مقالة منهجية

استهدفت البلازما غشاء تسليم ومسعور الشحن مغلف في الكريستال السائل الجسيمات النانوية الناقل

7.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/55181

⸱

فبراير 8, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Center for Biomolecular Science and Engineering, Naval Research Laboratory, 2Optical Sciences Division, Naval Research Laboratory, 3Sotera Defense Solutions

في هذه المقالة

ملخص

واستغلت الكريستال السائل جسيمات متناهية الصغر (LCNP) nanocarrier كوسيلة لإيصال تسيطر عليها شحنة مسعور إلى غشاء البلازما من الخلايا الحية.

الملخص

والتسليم المراقب وكلاء المخدرات / التصوير للخلايا هو أمر حاسم لتطوير علاجات ولدراسة العمليات الإشارات الخلوية. في الآونة الأخيرة، وقد أظهرت النانوية (NPS) وعد كبير في تطوير نظم تسليم مثل هذه. هنا، وقد تم استخدام الكريستال السائل NP (LCNP) نظام تسليم المستندة للالتسليم المراقب صبغة غير قابلة للذوبان في الماء، 3،3'-dioctadecyloxacarbocyanine فوق كلورات (ديو)، من داخل نواة NP إلى المنطقة مسعور من البلازما غشاء طبقة ثنائية. خلال توليفة من مصادر القدرة النووية، تأسست الصبغة بكفاءة في صلب LCNP مسعور، وهو ما أكدته التحاليل الطيفية متعددة. الإقتران من مضاد للفيروسات الكولسترول مشتق إلى السطح NP (ديو-LCNP-PEG-تشول) تمكين الربط من مصادر القدرة النووية محملة صبغ إلى غشاء البلازما في كلوة 293T / 17 الخلايا. ليزر المسح المجهري متحد البؤر وفورستر نقل الطاقة الرنين وقت حل (الحنق) التصوير وأكد الممرإيف هروب رأس المال من ديو من صميم LCNP واندماجها طبقة ثنائية غشاء البلازما. وأخيرا، تقديم ديو باعتباره LCNP-PEG-تشول الموهن السمسة ديو. شكل NP ديو عرضت ~ 30-40٪ أقل سمية مقارنة ديو تسليمها خالية من حل الجزء الأكبر. يوضح هذا النهج فائدة منصة LCNP كما طريقة فعالة لإيصال غشاء محددة وتعديل من الشحنات الجزيئية مسعور.

المقدمة

منذ ظهور تفاعل المواد النانوية (المواد ≤100 نانومتر في بعد واحد على الأقل) مع الخلايا الحية، وكان هدف الاستمرار في الاستفادة من خصائص فريدة من نوعها تعتمد على حجم الجسيمات النانوية (NPS) لمختلف التطبيقات. وتشمل هذه التطبيقات الخلايا والأنسجة وصفها / التصوير (على حد سواء في التجارب المختبرية والحية)، والاستشعار في الوقت الحقيقي، والتسليم المراقب للمخدرات وغيرها من الشحنات 1. ومن أمثلة هذه الخصائص NP ذات الصلة انبعاث تعتمد على حجم البلورات النانوية أشباه الموصلات (النقاط الكمومية، نقاط الكمية)؛ خصائص ضوئي؛ ضوحراري من جزيئات الذهب. قدرة التحميل كبيرة من جوهر مائي من الجسيمات الشحمية. والتوصيل الباليستية من المتآصلة الكربون، مثل الأنابيب النانوية الكربونية جدار واحد والجرافين.

