وضعنا إعداد شريحة الأفقي للشبكية العين الكبار الثدييات مع الطائرة من باجتزاء موازية لسطح الشبكية. لم اقتطاع الحقول الجذعية من الخلايا العصبية للشبكية موجهة nonradially، والسماح للدراسة معالجة الإشارات مع تقنيات التصحيح، المشبك والتصوير.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إعداد شرائح أفقية من الكبار شبكية العين الفأر للدراسات الكهربية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يتم وضع الاستعدادات شريحة رأسية أيضا لدراسة الدوائر ونقل الإشارات في الكبار شبكية الثدييات. الطائرة من باجتزاء في هذه الاستعدادات هي عمودي على سطح الشبكية، مما يجعلها مثالية لدراسة الخلايا العصبية الموجهة شعاعيا مثل خلايا مستقبلة للضوء والخلايا القطبين. ومع ذلك، فإن العرش شجيري كبيرة من الخلايا الأفقية، وخلايا عديم الاستطالات واسعة المجال، وخلايا العقدة هي في معظمها مبتورة، وترك انخفضت بشكل ملحوظ النشاط متشابك في هذه الخلايا. في حين أن خلايا العقدة والخلايا عديم الاستطالات المشردين يمكن دراستها في إعداد كله محمولة على شبكية العين، والخلايا الأفقية والخلايا عديم الاستطالات تقع في الطبقة النووية الداخلية يمكن الوصول إليها لأقطاب في أنسجة شبكية العين كلها سيئة فقط.
لتحقيق أقصى قدر من سهولة الوصول وسلامة متشابك، وضعنا إعداد شريحة الأفقي للشبكية العين الماوس، ودرس نقل الإشارات في المشبك بين خلايا مستقبلة للضوء والأفقيالخلايا. باجتزاء الأفقي يسمح (1) التعرف البصري سهلة واضح لا لبس فيه من أجسام الخلايا الأفقية لاستهداف الكهربائي، و (2) الحفاظ على حقول شجيري الخلايا الأفقية الممتدة، كشرط أساسي لحالها وظيفية مخروط مدخلات متشابك إلى التشعبات الخلية الأفقية.
الخلايا الأفقية من شرائح أفقية أظهرت النشاط متشابك منشط في الظلام، وأنها استجابت لإطلاع ومضات من الضوء مع الحد من الداخل النشاط متشابك الحالي وتقلص. تشير الأدلة Immunocytochemical أن ما يقرب من جميع المخاريط في مجال شجيري خلية الأفقية تضع نقاط الاشتباك العصبي مع التشعبات في الطرفية. لذلك مناسبة لإعداد شريحة الأفقي كذلك دراسة الخصائص الفسيولوجية للالخلايا العصبية للشبكية ممتدة أفقيا وكذلك نقل الإشارات الحسية والتكامل بين نقاط الاشتباك العصبي المحدد.
المقدمة
يتم ترميز المعلومات البصرية كنمط الديناميكي المكانية والزمانية لتفعيل مبصرة، والمشبك الشريط بين خلايا مستقبلة للضوء والخلايا العصبية من الدرجة الثانية قرر نقل المصب من المعلومات البصرية. إعداد شريحة الرأسي للشبكية الثدييات هو أداة قيمة للغاية لدراسة معالجة الإشارات في مسارات العمودي، أي بين خلايا مستقبلة للضوء والخلايا القطبين، وبين خلايا ثنائية القطب وبعض أنواع الخلايا عديم الاستطالات 1، 2، 3، 4.
ومع ذلك، باجتزاء الرأسي يسبب دائما اقتطاع شديد في مجالات شجيري من العديد من الخلايا العصبية للشبكية، مما أدى إلى خسائر كبيرة في الاتصالات متشابك. خاصة في شبكية العين الخارجية، وتتأثر خلايا الأفقية بسبب حقول ممتدة تنتشر أفقيا على شجيري والنظم محطة محور عصبي 5. في رأسيوبالتالي انخفاض إعداد شريحة، ومدخلات متشابك من مئات المحطات مخروط مبصرة لالتشعبات خلية الأفقية على عدد قليل من الاتصالات متفرق. وهذا قد يكون كافيا لدراسة خصائص نقاط الاشتباك العصبي الفردية، ولكنها لا تمثل بأي حال من الأحوال قدرات معالجة الإشارات الكامنة وراء تفعيل متزامنة من نقاط الاشتباك العصبي مبصرة الشريط.
