Method Article

توصيف تكلس الأحداث عن طريق لايف البصرية والمجهر الإلكتروني تقنيات في Tubeworm البحرية

DOI:

10.3791/55164

⸱

February 28th, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Clemson University, 2Department of Marine Biodiversity Research (BioDive), Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC), 3Advanced Material Research Laboratory (AMRL), Clemson University, 4Swire Institute of Marine Sciences and School of Biological Sciences, The University of Hong Kong

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نوضح استخدام طرق الفحص المجهري المختلفة المفيدة في مراقبة تكلس الدودة الأنبوبية ، Hydroides elegans ، بالإضافة إلى تحديد وتوصيف أول مادة متكلسة. يتم استخدام الفحص المجهري الحي والفحص المجهري الإلكتروني معا لتوفير المعلومات الوظيفية والمادية المهمة في دراسة التمعدن الحيوي.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتطلب توصيف الحدث الأول للإنتاج البيولوجي لكربونات الكالسيوم مزيجا من أساليب الفحص المجهري. أولا ، يمكن ملاحظة توزيع الأس الهيدروجيني داخل الخلايا وأيونات الكالسيوم باستخدام الفحص المجهري الحي بمرور الوقت. يسمح ذلك بتحديد مرحلة الحياة والأنسجة ذات الميزة ذات الأهمية لمزيد من دراسات المجهر الإلكتروني. عادة ما تكون مرحلة الحياة والأنسجة ذات الأهمية أعلى في إشارات الأس الهيدروجيني والكالوسيم.

هنا ، باستخدام H. اإليجانس، نقدم بروتوكولا لتوصيف وجود هياكل كربونات الكالسيوم في عينة بيولوجية على المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) ، باستخدام التحليل الطيفي للأشعة السينية المشتتة للطاقة (EDS) لتصور تكوين العناصر ، باستخدام حيود التشتت الخلفي للإلكترون (EBSD) لتحديد وجود الهياكل البلورية ، واستخدام المجهر الإلكتروني الناقل (TEM) لتحليل تكوين وهيكل المادة. في هذا البروتوكول ، يتم استخدام حزمة أيونية مركزة (FIB) لعزل العينات ذات الأبعاد المناسبة لتحليل TEM. نظرا لأن FIB هي تقنية خاصة بالموقع ، فإننا نوضح كيف يمكن استخدام المعلومات من التقنيات السابقة لتحديد منطقة الاهتمام ، حيث تكون إشارات Ca أعلى.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biomineralization هو عبارة عن سلسلة معقدة من الأحداث، التي تمثل جسرا بين مجموعة من الأنشطة الخلوية الناتجة في إنتاج المعادن أمر رائع 1. ويتمثل التحدي في وصف كل من العملية الخلوية الحيوية والهياكل المعدنية المتطورة باستخدام مزيج من أساليب المجهر الضوئي والإلكترون. ارتفاع درجة الحموضة داخل الخلايا تفضل تشكيل كربونات الكالسيوم 3 البلورات، وبالتالي تحديد مرحلة الحياة التي لديها زيادة درجة الحموضة يكشف عن الوقت الذي من المحتمل أن تحدث 2، 3 التكلس.

والديدان الأنبوبية من عائ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. فحص للمرحلة الحياة والأنسجة من الاهتمام مع تصوير لايف