وفي الآونة الأخيرة، ظهرت فائدة كبيرة في استخدام مصادر الطاقة النووية للتعديل تسيطر المخدرات والبضائع الأخرى، مثل التباين / التصوير لأيها السادة. هنا، فإن الأساس المنطقي هو أن يعزز إلى حد كبير / تحسين الذوبان الكلي، جرعة تسليمها، وقت الدورة الدموية، وإزالة في نهاية المطاف من شحن المخدرات من خلال تقديم أنها صيغة NP. وجاء ذلك ليكون المعروفة باسم تسليم المخدرات بوساطة NP (NMDD)، وهناك حاليا سبع وافقت ادارة الاغذية والعقاقير التركيبات الدوائية NP لاستخدامها في عيادة لعلاج مختلف أنواع السرطان ومئات أخرى في مراحل مختلفة من التجارب السريرية. في جوهرها، والهدف من ذلك هو "تحقيق المزيد بموارد أقل." وهذا هو، لاستخدام NP كما سقالة لتقديم المزيد من المخدرات مع الإدارات الجرعات أقل من خلال الاستفادة من مساحة كبيرة: حجم (على سبيل المثال، والجسيمات الصلبة، مثل نقاط الكمية وأكاسيد المعادن) من مصادر القدرة النووية أو حجم الداخلية كبيرة من أجل تحميل حمولات شحن كبيرة (على سبيل المثال، الجسيمات الشحمية أو المذيلات). والغرض هنا هو للحد من ضرورة لعدة الجرعات تسليمها بشكل منتظم وفي الوقت نفسه تعزيز الاستقرار المائي وتعزيز الدورة الدموية، وخاصة بالنسبة للتحدي الشحنات المخدرات مسعور أنه في حين فعالة للغاية، القابلة للذوبان لماما في الأوساط المائية.

وهكذا، كان الهدف من العمل الموصوفة هنا لتحديد إمكانية استخدام رواية NP سقالة للتسليم محددة ورقابة من الشحنات مسعور إلى محبة للدهون طبقة ثنائية غشاء البلازما. كان الدافع للعمل ذوبان محدود الكامنة وصعوبة في إيصال الجزيئات الكارهة للماء إلى خلايا من الأوساط المائية. عادة، وتسليم هذه الجزيئات الكارهة للماء يتطلب استخدام المذيبات العضوية (على سبيل المثال، دمس) أو السطحي محبة للجهتين (على سبيل المثال، Poloxamers)، التي يمكن أن تكون سامة وتسوية الخلايا والأنسجة الحيوية 2، أو ناقلات مذيلة، الذي يمكن أن يكون محدودا تحميل الداخلي القدرات. كان الناقل NP اختار هنا رواية الكريستال السائل NP (LCNP) صياغة وضعت من قبل 3 والتي أثبتت في السابق لتحقيق ~ 40 أضعاف التحسن في كفاءة دوكسوروبيسين المخدرات المضادة للسرطان في الخلايا المستزرعة 4.

في العمل الموصوفة هنا، كانت البضائع تمثيلية اختيار الجهدية غشاء صبغ، 3،3'-dioctadecyloxacarbocyanine فوق كلورات (ديو). ديو هو صبغة غير قابلة للذوبان المياه التي استخدمت لتقدمي والبحث عن المفقودين إلى الوراء في المعيشة والخلايا العصبية ثابتة، غشاء القياسات المحتملة، وغشاء العام وسم 5، 6، 7، 8، 9. نظرا لطبيعتها مسعور، وعادة ما أضاف ديو مباشرة إلى الطبقات الوحيدة أو أنسجة الخلايا في شكل بلوري 10، أو المحتضنة ذلك بتركيزات عالية جدا (~ 1-20 ميكرون) بعد التخفيف من محلول المخزون تركيز 11 و 12.