لذا قمنا بتطوير إعداد شريحة الأفقي، مما يترك ما يقرب من جميع مبصرة مخروط مدخلات متشابك إلى التشعبات الخلية الأفقية سليمة وظيفية. الطائرة من يدير باجتزاء موازية لسطح شبكية العين، وقطع مثالي من خلال طبقة النووية الداخلية بين الخلايا الأفقية والخلايا عديم الاستطالات. وهكذا، شرائح أفقية من شبكية العين الخارجي يتم إنشاؤها تحتوي، على الموقع قبل المشبكي، المستقبلات الضوئية مع قطاعات الداخلية والخارجية وكذلك محطات متشابك، والخلايا الأفقية وخلايا القطبين على الموقع بعد المشبكي. هذا المستحضر يناسب جيدا رس التحقيق مدخلات متشابك منسقة في التشعبات الخلية الأفقية جميع مبصرات مخروط داخل مجالها شجيري. ومن ثم قد تكون مفيدة لفهم أفضل للعمل من المشبك مستقبلة للضوء الشريط، وهو أمر حاسم لنقل المعلومات البصرية من المصفوفة تفعيل مستقبلة للضوء في استجابة بعد المشبكي.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا للمبادئ التوجيهية لالتجارب على الحيوانات الصادرة عن جمهورية ألمانيا الاتحادية.
ملاحظة: نظرا لأن أنسجة الشبكية ستكون خالية من الأكسجين خلال أجزاء طويلة من هذا الإجراء، وينبغي إجراء جميع الخطوات من في أسرع وقت ممكن. وينبغي أن تكون الفئران داكنة تكييفها لا يقل عن 3 ساعة قبل تشريح. لتجنب ضوء التكيف من شبكية العين، وإعداد وينبغي أن يتم تشريح تحت ضوء أحمر خافت.
1. إعداد وسائل الإعلام وغيرها من المواد الكيميائية
- إعداد أميس "متوسط 6. بعد التشريح، وتزج الأنسجة الشبكية في المتوسطة أميس "في جميع الأوقات.
- حل 2.2 غرام من أميس "المتوسطة و 298 HEPES ملغ في 250 مل من الماء المقطر. فإن تركيز HEPES يكون 5 ملم. يحرك برفق حتى يتم حل جميع الجزيئات.
- فقاعة أميس "متوسط في درجة حرارة الغرفة مع كربوجين (95٪ أكسجين و 5٪ للسياراتثنائي أكسيد) لمدة 5 دقائق على الأقل. كربوجين العرض مع ماصة باستير الزجاج إلى الحل. توصيل ماصة باستور عبر أنابيب المناسب للمخرج منظم الغاز.
- إضافة 475 ملغ من الصوديوم وبيكربونات إلى الحل. إضافة بيكربونات بعد محتدما يمنع ترسيب كربونات الكالسيوم.
- إعداد درجات حرارة منخفضة التبلور الاغاروز. مطلوب الاغاروز مبنية من أنسجة الشبكية خلال باجتزاء vibratome.
- حل 180 ملغ الاغاروز في 9 مل أميس "متوسطة و 1 مل من الماء المقطر. استخدام الميكروويف لتسخين ببطء الحل الاغاروز حتى يتم حل جميع المواد الصلبة. الحرارة في 5-10 زيادات ثانية لتجنب تجاوز. وينبغي أن يكون الحل واضح وشفاف.
- مخزن حل الاغاروز في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة الإجراء.
2. إعداد Vibratome
ملاحظة: تم تنفيذ جميع باجتزاء بها معالمدرجة vibratome في جدول المواد. تشير إعدادات نظرا لهذا النوع من vibratome فقط. لمزيد من التفاصيل على vibratome باجتزاء الأنسجة العصبية يرجى الرجوع إلى مرجع 7.
- وضع vibratome شفرة حاقن إلى حامل شفرة.
- قياس انحراف العمودي للشفرة مع جهاز "vibrocheck". استخدام المسمار التعديل على حامل شفرة لإمالة شفرة حتى يصبح موازيا لطائرة قطع. تحديد المواقع الدقيق للشفرة ضروري لمنع الآثار الستائر على قسم السطحية ولإنتاج قسم شقة التي تحتوي على الخلايا الحية على سطحه.
- تعيين vibratome إلى الإعدادات التالية: السعة، 1.00؛ سرعة، 0.20؛ سمك، 180-200 ميكرون.
