدريد الكالسيوم) ويقطر في جو من النيتروجين قبل استخدامها. كانت ساخنة المشتريات / C (البلاديوم على الكربون) في ظل فراغ عالية عند 100 درجة مئوية لمدة 12 ساعة قبل استخدامها. وقد جفت هلام السيليكا (230-400 شبكة) لمدة 12 ساعة على حرارة 180 درجة مئوية تحت فراغ عالية. تم تنفيذ اللوني فلاش مع هذا هلام السيليكا تحت جو خامل. تم شراء جميع المواد الكيميائية وغيرها من المذيبات واستخدامها كما وردت.

ملاحظة: الحذر، يرجى الرجوع إلى جميع بيانات سلامة المواد ذات الصلة (MSDS) قبل الاستخدام. العديد من المواد الكيميائية المستخدمة في تركيب لإعادة سميتها ومسببة للسرطان.

1. إعداد 1،2-Azaborines

ملاحظة: بيانات توصيف كل المركبات في هذه الدراسة تم الإبلاغ سابقا 12 و 13 و 16.

figure-protocol-1
الشكل 1: مخطط الاصطناعية من 1،2-azaborines. وتوصف بروتوكولات وإجراءات تفصيلية لتركيب كل مجمع (1-5) في قسم البروتوكول. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. إعداد N -allyl- N -TBS- B ناتج إضافة -allyl كلوريد (1)
    1. في علبة القفازات، وقياس من 6.70 غرام (50.0 ملمول) triallylboraشمال شرق 22 إلى 24/40 1 لتر دورق كروي المجفف فرن مجهز بقضيب وإضافة 250 مل ثنائي كلورو ميثان. ختم قارورة مع الحاجز المطاطي. خارج منطقة الجزاء، تبريد حل ل-78 درجة مئوية تحت جو النيتروجين على مشعب الغاز فراغ.
    2. إضافة 100 مل من 1.00 حل M البورون ثلاثي كلوريد (100 ملمول) في الهكسان إلى حل triallylborane في -78 درجة مئوية عن طريق نقل قنية. السماح للضجة خليط التفاعل في هذه الدرجة لمدة 4 ساعات.
      ملاحظة: الحذر، ثلاثي كلوريد البورون هو شديد التفاعل مع الماء.
    3. في منفصلة 100 قارورة مل، وقياس من 25.7 ز N - (ر -butyldimethylsilyl) - N -allylamine (150 ملمول) وإضافة 20.0 مل ثنائي كلورو ميثان. إلى رد فعل قارورة 1 لتر، إضافة هذا الحل عبر نقل قنية الحفاظ على درجة حرارة التفاعل في -78 درجة مئوية.
    4. إضافة 21.0 مل ثلاثي الإيثيلامين (150 ملمول) إلى رد فعل. الحفاظ على اثارة في ظل تدفق إيجابي النيتروجين والسماح لها دافئ تدريجيا إلى Roأوم درجة حرارة بين عشية وضحاها.
    5. بعد 18 ساعة من التحريك، وإزالة ما يقرب من نصف المذيب من خلال مشعب الغاز فراغ باستخدام فراغ عالية (300-500 mTorr) مع فخ النيتروجين السائل.
    6. خذ قنينة رد فعل في علبة القفازات وتصفية من الملح الأبيض شكلت في خليط التفاعل من خلال فريت المتوسطة المسامية المجفف الفرن المجهزة بمحول 24/40 فراغ و24/40 500 مل قارورة جولة القاع مع ضجة شريط. استخدام ثنائي كلورو ميثان لنقل جميع المواد المتبقية.
    7. إزالة كافة المواد المتطايرة المتبقية من الترشيح خارج منطقة الجزاء باستخدام الغاز متعددة الفراغ مع فراغ عالية.
    8. في علبة القفازات، ونقل خليط التفاعل المركزة إلى المجفف الفرن 14/20 100 مل قارورة جولة القاع مع بقضيب للتحضير للتقطير. تتويج القارورة مع الحاجز.
    9. في ظل تدفق النيتروجين، بسرعة فتح الحاجز وإضافة 200 ملغ هيدريد الكالسيوم كعامل تجفيف.
    10. إعداد جهاز التقطير عن طريق تركيب وoven-المجففة 14/20 رئيس التقطير المرفقة مع ميزان حرارة، جانب واحد مع تلقي 14/20 50 مل قارورة التخزين خالية من الهواء وعلى الجانب الآخر مع قارورة 100 مل تحتوي على الناتج الخام. تجهيز رأس التقطير بالماء البارد. (استخدام الشحوم لجميع مفاصل جهاز التقطير).