محتوى "> هنا، كان نهج استخدام للمنصة LCNP، وأدرجت NP متعدد الوظائف الذي الداخلي الأساسي هو مسعور تماما والتي السطح هو ماء وقابلة للbioconjugation في وقت واحد، وسيلة لتسليم ديو. ديو في صلب LCNP خلال التوليف ، وسطح NP ثم يتم functionalized مع الكوليسترول شاردة مضاد للفيروسات لتعزيز غشاء ملزمة للفرقة ديو-LCNP إلى غشاء البلازما. أدى هذا النهج في نظام التسليم التي تقسم ديو في غشاء البلازما مع قدر أكبر من الدقة والإقامة الغشاء الوقت من شكل خال من ديو تسليم من حل الجزء الأكبر (ديو مجاني). وعلاوة على ذلك، أظهرت هذه الطريقة أن تسليم بوساطة LCNP ديو ينظم بشكل كبير ويدفع معدل تقسيم معين من الصبغة في محبة للدهون طبقة ثنائية الغشاء البلازمي، وهذا هو تحقق مع الحد بصورة متزامنة والسمية الخلوية للخال من المخدرات التي كتبها ~ 40٪ عن طريق تقديم أنها صيغة LCNP.

الحمار = "jove_content"> ومن المتوقع أن المنهجية الواردة في هذه الوثيقة ستكون قوية تقنية تمكن للباحثين الذين ينطوي أو يتطلب تسليم الخلوي من الشحنات مسعور للغاية القابلة للذوبان لماما أو غير قابلة للذوبان تماما في محلول مائي العمل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد ديو-LCNP وديو-LCNP-PEG-تشول

  1. حل السائل البلوري diacrylate عبر ربط وكيل (DACTP11، 45 ملغ)، 3،3'-dioctadecyloxacarbocyanine فوق كلورات (ديو، 2 ملغ)، والبادئ الجذور الحرة (azobisisobutyronitrile، 1 ملغ) عن البلمرة في 2 مل من الكلوروفورم. هذا إضافة إلى محلول مائي السطحي-functionalized اكريليت (AC10COONa، 13 ملغ في 7 مل).
  2. يحرك الخليط لمدة 1 ساعة ويصوتن في 80٪ السعة لمدة 5 دقائق لإنتاج miniemulsion تتكون من قطرات صغيرة من المواد العضوية التي تحيط بها السطحي polymerizable في الماء.
  3. حرارة الخليط إلى 64 درجة مئوية في حمام الزيت لبدء البلمرة كل من وكيل عبر ربط والسطحي مثل الكلوروفورم يتبخر ببطء، وترك تعليق NP ديو المحتوية على أن يستقر بها السطحي.
  4. تصفية تعليق NP (3 مرات) من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرون لإزالة أي التجميع. ستوإعادة الحل NP تصفيتها في 4 درجات مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
  5. تصريف PEG-تشول إلى ديو-LCNP عبر اقتران EDC.
    1. حل تشول-PEG-NH 2 · حمض الهيدروكلوريك (PEG-تشول، 0.9 ملم) في 25 ملي العازلة HEPES (7.0 درجة الحموضة).
    2. إعداد محلول العمل التي تحتوي على N-هيدروكسي sulfosuccinimide ملح الصوديوم (المرافق الوطنية للهيدرولوجيا، 40 ملم) و 1 إيثيل-3- (3- (dimethylamino) -propyl) carbodiimide هيدروكلوريد (EDC، 400 ملم) في المخزن HEPES من الحلول الأسهم المركزة.
    3. على الفور إضافة 20 ميكرولتر من محلول العمل الطازجة المرافق الوطنية للهيدرولوجيا / EDC إلى 1.0 مل من ديو-LCNP في المخزن HEPES ويقلب لمدة 5 دقائق.
    4. إضافة 20 ميكرولتر من محلول المخزون من تشول-PEG-NH 2 · حمض الهيدروكلوريك إلى هذا الخليط ويقلب لمدة 2 ساعة.
    5. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة خليط التفاعل في أقصى سرعة (~ 2000 x ج) لمدة 30 ثانية باستخدام أجهزة الطرد المركزي الطاولة صغير وتمرير طاف من خلال PD-10 حجم الإقصاء اللوني العمود 13 معايرتها معDulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (DPBS، 0.1X).