3. تشريح شبكية العين الفأر
- تخدير الكبار C57BL / 6 الماوس عن طريق تبخير حوالي 1 مل الأيزوفلورين في حاوية محكمة الغلق. عندما التخدير الكامل، الموت ببطء الحيوانية خلع عنق الرحم. اليجب أن الماوس لا يكون مضى عليها أكثر من 3 أشهر، وإلا فإن نوعية شرائح سوف تتدهور.
- إزالة كرة العين عن طريق وضع ملقط المنحني تحت العين. رفع بلطف صعودا كرة العين وفضح العصب البصري. قطع العصب البصري مع مقص الربيع ونقل كرة العين إلى طبق بتري 35 ملم تحتوي على 2 مل أميس "متوسط.
- تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة على مرحلة مجهر ستيريو. ضبط التكبير إلى قيمة التي تسمح المراقبة البصرية المثلى من الإجراءات التالية (الخطوات 3،4-3،9).
- ثقب القرنية في الانتقال إلى الصلبة مع ملقط وأشار أو إبرة 20 G. خلال هذه الخطوة، ثابت كرة العين مع ملقط آخر. يجب الحرص على عدم تلف شبكية العين مع الجهاز تعطيب.
- إدراج مقص الربيع في حفرة صغيرة في الخطوة 3.3 و قطع دائرة حول القرنية. مرة أخرى، ثابت كرة العين مع ملقط بينما القطع. الحفاظ على شق قريبة جدا من السطح حتى لا جحزب التحرير في شبكية العين.
- إزالة بعناية القرنية، العدسة، والجسم الزجاجي مع ملقط. ويتألف الجسم الزجاجي سوى طبقة رقيقة شفافة في الجزء الخلفي من العين. ومع ذلك، فمن الضروري لvibratome باجتزاء أن الجسم الزجاجي وإزالة تماما.
- في طبق بتري، ضع فنجان العين في الطريقة التي ينظر المرء من خلال ثقب أسفل على شبكية العين. يجب أن تتكون على حافة افتتاح الأنسجة الصلبة فقط. إذا تم تنفيذ قطع دائرية (الخطوة 3.4) من أصل قريبة جدا من خط الاستواء من فنجان العين، ونسيج الشبكية أيضا أن تكون موجودة على مقربة من شق. كن حذرا ثم لا يلحق الضرر شبكية العين في الخطوة 3.8.
- انتزاع الصلبة مع ملقط والمسيل للدموع بعناية الأنسجة عن بعضها البعض. ومن الضروري عدم تمزق شبكية العين خلال هذه الخطوة. إذا لزم الأمر، فصل شبكية العين من مشرشر أورا التي كتبها مستقرا الجزء الصلبة من النسيج مع ملقط وتقشير بعناية قبالة شبكية العين مع ملقط الأخرى. الحفاظ على ملقط مغلقة. أبدا التعامل مع إعادةتينا مع ملقط منذ أنسجة لينة جدا وسوف تفسح المجال فورا.
ملاحظة: في هذه الخطوة، وسيتم ربط شبكية العين وبقية فنجان العين فقط على رأس العصب البصري. - قطع موقع المرفق على رأس العصب البصري مع مقص الربيع. شبكية العين وينبغي الآن تطفو بحرية كقطعة واحدة من الأنسجة في أميس "متوسط.
- قطع شبكية العين إلى 4-6 مستطيلات صغيرة من حوالي 23 ملم باستخدام شفرة مشرط المنحنية من خلال عقد شبكية العين على طول حواف مع ملقط، للتلاعب في الموقف. تجنب معسر الأنسجة الشبكية داخل المستطيلات. خذ قطعة من الأجزاء الوسطى من الشبكية، وليس محيط بكثير.
- نقل قطع الشبكية مع ذات القطر الكبير باستور البلاستيك ماصة إلى 35 مم طبق بتري البلاستيكية، تم استبدال الجزء السفلي منها عن طريق شبكة مع حجم الشبكة أقل من 1 ملم. إصلاح طبق بيتري في الثلث الأعلى من كوب أو مخروطي قارورة وغمر أجزاء الشبكية في بو متوسطة أميس "bbled مع كربوجين.
4. تضمين من الشبكية قطع في الاغاروز
- نقل بعناية 2-3 قطع الشبكية إلى 35 مم طبق من البلاستيك بيتري جنبا إلى جنب مع بعض من أميس "متوسط. هو الأكثر ملاءمة لاستخدام ذات القطر الكبير باستور البلاستيك ماصة للنقل. في هذه الخطوة، والتوجه الدقيق للقطع في الشبكية لا يهم.