      ملاحظة: المنتج يبدأ لاستخلاص عندما تصل درجة الحرارة إلى بخار 60 درجة مئوية في 300 mTorr.
    11. الاستمرار في تجميع المنتج من خلال رفع درجة حرارة حمام الزيت حتى يقرأ الحرارة رئيس التقطير 75 درجة مئوية.
      ملاحظة: هذا المنتج هو سائل عديم اللون واضح.
    12. وقف التقطير عن طريق إزالة مصدر الحرارة وتبريد الجهاز إلى درجة حرارة الغرفة قبل التخزين. على التبريد، repressurize الجهاز مع النيتروجين وإغلاق بإحكام صمام المكونات على قارورة التخزين خالية من الهواء. تخزين المنتج معزولة في الثلاجة علبة القفازات.
      ملاحظة: العائد يمكن أن تختلف من 65٪ إلى 84٪.
  2. إعداد N -TBS- ب -Cl مغلقة حلقة المنتج (2)
    1. في علبة القفازات، وقياس من 56.0 ز N -allyl- N -TBS- ب -allyl ناتج إضافة كلوريد (1) (217 ملمول) في 24/40 1 لتر دورق كروي المجفف الفرن مع بقضيب وإضافة 500 مل التولوين.
    2. قياس من 1.79 غرام جرابز 1 شارع الجيل محفز (2.17 ملمول).
    3. إضافة محفز جزء من الحكمة أن الحل التحريك من 1 في درجة حرارة الغرفة في علبة القفازات. تطهير مربع خلال بالإضافة إلى إزالة غاز الاثيلين تشكلت من رد الفعل.
      ملاحظة: إن رد الفعل اكتمال عادة في غضون 30 دقيقة من وقف تطور الغاز. كمؤشر آخر على الانتهاء، وسوف لون رد فعل قد تغيرت تماما من الأرجواني الأولية إلى اللون البني. في هذه المرحلة، يمكن أن تكون معزولة المنتج باستخدام التقطير الفراغي. أنظر المرجع 12 للحصول على التفاصيل. في هذا البروتوكول، وصفت في وعاء واحد، إجراء خطوتين لتركيب مباشر من 3.
    4. إعداد N -TBS- ب -Cl-1،2-azaborine (3)
      1. إلى محلول التفاعل المنتج الدائري المغلقة (2) في التولوين، إضافة 14.0 غرام البلاديوم على الكربون (10٪ بالوزن المشتريات، 13.2 ملمول).
      2. إزالة قارورة من منطقة الجزاء، وأنها تناسب مع 24/40 المكثف الراجع المجفف الفرن الذي تم تطهيره مع النيتروجين ومجهزة المياه المبردة.
      3. حرارة التفاعل استعمال حمام الزيت لارتداد قوي في 135 درجة مئوية مع التحريك.
      4. بعد الحفاظ على الجزر لمدة 16 ساعة، تبريد رد فعل عن طريق إزالة قارورة من حمام الزيت. على يبرد إلى درجة حرارة الغرفة، سحب مل قسامة 0.5 من خليط التفاعل باستخدام حقنة مجهزة قفل لور إبرة فرن المجفف. نقل مل قسامة 0.5 إلى برغي أعلى أنبوب NMR لتحليل عبر 11 ب NMR 12.
        ملاحظة: تظهر ذروة المنتج المطلوب في كاليفورنيا. 35.5 جزء في المليون 12، في حين أن الأم ابتداء منيبدو الذروة الاتحاد العالمي للتعليم في كاليفورنيا. 42.9 جزء في المليون (12). عادة في هذه المرحلة 11 ب NMR يشير إلى رد فعل غير مكتمل، مع قاصر المواد انطلاق قمة المتبقية.
      5. إذا كان رد فعل غير مكتمل، وجلب قارورة التفاعل في صندوق القفازات وإضافة 3.00 ز البلاديوم إضافية على الكربون (10٪ بالوزن المشتريات، 2.82 ملمول).
      6. Resubject رد فعل لارتداد الظروف كما هو موضح في 1.3.2 و1.3.3.
      7. بعد 24 ساعة إضافية في الجزر وتحليل قسامة آخر من رد الفعل بنسبة 11 B NMR. عند هذه النقطة، يجب أن يكون رد فعل كامل.
      8. نقل قارورة رد فعل على علبة القفازات وتمرير خليط التفاعل من خلال عمود فلاش اللوني المتاح معبأة مع مناديل الورق. جمع الرشاحة عن طريق الغسيل مع 50.0 مل من التولوين.