2. توصيف ديو-LCNP وديو-LCNP-PEG-تشول

  1. تأكيد نجاح الاقتران التساهمية PEG-تشول إلى السطح ديو-LCNP بواسطة الكهربائي للهلام.
    1. حل 0.5 غرام من الاغاروز في 50 مل (1X) من الكهربي تريس-بورات (TBE و 89 ملي تريس (الرقم الهيدروجيني 7.6)، 89 ملم حمض البوريك، و 2 ملي EDTA) العازلة. الحرارة الحل في فرن الميكروويف لإذابة الاغاروز. يسمح الحل ليبرد قليلا وتصب محتوياتها في لوحة هلام في المربع الكهربائي. إدراج مشط هلام لإنشاء آبار العينة.
    2. مرة واحدة وقد عززت هلام، إضافة المبلغ المطلوب (ما يكفي لغمر هلام في الغرفة) من TBE العازلة على التوالي إلى الغرفة.
    3. إضافة 35 ميكرولتر من عينة ديو-LCNP (المعدل مع الجلسرين، 5٪ ت / ت) لآبار جل وتشغيل لمدة 20 دقيقة في الجهد 110 V.
    4. صورة هلام باستخدام واي هلام نظام التصويرال الإثارة وانبعاث المرشحات في 488 نانومتر، و500-550 نانومتر، على التوالي.
  2. تقييم حجم الجسيمات والتوزيع التي تشتت الضوء الحيوي (DLS) عن طريق تمييع الحل ديو-LCNP (تخفيف ~ 200 أضعاف) في برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني ~ 8، 0.1X) وقياس على صك DLS 14. قياس زيتا-إمكانات ديو-LCNPs باستخدام زيتا أداة قياس المحتملين المناسب.

3. إعداد خلية أطباق الثقافة للتجارب تسليم والتصوير

ملاحظة: يتم تنفيذ العلامات ديو-LCNP على كلوة 293T / 17 خلايا الكلى الجنينية البشرية (بين الممرات 5 و 15) التي هي مثقف كما هو موضح سابقا (4). إجراء التجارب تسليم والتصوير الخلية لاحقا كما هو موضح أدناه.

  1. إعداد أطباق زراعة الأنسجة قطرها 35 ملم (مزودة 14 ملم إدراج رقم 1 ساترة) من قبل طلائها مع فبرونيكتين البقري (~ 100 ميكرولتر في تركيز 20 ميكروغرام/ مل) في DPBS لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية.
  2. إزالة حل فبرونيكتين الطلاء من الطبق الثقافة. حصاد كلوة 293 T1 / 7 خلايا من القارورة T-25 عن طريق الغسيل الأول أحادي الطبقة الخلية مع 3 مل من DPBS ثم بإضافة 2 مل من التربسين-EDTA (0.5٪ التربسين 0.25٪ EDTA).
  3. احتضان القارورة عند 37 درجة مئوية لمدة ~ 3 دقائق. إزالة التربسين-EDTA والعودة القارورة إلى حاضنة. مرة واحدة يتم فصل الخلايا من القارورة، تحييد التربسين بإضافة 4 مل من المتوسط ​​الشامل (Dulbecco لتعديل النسر المتوسط؛ DMEM، المعدل لاحتواء 10٪ مصل الجنين البقري، 5٪ البيروفات الصوديوم، و 5٪ مضاد حيوي / مضاد فطري) إلى قارورة . تحديد تركيز خلية في التعليق من اعدهم في عداد الخلية.
  4. ضبط تركيز الخلية إلى ~ 8 × 10 4 خلية / مل مع متوسط نمو. إضافة 3 مل من خلية إلى تعليق الطبق والثقافة في الحاضنة بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، وينبغي أن تكون الخلايا في ~ 70٪ confluency وينبغي أن تكون جاهزة للاستخدام. كافكثافة الخلية هو أمر حاسم لوضع العلامات قوي وفعال من نسبة عالية من الخلايا.