- إزالة أكبر قدر ممكن من أميس المتبقية "المتوسطة مع ماصة باستير الزجاج. في أقرب وقت كما تمت إزالة السوائل المضي قدما في خطوة 4.3. لا تدع الأنسجة الجافة في شبكية العين.
- تغطية مباشرة قطع الشبكية مع 2 مل من حل الاغاروز (37 درجة مئوية). ونظرا لحجم المذكورة في الخطوة 3.10، والقطع لا عقص داخل الاغاروز.
- ضمن الاغاروز السائل، ودفع بلطف قطع الشبكية في الجزء السفلي من طبق بتري. طبقة الخلايا العقدية يجب أسفل. استخدام المجهر ستيريو لحكم الموضع الدقيق. لتحديد المواقع، والتعامل مع بي الشبكيةاللجنة الاقتصادية لأوروبا مع ملعقة صغيرة. ضع الشبكية بأسرع ودقيقة بقدر الامكان لان الاغاروز سوف يصلب بسرعة.
- ترتيب قطع الشبكية موازية لقاع الطبق الزجاجي. خلاف ذلك أقسام ستكون عرضية أو مائلة. ينبغي أن القطع الفردية لا تلمس بعضها البعض، ولكن أيضا يجب أن لا تكون بعيدة جدا عن بعضها البعض. في محاولة لوضع قطع الشبكية أكثر أو أقل على مستوى أفقي واحد.
- وضع الزجاج طبق بتري مع قطع الشبكية جزءا لا يتجزأ في الثلاجة (4-6 درجة مئوية) لمدة 2 دقيقة على الأقل. هذا وسوف تتصلب بسرعة الاغاروز لمزيد من المعالجة. بمجرد الاغاروز تمت بلمرة المضي قدما في الخطوة التالية.
5. تركيب الشبكية قطع
- إزالة بعناية كتلة agarose تحتوي على قطع الشبكية من طبق بتري. استخدام ملعقة أو جهاز مماثل لرفع كتلة الاغاروز من الزجاج. بسبب القوى لاصقة، وهذا يمكن أن تتحول إلى أن تكون صعبة للغاية. ومع ذلك، تجنب كسركتلة الاغاروز. تنفيذ هذا وجميع الخطوات اللاحقة في درجة حرارة الغرفة.
- وضع كتلة agarose ساترة على الزجاج وضبط حجمها بشفرة المشرط. ترك 1-2 ملم من الاغاروز على كل جانب من القطع الشبكية. الحجم النهائي للكتلة وينبغي أن يكون حول 1066 ملم (10 ملم يشير إلى ارتفاع الكتلة، 6 ملم لطول حافته).
- الغراء كتلة agarose لصاحب عينة من vibratome باستخدام لاصق لحظة. يجب أن يكون موجودا قطع الشبكية في الجزء العلوي من كتلة ارتفاع 10 مم وموازية موجهة إلى السطح، في حين يتم تثبيتها أسفل إلى حامل.
- تغطية كتلة فورا بصب أميس فقاعات سابقا "المتوسطة في علبة عازلة للvibratome.
6. إعداد أقسام أفقية Vibratome
- بدء باجتزاء. في البداية، تعيين سمك تشريح يدويا من حتى تظهر أجزاء من أنسجة الشبكية في شريحة. ثم تغيير إعدادات في الخطوة 2.3. منذالماوس شبكية العين ليست سوى حوالي 200 ميكرون سميكة، وسوف يكون هناك أكثر من 2-3 شرائح في كتلة الاغاروز.
- إزالة أجزاء من علبة عازلة بقضيب الزجاج ونقلها إلى 2 مل أميس "المتوسطة في 35 مم طبق بيتري.
- متجر أقسام فورا في حاضنة عند 37 درجة مئوية (5٪ CO 2/55٪ O 2). فإن الاغاروز المحيطة أقسام تبقى راسخة في الحاضنة، ويمكن استخدامها للتعامل مع أقسام دون الإضرار شبكية العين. يتم الحصول على أفضل جودة شريحة عند تخزين عند 37 درجة مئوية داخل الغلاف الجوي منهما مقارنة متوسط الاوكسيجين أميس "في RT. أقسام يمكن استخدامها على الفور أو يمكن تخزين ما يصل إلى 4 ساعات في الحاضنة مع النتائج الفسيولوجية جيدة.