      9. إزالة كافة المواد المتطايرة من الترشيح خارج منطقة الجزاء على مشعب الغاز فراغ مجهزة فراغ عالية.
        ملاحظة: إزالة المواد المتطايرة يمكن أن يستغرق 40 دقيقة رس 90 دقيقة تبعا لضغط الفراغ. عندما يقرأ قياس الفراغ أقصى قدر من الضغط، فإنه يشير إلى أن إزالة المذيب كاملة. في حين إزالة المذيب، تأكد من أن حمام الماء تحت قارورة يبقى في درجة حرارة الغرفة لتبديد الحرارة.
      10. في علبة القفازات، ونقل خليط التفاعل المركزة إلى المجفف الفرن 24/40 250 مل قارورة جولة القاع مع بقضيب. تتويج القارورة مع الحاجز.
      11. بسرعة إزالة الحاجز وإضافة 200 ملغ هيدريد الكالسيوم كعامل تجفيف.
      12. إعداد جهاز التقطير عن طريق تركيب و24/40 رئيس التقطير المجفف الفرن المرفقة مع ميزان حرارة، جانب واحد مع تلقي 24/40 100 مل قارورة التخزين خالية من الهواء وعلى الجانب الآخر مع قارورة 100 مل تحتوي على الناتج الخام. تجهيز رأس التقطير بالماء البارد. استخدام الشحوم لجميع مفاصل جهاز التقطير.
        ملاحظة: المنتج يبدأ لاستخلاص عندما تصل درجة الحرارة إلى بخار 65-70 درجة مئوية في 1000 mTorr مع النفطدرجة حرارة الحمام بين 90-100 درجة مئوية. والمنتج هو سائل عديم اللون واضح.
      13. وقف التقطير عن طريق إزالة مصدر الحرارة وتبريد الجهاز إلى درجة حرارة الغرفة قبل التخزين. على التبريد، repressurize الجهاز مع النيتروجين وإغلاق بإحكام صمام المكونات على قارورة التخزين خالية من الهواء. تخزين المنتج معزولة في الثلاجة علبة القفازات عند -30 درجة مئوية.
        ملاحظة: العائد لوعاء واحد، إجراءات الخطوة الثانية هي 52٪.

    figure-protocol-2
    الشكل 2: 11 ب NMR الأطياف لتشكيل رصد N -TBS- ب -Cl-1،2-azaborine (3). أ) N -Allyl- N -TBS-B-الآليل ناتج إضافة كلوريد (1)، ابتداء من المواد لعصابة إغلاق وصفت الابدال والاحلال. ب) الأكسدة بعد 16 ساعة. (المتفاعل N -TBS- ب -Cl المنتج المغلقة حلقة (2) وأزمرته ب -vinyl المنتج حلقة مغلقة (2 ') جنبا إلى جنب مع N-TBS-B-CL-1،2-azaborine (3) ترد.) C) الأكسدة بعد إضافية من 24 ساعة. D) المنتج معزولة (3) بعد تنقيتها عن طريق التقطير الفراغ. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    1. إعداد N -H- ب -OBu-1،2-azaborine (4)
      1. في علبة القفازات، وقياس من 4.00 غرام N- TBS -B- CL-1،2-azaborine (3) (17.6 ملمول) في 100 مل قارورة فرن المجفف جولة القاع مع بقضيب وإضافة 35 مل الأسيتونتريل. قياس من 1.14 غرام اسيتاميد (19.3 ملمول) ونقل إلى دورق التفاعل. ختم قارورة مع الحاجز المطاطي.
      2. إزالة قارورة رد فعل من منطقة الجزاء، وتناسب مع سفين المجفف 24/40 المكثف الراجع أن تم تطهير مع النيتروجين ومجهزة المياه المبردة.
      3. تسخين رد فعل لارتداد في 85 درجة مئوية في حمام الزيت مع التقليب.
      4. بعد 3 ساعات في الجزر، تبريد رد فعل عن طريق إزالة قارورة من حمام الزيت. على يبرد إلى درجة حرارة الغرفة، وإزالة المذيب على مشعب الغاز فراغ مجهزة فراغ عالية.
      5. بعد إزالة المواد المتطايرة في ظل فراغ، تنحل بقايا رد فعل في 15.0 مل THF. إلى هذا الحل إضافة 3.21 مل ن -butanol (35.1 مليمول).
      6. إثارة رد فعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
      7. إزالة المذيب على مشعب الغاز فراغ مجهزة فراغ عالية للحصول على المنتج الخام.