4. التسليم الخلوي ديو وديو-LCNPs والتصوير من الخلايا الثابتة

  1. إعداد 1 مل حلول ديو، ديو-LCNP، وديو-LCNP-PEG-تشول في المتوسط تسليم (HEPES-DMEM؛ DMEM تحتوي على 25 ملي HEPES) عن طريق تمييع الحلول الأسهم ديو الحرة وديو-LCNPs. وتركيزات ديو مناسبة لحضانة على الخلايا أن يكون ~ 1-10 ميكرومتر (معبرا عنها إما تركيز ديو الحرة أو ديو في شكل ديو-LCNP).
  2. إزالة المتوسطة النمو من الأطباق الثقافة باستخدام ماصة المصلية وغسل الطبقات الوحيدة الخلية (راجع الخطوة 3) مرتين مع HEPES-DMEM (2 مل كل غسل). أداء يغسل بإضافة بلطف وإزالة HEPES-DMEM باستخدام ماصة إلى / من على حافة الأطباق.
  3. إضافة 0.2 مل من ديو حلول خالية أو ديو-LCNP تسليم مستعدة لمركز أطباق ثقافة والعودة الأطباق إلى طncubator لفترة مناسبة من الوقت (عادة 15 أو 30 دقيقة، اعتمادا على احتياجات التجربة). حضانة مرات أطول إضافة إلى وضع العلامات الخلوي أكثر غير محدد من مجالات غير غشائي (على سبيل المثال، العصارة الخلوية).
  4. بعد فترة الحضانة، وإزالة الحلول تسليم باستخدام ماصة المصلية. غسل الطبقات الوحيدة الخلية مرتين مع DPBS (2 مل كل غسل). أداء يغسل بإضافة بلطف وإزالة DPBS إلى / من على حافة الطبق.
  5. إصلاح الطبقات الوحيدة الخلية باستخدام بارافورمالدهيد 4٪ (المعد في DPBS) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    تنبيه: لامتصاص العرق غير قابل للاشتعال، مهيج الجهاز التنفسي، ويشتبه بأنها مسرطنة.
  6. إزالة حل لامتصاص العرق باستخدام ماصة، ويغسل بلطف الخلايا 1 مرة مع DPBS (2 مل) من خلال إضافة وإزالة DPBS باستخدام ماصة لل/ من على حافة الأطباق.
  7. الخلايا الثابتة هي جاهزة للتصوير لوجود إشارة مضان الغشائي باستخدام المسح الضوئي ليزر متحد البؤرالمجهري (CLSM). إجراء التصوير على الفور، أو بدلا من ذلك، استبدل المتوسطة مع DPBS تحتوي على 0.05٪ نان 3 وتخزين الأطباق في 4 درجات مئوية.
    تنبيه: نان 3 غير سامة. توخي الحذر الشديد عند استخدام نان 3.
    ملاحظة: الثابتة العينات المخزنة بهذه الطريقة يجب تصويرها خلال 48 ساعة من أجل تحقيق النتائج المثلى.

5. التسليم الخلوي ديو وديو-LCNPs والحنق التصوير في الخلايا الحية

ملاحظة: في هذه الطريقة، colabeled الخلايا مع 6 ميكرومتر كل ديو-LCNP-PEG-تشول (حيث ديو هو المانحة الحنق) و1،1'-dioctadecyl-3،3،3 "، بيركلورات 3'-tetramethylindocarbocyanine (صلاح الغيدان مجانا، حيث الجاذبة هو متقبل الحنق). ويؤكد الافراج عن ديو من ديو-LCNP-PEG-تشول وإدماجه في غشاء البلازما من قبل الزيادة الملحوظة في نقل الطاقة من المانحين ديو إلى متقبل الجاذبة.