  1. ثقافة اليرقات البحرية إلى الكفاءة وفقا للأساليب ذكرت سابقا 6 و 7 و 9. احتضان يرقات tubeworm في 5 اليرقات في كثافة مل مع مياه البحر التي تمت تصفيتها مع 10 ميكرومتر SNARF-01:00 ليلا. تغطية الحاويات مع رقائق الألومنيوم لحماية التحقيق الفلورسنت من الصور تبيض.
  2. مراقبة اليرقات باستخدام مجهر تشريح. سوف tubeworm المختصة اليرقات جاهزة للتحول السباحة ف....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وفيما يلي بعض الملاحظات من عملية تكلس خلال التحول من tubeworm. ويبين الشكل (1) أن قيم الرقم الهيدروجيني بالقرب من منطقة طوق أعلى من الأنسجة الأخرى بعد التحول. ويبين الشكل 2I على tubeworm مع توزيع متجانس من الكالسيوم، مما يشير إلى لم تبدأ أحداث تكلس الرئيسية؛ ويبين الشكل 2ii على tubeworm الذي متكلسة لفترة أطول، مما يشير إلى تكلس قد تجاوز نقطة زمنية في المصالح؛ ويبين الشكل 2iii على t.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التصوير الضوئي يعيش هو وسيلة مفيدة لمراقبة الأحداث الخلوية في متعددة الخلايا. هنا استخدمت المؤشرات درجة الحموضة وأيون الكالسيوم الداخلية لقياس تدفق الأيونات في مواقع التمعدن. في هذه المناطق، مطلوب ضخ الأيونات النشطة لرفع درجة الحموضة والكالسيوم 2+ تركيز لتمكين تكلس 2 و 3. عند تطبيق جزيئات الفلورسنت لدراسة كائن حي، فمن الأهمية بمكان لضمان التركيز المستخدم لديه سمية تذكر وتمكن الكائن الحي لأداء بطريقة ذات الصلة من.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلفون إرسال شكر جزيل إلى Clemson Broadcast Productions ، والتسجيل الصوتي بواسطة J. Bright ، والسرد بواسطة A.D. McQuiston ، وتحلية الصوت ، و K. Murphy ، وتصوير الفيديو بواسطة G. Spoke ، وفنون الجرافيك بواسطة T. Messervy ، وتحرير الفيديو بواسطة T. Messervy و E. Rodgers. استلهمت المساعدة الفنية والمشورة العلمية من نصيحة S. Kavata و S. Kubo و J. Hudson و T. Darroudi و D. Mulwee و H. Qian و Y.W. Lam و M.B Johnstone و C. Campanati و A.C. Lane و R. Dineshram. تم تمويل هذه الدراسة من خلال ثلاث منح GRF من HKSAR-RGC (أرقام المنح: 705511P و 705112P و 17304914).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Hexamethyldisilazane علوم المجهر الإلكتروني16700 (EM)
أوزميوم رباعي أكسيد 2٪ محلول مائيعلوم المجهر الإلكتروني19192
IBMX 3-Isobutyl-1-methylxanthineThermoFisher ScientificPHZ1124
النيجريسين ، طبق قطرهThermoFisher ScientificN7143-5MG
، حجم الثقب 27 مم ، زجاج رقم 0 ، غير معطفThermoFisher Scientific D110400
5- (و -6) - Carboxy SNARF-1 ، Acetoxymethyl Ester ، AcetateThermoFisher ScientificC-1271
BDH كلوريد البوتاسيوم ، ACS GradeVWRBDH0258-500G
Paraformaldehyde
درجة الكاشف ، حمض		البلوري SigmaP6148
1 M للتحليل الحجميWako Pure Chemical Industries، Ltd083-01095
0.05 M محلول هيدروكسيد الصوديوم للتحليل الحجميWako Pure Chemical Industries، Ltd199-02185
CalceinSigmaC0875
FASWIwaki Co. Ltd.Rei-sea
مختلطة إستر إستر ؛ 47 مم قطر ، 0.45 & مأدفانتيكA045A047A
الإيثانولواكو بيور للصناعات الكيماوية المحدودة051-00476
مياه البحر الاصطناعية للمخازن المؤقتةبواسطة SOP06 الصادر عن وزارة الطاقة (1994) ، cdiac.ornl.gov/ftp/cdiac74/sop06.pdf
كلوريد الصوديومواكو للصناعات الكيميائية النقية المحدودة191-01665
كلوريد البوتاسيومواكو للصناعات الكيماوية النقية المحدودة163-03545
كلوريد المغنيسيوم سداسي هيدراتواكو بيور للصناعات الكيماوية المحدودة135-00165
كلوريد الكالسيومواكو للصناعات الكيماوية النقية المحدودة039-00475
كبريتات الصوديومواكو للصناعات الكيماوية النقية المحدودة197-03345
حمض الهيدروكلوريكواكو للصناعات الكيماوية النقية المحدودة089-08415
2-أمينو-2-هيدروكسي ميثيل-1،3-بروبانديول (تريس)واكوبيور للصناعات الكيماوية المحدودة207-06275
2-أمينوبيريدينواكو بيور للصناعات الكيماوية المحدودة011-02775
أوريون 5 نجوم بالإضافة إلى مقياس الأس الهيدروجينيالحراري العلمي
PrpHecT ROSS الجمع الجزئي الأس الهيدروجيني القطب الكهربائي 8220BNWPThermo Scientific
Axiovision ، الإصدار 4.6 ، Axio المراقب Z1Zeiss
ImageJNIH ، بيثيسدا ، دكتوراه في الطب ، الولايات المتحدة الأمريكية
HRTEM H500هيتاشي
SU6600 VPSEMهيتاشي
NB5000 نظام الأيونات المركزة وشعاع الإلكترون (FIB-SEM)هيتاشي & nbsp ؛
35 مم بالحمض الحر الهيدروكلوريك البحرية

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aizenberg, J., et al. Skeleton of Euplectella sp.: structural hierarchy from the nanoscale to the macroscale. Science. 309 (5732), 275-278 (2005).
  2. de Nooijer, L. J., Toyofuku, T., Oguri, K., Nomaki, H., Kitazato, H. Intracellular pH distribution in foraminifera determined by the fluorescent probe HPTS. Limnol Oceanogr Methods. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Calcium Carbonate CalcificationLive Optical MicroscopyElectron Microscopy TechniquesIntracellular pH ImagingScanning Electron MicroscopyEnergy Dispersive Xray SpectroscopyElectron Backscatter DiffractionTransmission Electron MicroscopyFocused Ion BeamMarine Tubeworm Larvae

Related Articles