      8. في علبة القفازات، عزل المنتج عن طريق العمود هلام السيليكا اللوني، وذلك باستخدام خليط من البنتان وايثر (5: 1)، وشاطف. إزالة المواد المتطايرة من الكسور التي تحتوي على المنتج باستخدام الغاز متعددة فراغ مجهزة فراغ عالية للحصول على المنتج نقية كمابيضاء صلبة.
        ملاحظة: العائد يمكن أن تختلف من 82٪ إلى 87٪.
    2. إعداد N -H- ب -ethyl-1،2-azaborine (5)
      1. في علبة القفازات، وقياس من 1.00 غرام N- H -B- أبوء-1،2-azaborine (4) (6.62 ملمول) في 100 مل قارورة فرن المجفف جولة القاع مع بقضيب وإضافة 25 مل إت 2 O. ختم القارورة مع الحاجز المطاطي ومكان تحت N 2 على مشعب الغاز فراغ.
      2. في المجفف فرن 100 مل قارورة أسفل جولة منفصلة، ​​إضافة 26.5 مل من محلول ethyllithium (0.5 M في البنزين / الهكسان الحلقي، 13.2 ملمول) في جو من النيتروجين. إزالة الخليط من المذيب (البنزين / الهكسان الحلقي) من كاشف ethyllithium لتجنب المشاكل مع عزل المنتج azaborine المطلوب. تنحل في ethyllithium الصلبة في 13.0 مل إت 2 O.
        ملاحظة: تنبيه: مركب ليثيوم عضوي هي قابلة للإشتعال (القابلة للاشتعال على ملامسة الهواء أو الماء). المنتج المطلوب (5 ) هي متقلبة ولا سيما (MW = 106.96). ولذلك، مطلوب إزالة المذيب البنزين / الهكسان الحلقي من كاشف ethyllithium لعزل الفعالة للمنتج نقي بسبب تقلب مماثل مع المنتج المطلوب.
      3. تبريد قارورة التفاعل التي تحتوي على 4 إلى -30 ° C مع حمام التبريد.
      4. إضافة الحل ethyllithium إلى دورق التفاعل عبر نقل قنية في -30 ° C. الحفاظ على اثارة في درجة الحرارة هذه لمدة 1 ساعة والسماح لها دافئ ببطء إلى درجة حرارة الغرفة.
      5. مراقبة رد فعل من جانب 11 B NMR. (تظهر ذروة المتوسطة المطلوبة في كاليفورنيا 39.8 جزء في المليون).
      6. عند الانتهاء رد فعل، تبريد رد فعل ل-30 ° C وإضافة 6.62 مل من محلول حمض الهيدروكلوريك (2.0 M في إت 2 O، 13.2 ملمول). إثارة رد فعل لمدة 1 ساعة في حين يسمح لها دافئة ببطء إلى درجة حرارة الغرفة.
      7. إزالة المذيب على مشعب الغاز فراغ مجهزة فراغ منخفضة (20-25 عربة) للحصول على خليط الناتج الخام.
      8. في علبة القفازات،عزل المنتج عن طريق هلام السيليكا العمود اللوني، وذلك باستخدام 2-methylbutane كما شاطف. إزالة متقلبة على مشعب الغاز فراغ مجهزة فراغ موهن للحصول على المنتج نقية كما سائل عديم اللون.
        ملاحظة: العائد هو 56٪.

    2. البروتين إعداد وبلورة T4 الليزوزيم المسوخ

    1. تعبير البروتين وتنقية
      1. تنمو الخلايا كولاي RR1 تحولت مع البلازميدات subcloned (L99A أو L99A / M102Q) 17 و 20 في 200 مل LB (استذابة مرق) وسائل الإعلام تستكمل مع 40.0 ملغ الأمبيسلين عند 37 درجة مئوية لمدة 12 ساعة.
        ملاحظة: تكوين وسائل الإعلام LB هو 12 ز تريبتون، 5 ز خلاصة الخميرة، و 10 غرام كلوريد الصوديوم، و 1 غرام غلوكوز لكل 1 LH 2 O.
      2. تطعيم 4.00 L LB وسائل الإعلام (تستكمل مع الأمبيسلين 800 ملغ) مع 160 مل من الثقافة بين عشية وضحاها، واحتضان عند 37 درجة مئوية في 240 دورة في الدقيقة مع filtereد العرض الجوي.
      3. عندما تصل الكثافة البصرية 0.7 في 600 نانومتر، تبريد ثقافة البكتيرية إلى درجة حرارة الغرفة قبل إزالته من الحاضنة.
      4. قياس من 695 ملغ من الإيزوبروبيل-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) (تركيز النهائي من 0.7 ملم) في أنبوب الطرد المركزي مخروطي الشكل وإضافة 4 وسائل الإعلام مل LB إلى حل.