- تضمين قطع الشبكية المقبلة في الاغاروز وتكرار أقسام 4-6.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في شرائح أفقية من شبكية العين الماوس، يمكن تحديد أجسام الخلايا الأفقية بسهولة وفقا لالتشكل فريدة من نوعها مع العديد من التشعبات الأولية الناشئة من المضلع خلايا الجسم (الشكل 1A). وكانت أجسام الخلايا الأفقية الموجودة بالقرب من سطح شريحة يمكن الوصول إليها بشكل روتيني لأقطاب التصحيح، المشبك. خلال التسجيلات، امتلأت الخلايا مع صبغة الفلورسنت، وكشف عن تشجر شجيري المعقدة، والتي تشبه كثيرا مورفولوجيا الخلايا الحاملة للمحور عصبي الأفقي...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وعلى النقيض من شرائح عمودية، مورفولوجيا شجيري من الخلايا العصبية الموجهة شعاعيا مثل الخلايا الأفقية وخلايا عديم الاستطالات والحفاظ عليها جيدا. مقارنة الاستعدادات شبكية العين بأكملها، هذين النوعين من الخلايا يمكن الوصول إليها بسهولة لالميكروية ويمكن دراستها من قبل كل من التقنيات الكهربية والتصوير. هنا، ركزنا على شبكية العين الخارجي؛ ومع ذلك، فقد تم الإبلاغ عن نهج مماثل خاصة بالنسبة للخلايا عديم الاستطالات الشبكية الداخلية 10.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG FOR701 و FE464 / 11-1 to A.F. يريد المؤلفون الاعتراف بالمساعدة الفنية الممتازة التي قدمها أندريا نيرز.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أميس متوسط | سيجما | A1420 | |
| بيكربونات الصوديوم | سيجما | S5761 | |
| هيبس | سيجما | H3375 | |
| كربوجين | الهواء | ||
| الاغاروز | سيجما | A9045 | |
| 35 ملم طبق بتري (بلاستيك) | Nunc Thermofisher | 150318 | |
| زجاج بتري طبق | كيمولين | 50-1470-40 | |
| إيزوفلوران | مستشفى | ||
| شفرة حاقن Vibratome | Biosystems | 39053250 | |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT1200 | |
| Vibrocheck | Leica Microsystems | ||
| حمام مائي بالميكروويف | |||
| ملقط | |||
| 20 جرام إبر | |||
| مقص | |||
| شفرات | |||
| مجهر | |||
| بلاستيك باستور ماصة | |||
| زجاجية باستور |
المراجع
- DeVries, S. H., Li, W., Saszik, S. Parallel processing in two transmitter microenvironments at the cone photoreceptor synapse. Neuron. 50, 735-748 (2006).
- Jackman, S. L., et al. Role of the synaptic ribbon in transmitting the cone light response. Nature Neuroscience. 12 (3), 303-310 (2009).
- Rabl, K., Cadetti, L., Thoreson, W. B. Kinetics of exocytosis is faster in cones than in rods. J. Neurosci. 25 (18), 4633-4640 (2005).
- Singer, J. H., Lassová, L., Vardi, N., Diamond, J. S. Coordinated multivesicular release at a mammalian ribbon synapse. Nature Neuroscience. 7 (8), 826-833 (2004).
- Peichl, L., González-Soriano, J. Morphological types of horizontal cell in rodent retinae: a comparison of rat, mouse, gerbil, and guinea pig. Vis. Neurosci. 11, 501-517 (1994).
- Ames, A., Nesbett, F. B. In vitro retina as an experimental model of the central nervous system. J. Neurochem. 37 (4), 867-877 (1981).
- Mathis, D. M., Furman, J. J., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. J. Vis. Exp. (49), (2011).
- Peichl, L., Sandmann, D., Boycott, B. B. Comparative anatomy and function of mammalian horizontal cells. Development of the Retina. , Plenum Press. New York. (1998).
- Feigenspan, A., Babai, N. Functional properties of spontaneous excitatory currents and encoding of light/dark transitions in horizontal cells of the mouse retina. Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2615-2632 (2015).
- Enoki, R., Jakobs, T. C., Koizumi, A. Horizontal slice preparation of the retina. J. Vis. Exp. (1), e108(2006).
- Babai, N., et al. Functional roles of complexin3 and complexin4 at mouse photoreceptor ribbon synapses. J. Neurosci. 36, 6651-6667 (2016).
- Thoreson, W. B. Horizontal slices of mouse retina expose horizontal cells and their properties (Commentary on Feigenspan & Babai). Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2613-2614 (2015).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