  1. خلايا التسمية بالتتابع مع ديو-LCNP-PEG-تشول والجاذبة الصحائفالبريد باستخدام الطريقة الموضحة في الخطوة 4.
  2. بعد التلوين، وغسل الخلايا 1 مرة مع DPBS (2 مل) باستخدام ماصة المصلية واستبدال غسل العازلة مع 2 مل من محلول التصوير الخلية الحية (LCIS).
  3. على خشبة المسرح المجهر مجهزة غرفة الحضانة ساخنة، صورة عينة الخلايا الحية باستخدام المجهر متحد البؤر (الهدف 60X) مع تكوين الحنق التصوير في 30 فترات دقيقة على مدى 4 ساعات بواسطة مثير المتبرع ديو في 488 نانومتر، وجمع الانبعاثات الكامل أطياف من كل من الجهات المانحة ديو ومتقبل الجاذبة 490-700 نانومتر مع الطيف للكشف عن 32 قناة.
  4. ملاحظة: للحصول على مزيد من المعلومات حول التصوير الحنق، يرجى أنظر المرجع 15.
  5. تحديد كثافة الانبعاثات وقت حل كل من الجهات المانحة ديو ومتقبل الجاذبة من خلايا ملطخة ديو-LCNP-PEG-تشول والجاذبة. حساب متقبل / المانحة وقت حل الحنق نسبة (الجاذبة EMI / ديو EMI) للصور، والتي سوف تزيد باطراد، وفي نهاية المطاف لوحةاو مرة واحدة كمية من ديو المانحة قسمت إلى الغشاء قد وصل إلى أقصى 16.

6. السمسة الفحص ديو وديو-LCNPs إلى كلوة 293T / 17 خلايا

ملاحظة: يتم تقييم السمية الخلوية من المواد ديو-LCNP باستخدام انتشار فحص 17 صبغية-نتروبلو. الخلايا المستزرعة في لوحة multiwell في وجود تركيزات مختلفة من المواد في ظل الظروف التي تحاكي التسليم / وضع العلامات. ثم يتم تربيتها الخلايا لمدة 72 ساعة للسماح للانتشار. صبغة (MTS، (3- (4،5-dimethylthiazol-2-YL) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H-نتروبلو) ثم يتم إضافته إلى الآبار، وتنشط عملية الأيض خلايا تحويل الصبغة إلى منتج formazan الأزرق، وكمية من تشكيل اللون يتناسب طرديا مع عدد من خلايا قابلة للحياة.

  1. حصاد كلوة 293 T1 / 7 خلايا من القارورة T-25 عن طريق اتباع الإجراء الموضح في الخطوة 3.2.Seedكلوة 293T 17 خلية / (5000 خلية / 100 ميكرولتر / جيد) إلى آبار لوحة 96-جيدا المعالجة زراعة الأنسجة والثقافة لمدة 24 ساعة.
  2. تماما إزالة وسائل الإعلام والثقافة من الآبار باستخدام micropipette وإضافة 50 ميكرولتر من HEPES-DMEM تحتوي على ديو الحرة، ديو-LCNPs، أو ديو-LCNP-PEG-تشول إلى زيادة تركيزات لتكرار الآبار. احتضان على الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: عادة، ويكرر ذلك في ثلاث نسخ أو quadruplicate كافية لتكشف عن بيانات موثوقة إحصائيا.
    1. بعد الحضانة، وإزالة المتوسطة تسليم تحتوي على مواد باستخدام micropipette واستبدالها مع 100 ميكرولتر من متوسط ​​النمو. ثقافة الخلايا لمدة 72 ساعة.
  3. إضافة 20 ميكرولتر من الركيزة نتروبلو إلى كل بئر، والعودة إلى لوحة الحاضنة، والسماح بتشكيل اللون بالمضي قدما عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. قراءة الامتصاصية (ABS) من الناتج formazan في 570 نانومتر (الدنيا امتصاص لديو-LCNPs المستخدمة في هذا ستودى) و 650 نانومتر (لالطرح الامتصاصية الخلفية غير محددة) باستخدام قارئ وحة microtiter.
  4. رسم القيمة التفاضلية الامتصاصية (القيمة المطلقة 570 - القيمة المطلقة 650) مقابل تركيز المواد وتقديم تقرير عن نتائج كنسبة مئوية من تكاثر الخلايا السيطرة (درجة انتشار الخلايا في خلية ثقافة المتوسط فقط).