      5. إضافة الحل IPTG إلى ثقافة للحث على التعبير البروتين. احتضان الثقافات في 110 دورة في الدقيقة لمدة 21 ساعة عند درجة حرارة 25 درجة مئوية.
      6. أجهزة الطرد المركزي ثقافة في 4412 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية. تجاهل طاف و resuspend بيليه في 300 مل من 0.1 M فوسفات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 6.6)، 0.2 M كلوريد الصوديوم وإضافة 30.0 مل من 0.5 M ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA) (درجة الحموضة 8.0). تحريك تعليق لمدة 17 ساعة عند 4 درجات مئوية.
      7. إضافة 30.0 مل من 1.0 M MgCl 2 و 0.500 مل من ديوكسي ريبونيوكلياز الأول (الدناز I) إلى تعليق ويقلب في درجة حرارة الغرفة لمدة 8 ساعات.
      8. الطرد المركزي تعليق خلية هي lysed في 30913 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 76؛ C. جمع طاف تحتوي على البروتين وأعرب وتجاهل بيليه.
      9. Dialyze المحللة مقابل 20 ملي فوسفات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 6.5 L99A ودرجة الحموضة 6.3 لL99A / M102Q) في 4 درجات مئوية خلال الليل.
      10. غسل وتتوازن 20.0 مل من كاربوكسيميثيل الخرز التبادل الأيوني مع العازلة موازنة (50 ملي تريس، 1 ملم EDTA (درجة الحموضة 7.3)) في عمود. تحميل محلول يحتوي على البروتين على الخرز وغسل العمود مع 100 مل من المخزن المؤقت موازنة. أزل عمود مع 600 مل الخطي التدرج من 300 ملي كلوريد الصوديوم داخل المخزن المؤقت موازنة.
      11. استخدام النظام اللوني الضغط المنخفض لتنقية العمود. استخدام معدل ضخ من 1 مل / دقيقة وجمع الكسور من 10 مل. جمع الكسور التي تحتوي على البروتين النقي.
        ملاحظة: أثناء شطف، ومراقبة الكثافة الضوئية (OD) في 280 نانومتر للتحقق من وجود البروتين. تحديد نقاء كل جزء من SDS-PAGE وجمع فقط أنقى الكسور.
    "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 "> figure-protocol-3
    الرقم 3: ممثل النتائج لتنقية البروتين من T4 الليزوزيم L99A متحولة / M102Q. أ) المخطط الاستشرابي تبين امتصاص الأشعة فوق البنفسجية قياس في الاتحاد الافريقي في 280 نانومتر (الخط الأزرق) والموصلية في MS / سم (خط أحمر). كسور 20-23 تم الجمع بين وتقرر نقاء بواسطة SDS-PAGE. ب) 15٪ هلام SDS-PAGE وتبين وجود البروتين المنقى من كسور في 20-23 18.6 كيلو دالتون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    1. البروتين تبلور
      1. نقل الحل البروتين النقي لأنابيب غشاء غسيل الكلى (12،000 إلى 14،000 MWCO). وضع أنابيب غسيل الكلى في دورق يحتوي على 4.00 L 100 ملي فوسفات الصوديوم، كلوريد الصوديوم 550 ملم، 0.02٪ نان 3 (الرقم الهيدروجيني 6.5 L99A ودرجة الحموضة 6.3 لL99A / M102). تحريك الحل 4 L بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
      2. إضافة 2 المركابتويثانول (تركيز النهائي من 5 ملم) على عينة مدال والتركيز إلى ~ 40.0 ملغ / مل باستخدام مكثف الطرد المركزي (10،000 MWCO). تحديد تركيز البروتين عن طريق قياس امتصاص عند 280 نانومتر. إزالة أي راسب من خلال الدوران قبل التبلور.
      3. استخدام الأسلوب شنقا انخفاض بخار نشرها لبلورة البروتين. مزيج 5.00 ميكرولتر من محلول البروتين مركزة مع 5.00 ميكرولتر من الحل الخزان (2،0-2،2 M الصوديوم / البوتاسيوم الفوسفات، ودرجة الحموضة 6،7-7،1، 50 مم 2-المركابتويثانول، 50 مم 2-هيدروكسي ثاني كبريتيد) على صلكنزد شريحة غطاء زجاجي.
      4. يوازن انخفاض مزيج ضد 1.00 مل من محلول الخزان عن طريق وضع شريحة غطاء رأسا على عقب على رأس خزان حل تحتوي على كل بئر. استخدام الشحوم لاغلاق محكم كل بئر مع الشريحة. إعداد مختلف الظروف باستخدام 24 لوحة جيدا مع الحل الخزان المذكورة في 2.2.3.تخزين لوحة عند 4 درجات مئوية للنمو وضوح الشمس.
        ملاحظة: بلورات تنمو عادة في غضون 1-2 أسابيع في المنطقة العازلة معايرتها على الشريحة الغطاء. هطول فوري خلال خلط حل البروتين مع الحل الخزان في الخطوة 2.2.3 يشير فشل التبلور.

    figure-protocol-4
    الشكل 4: الصورة التمثيلية للبلورات من T4 الليزوزيم L99A متحولة قبل complexation مع بروابط. البلورات هي في المحلول الام (2.1 M الصوديوم / البوتاسيوم الفوسفات، ودرجة الحموضة 6.9، 50 ملم 2-المركابتويثانول، 50 مم 2-هيدروكسي ثاني كبريتيد). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    1. إعداد معقدة
      1. اختيار البلورات باستخدام أنابيب المبردة شكل في حلقة (انظر قائمة المواد) ووضعها في أنبوب مل microcentrifuge 0.6. إضافة 50.0 ميكرولتر من الخمور الأم إلى أنبوب لتجنب جفاف والحفاظ على بلورات.
        ملاحظة: وحيد اختيار الكريستال وساعد باستخدام المجهر.
      2. نقل الأنبوب الذي يحتوي بلورات في علبة القفازات. خذ 5.00 ميكرولتر من يجند azaborine (5) ومكان داخل الأداة الإضافية غطاء من الأنبوب. كاب وتخزين أنبوب في الثلاجة (4 درجة مئوية) داخل علبة القفازات ل2-7 أيام للموازنة عن طريق الانتشار البخار.
        ملاحظة: الخصائص الفيزيائية (ارتفاع معدل التذبذب والذوبان في محلول مائي) من يجند azaborine (5) تمكن complexation مع بلورات البروتين متشكلة عبر طريقة بخار نشرها.
      3. نقل البلورات باستخدام أنابيب المبردة شكل في حلقة إلى شريحة زجاجية تحتوي على قطرة من N-paratone قبل فلاش تجميد في النيتروجين السائل. اختيار الكريستال محمية مع N-paratone وبسرعة فلاش للتجمد: إغراق الكريستال علىحلقة في ديوار التي تحتوي على النيتروجين السائل. جبل الكريستال في حلقة باستخدام ملقط المبردة.
      4. جمع مجموعات البيانات من الكريستال واحد باستخدام أشعة السنكروترون. أداء استبدال الجزيئي باستخدام هياكل نشرت 20، 24؛ التحقق من وجود يجند داخل الموقع بروتين ملزمة من قبل الامم المتحدة وسائل غرار كثافة الإلكترونات.

    figure-protocol-5
    الرقم 5: نماذج الذرية T4 الليزوزيم متحولة L99A جيب ملزمة مع كثافة الإلكترونات. أ) تجويف L99A مع سائل كثافة الإلكترون غرار الامم المتحدة في موقع ملزم. ب) L99A تجويف مع يجند azaborine غرار 5 في اثنين المتشاكلات بديلة. يرجى CLإك هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ويظهر الطريق الاصطناعية التخطيطي ل1،2-azaborines في الشكل 1. ينطبق هذا البروتوكول لتخليق خمسة مختلفة البورون النيتروجين التي تحتوي على جزيئات. يمثل الرقم 2 11 ب NMR الأطياف قياسها أثناء الخطوة 1.3 لمراقبة تشكيل المنتج المطلوب (3). تم إجراء تنقية البروتين باستخدام نظام اللوني الضغط المنخفض وأظهرت اللوني تمثيلي في الشكل (3). تم تحديد نقاء من الكسور التي تم جمعها من قبل SDS...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في الجزء الأول من هذا البروتوكول، وصفنا توليفة معدلة من 1،2-azaborines على أساس أساليب ذكرت سابقا 12 و 13. وقد استخدم Triallylborane 22 كبديل للطرق باستخدام allyltriphenyl القصدير أو البوتاسيوم allyltrifluoroborate لإعداد N -allyl- N -TBS- ب -allyl ناتج إضافة كلوريد (1). وتسمح هذه الطريقة لاتباع نهج أكثر ذرة اقتصادية وصديقة للبيئة. لتركيب N -TBS- ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن جميع المؤلفين عدم وجود مصالح مالية متنافسة في هذه المخطوطة.

شكر وتقدير

تم دعم هذا البحث من قبل المعاهد الوطنية للصحة NIGMS (R01-GM094541) وكلية بوسطن.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
رباعي هيدروفوران (THF) ، خالي من المثبطات ، ل HPLC ، & ge ؛ 99.9٪Sigma Aldrich34865
ثنائي إيثيل الأثير (Et2< / sub>O) ، ل HPLC ، & ge ؛ 99.9٪ ، خال من مثبطاتسيجما ألدريتش309966
كلوريد الميثيلين   ؛ (CH2Cl2) ، (ACS مستقر / معتمد)فيشرD37-20
تولوينفيشرT290-4
بنتان ، HPLCفيشرP399-4
أسيتونيتريلفيشرA21-4
هيدريد الكالسيوم (CaH2< / sub>) ، درجة الكاشف ، 95٪سيجماألدريتش 208027البلاديوم الحمايي
على الكربون المنشط (Pd / C) ، 10٪ بالوزن PdStrem46-1900
1.0 M محلول ثلاثي كلوريد البورون في الهكسانسيجما ألدريتش211249شديد السمية / البيروفوريك
، & ge ؛ 99.5٪سيجما ألدريتش471283
Grubbs 1st جيل catalyst الموادC823
أسيتاميدسيجما ألدريتشA0500
n-Butanol ، لامائي ، 99.8٪Sigma Aldrich281549
محلول إيثيل ليثيوم ، 0.5 & nbsp ؛ M في البنزين / الهكسان الحلقيسيجما ألدريتش561452شديد السمية / البيروفوريك
، 2.0 متر في Et2< / sub>OSigma Aldrich455180
2-Methylbutane ، اللامائي ، & ge ؛ 99٪سيجما ألدريتش277258
الإشريكية القولونية< / em> ، (Migula) Castellani and Chalmers (ATCC ® ؛ 31343 ™)ATCC31343
T4 lysozyme WT * (L99A) Addgene18476
T4 lysozyme mutant (S38D L99A M102Q N144D)Addgene18477
ملح الصوديوم أمبيسلينسيجما ألدريتشA0166
الأيزوبروبيل-&بيتا;-D-1-ثيوغالاكتوبيرانوسيد (IPTG) InvitrogenAM9464
فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة اللامائيفيشرBP329
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة اللامائيفيشرBP332
كلوريد الصوديومفيشرS642212 
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيكفيشرBP118
كلوريد المغنيسيومسيجما ألدريتشM4880
علمي حراري تآكل DNaseIفيشرPI-90083
GE Healthcare   Sepharose تدفق سريع كاتيون تبادل وسائل الإعلامفيشر45-002-931
تريس قاعدةفيشرBP152-500 
أزيد الصوديومTCIS0489شديد السمية
2-MercaptoethanolFisherICN806443 
Sartorius  Vivaspin 20 مكثفات الطرد المركزيفيشر14-558-501
فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدةسيجما ألدريتشP5379
2-هيدروكسي إيثيل ثاني كبريتيدسيجما ألدريتش380474
N-paratone هامبتون للأبحاثHR2-643
4 RC أنابيب غشاء غسيل الكلى 12,000 إلى 14,000 دالتون MWCO   ؛فيشر08-667E
  أنابيب مبردة من CryoLoopHampton Researchعلى شكل حلقة
إنشاء صور كثافة الإلكترون
CryoTongThermo Fisher
ثلاثي إيثيل أمين محلول حمض الهيدروكلوريك ثقب يتم المبردة من البرنامج

المراجع

  1. Ducruix, A., Giége, R. Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, A Practical Approach. , IRL Press. Oxford, UK, New York. (1992).
  2. Bosdet, M. J. D., Piers, W. E. B-N as a C-C substitute in aromatic systems. Can. J. Chem. 87 (1), 8-29 (2009).
  3. Campbell, P. G., Marwitz, A. J., Liu, S. -Y. Recent Advances in Azaborine Chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. 51 (25), 6074-6092 (2012).
  4. Wang, X. -Y., Wang, J. -Y., Pei, J. B. N. Heterosuperbenzenes: Synthesis and Properties. Chem. Eur. J. 21 (9), 3528-3539 (2015).
  5. Zhou, H. -B., et al. Elemental isomerism: a boron-nitrogen surrogate for a carbon-carbon double bond increases the chemical diversity of estrogen receptor ligands. Chem. Biol. 14 (6), 659-669 (2007).
  6. Ito, H., Yumura, K., Saigo, K. Synthesis, characterization, and binding property of isoelectronic analogues of nucleobases, B(6)-substituted 5-aza-6-borauracils and -thymines. Org. Lett. 12 (15), 3386-3389 (2010).
  7. Vlasceanu, A., Jessing, M., Kilburn, J. P. BN/CC isosterism in borazaronaphthalenes towards phosphodiesterase 10A (PDE10A) inhibitors. Bioorg. Med. Chem. 23 (15), 4453-4461 (2015).
  8. Rombouts, F. J., Tovar, F., Austin, N., Tresadern, G., Trabanco, A. A. Benzazaborinines as Novel Bioisosteric Replacements of Naphthalene: Propranolol as an Example. J. Med. Chem. 58 (23), 9287-9295 (2015).
  9. Culling, G. C., Dewar, M. J. S., Marr, P. A. New Heteroaromatic Compounds. XXIII. Two Analogs of Triphenylene and a Possible Route to Borazarene. J. Am. Chem. Soc. 86 (6), 1125-1127 (1964).
  10. White, D. G. 2-Phenyl-2,1-borazarene and Derivatives of 1,2-Azaboracycloalkanes. J. Am. Chem. Soc. 85 (22), 3634-3636 (1963).
  11. Ashe III, A. J., Fang, X. A Synthesis of Aromatic Five- and Six-Membered B−N Heterocycles via Ring Closing Metathesis. Org. Lett. 2 (14), 2089-2091 (2000).
  12. Marwitz, A. J. V., Matus, M. H., Zakharov, L. N., Dixon, D. A., Liu, S. -Y. A Hybrid Organic/Inorganic Benzene. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (5), 973-977 (2009).
  13. Abbey, E. R., Lamm, A. N., Baggett, A. W., Zakharov, L. N., Liu, S. -Y. Protecting Group-Free Synthesis of 1,2-Azaborines: A Simple Approach to the Construction of BN-Benzenoids. J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12908-12913 (2013).
  14. Rudebusch, G. E., Zakharov, L. N., Liu, S. -Y. Rhodium-catalyzed boron arylation of 1,2-azaborines. Angew. Chem. Int. Ed. 52 (35), 9316-9319 (2013).
  15. Brown, A. N., Li, B., Liu, S. -Y. Negishi Cross-Coupling Is Compatible with a Reactive B-Cl Bond: Development of a Versatile Late-Stage Functionalization of 1,2-Azaborines and Its Application to the Synthesis of New BN Isosteres of Naphthalene and Indenyl. J. Am. Chem. Soc. 137 (28), 8932-8935 (2015).
  16. Knack, D. H. BN/CC Isosteric Compounds as Enzyme Inhibitors: N- and B-Ethyl-1,2-azaborine Inhibit Ethylbenzene Hydroxylation as Non-Convertible Substrate Analogs. Angew. Chem. Int. Ed. 52 (9), 2599-2601 (2013).
  17. Eriksson, A. E. Response of a Protein Structure to Cavity-Creating Mutations and Its Relation to the Hydrophobic Effect. Science. 255 (5041), 178-183 (1992).
  18. Eriksson, A. E., Baase, W. A., Wozniak, J. A., Matthews, B. W. A cavity-containing mutant of T4 lysozyme is stabilized by buried benzene. Nature. 355 (6358), 371-373 (1992).
  19. Morton, A., Baase, W. A., Matthews, B. W. Energetic Origins of Specificity of Ligand Binding in an Interior Nonpolar Cavity of T4 Lysozyme. Biochemistry. 34 (27), 8564-8575 (1995).
  20. Wei, B. Q., Baase, W. A., Weaver, L. H., Matthews, B. W., Shoichet, B. K. A Model Binding Site for Testing Scoring Functions in Molecular Docking. J. Mol. Biol. 322 (2), 339-355 (2002).
  21. Lee, H., Fischer, M., Shoichet, B. K., Liu, S. -Y. Hydrogen Bonding of 1,2-Azaborines in the Binding Cavity of T4 Lysozyme Mutants: Structures and Thermodynamics. J. Am. Chem. Soc. 138 (37), 12021-12024 (2016).
  22. Brown, H. C., Racherla, U. S. Organoboranes. 43. A Convenient, Highly Efficient Synthesis of Triorganylboranes via a Modified Organometallic Route. J. Org. Chem. 51 (4), 427-432 (1986).
  23. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  24. Liu, L., Baase, W. A., Matthews, B. W. Halogenated Benzenes Bound within a Non-polar Cavity in T4 Lysozyme Provide Examples of I.S and I.Se Halogen-bonding. J. Mol. Biol. 385 (2), 595-605 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

12 11
توليف 1،2-Azaborines وإعداد مجمعات البروتين مع T4 الليزوزيم المسوخ
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.