تحليل 7. البيانات

  1. إحصائية تحليل البيانات مع تحليل أحادي المتغير التباين (ANOVA). للمقارنات المتعددة، وتطبيق اختبار بونفيروني وخاصة في مرحلة ما بعد. توفير كافة القيم المتوسطة كما ± الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM) مالم يذكر غير ذلك.
    وكانت احتمال مقبول لأهمية ف <0.05: ملاحظة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

أعدت LCNPs التي تم تحميلها جوهر مسعور من NP مع ممثل غشاء وضع العلامات التحقيق لإثبات فائدة من LCNP باعتباره وسيلة فعالة لتقديم الشحنات مسعور. لهذا الغرض، وكانت البضائع اختيار عالية غير قابلة للذوبان في الماء الجهدية غشاء وضع العلامات صبغ، ديو. تم توليفها LCNPs تحميل ديو (ديو-LCNPs) باستخدام تقنية مصغرة مستحلب مرحلتين مع المكونات الكيميائية DACTP11، AC10COONa، وديو، كما هو مبين في الشكل 1 18. في هذا النظام NP، شبكة البوليمر ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هدف استمرار NMDD هو استهداف للرقابة وتسليم التركيبات الدوائية إلى الخلايا والأنسجة، جنبا إلى جنب مع متزامنة تحسين فعالية الدواء. واحد فئة معينة من جزيئات الدواء التي قد يشكلها هذا تحديا كبيرا هو مسعور وكلاء الأدوية / التصوير التي لديها لماما دون الذوبان في الوسط المائي. ابتليت هذه المشكلة الانتقال من المخدرات القوية من في أنظمة زراعة الخلايا في المختبر لإعداد سريرية، وأسفرت عن عدد من جزيئات الدواء واعدة بأنها "على الرف" أو التخلي عنها وعدم متابعتها بشكل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل من قبل برنامج تمويل قاعدة المختبر الوطني المرجعي (وحدة العمل MA041-06-41-4943). معتمد على من قبل المجلس الوطني للبحوث ما بعد الدكتوراه بحوث زمالة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1-إيثيل -3- (3- (ثنائي ميثيل أمينو) - بروبيل) كاربوديميد هيدروكلوريد (EDCA) ThermoFisherE2247
3،3 & رئيس ؛ -ديوكتاديسيلوكساكاربوسيانين بيركلورات (DiO)سيجما ألدريتشD4292-20MGخطرة ؛ صنع محلول مخزون في DMSO
كوليسترول بولي (إيثيلين جلايكول) أمين هيدروكلوريدنانوكس ، إنك.PG2-AMCS-2k
كونتيسة عداد الخلايا الآليThermoFisherC10227
Dioctadecyl-3،3،3 & prime; ⁠,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)Sigma Aldrich468495-100MGDangerousous; جعل حل المخزون في DMSO
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)ThermoFisher21063045دافئ في 37 درجة; C قبل الاستخدام
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)ThermoFisher14040182دافئ في 37 درجة ؛ C قبل الاستخدام
أداة تشتت الضوء الديناميكيZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd. ، Worcestershire ، المملكة المتحدة)
بروتين الأبقار Fibronectin ، PlasmaThermoFisher33010018اصنع محلول مخزون 1 مجم / مل باستخدام DPBS. استخدم 20-30 & جم / مل لطلاء طبق MetTek ، 2 ساعة عند 37 درجة ؛ C
الفورمالديهايد (16٪ ، W / V)ThermoFisher28906خطير. مخفف إلى 4٪ باستخدام
خلايا الكلى الجنينية البشرية DPBS (HEK 293T / 17) مجموعةالثقافة من النوع الأمريكيATCC & reg ؛ CRL-11268 ™
حل تصوير الخلايا الحية (LCIS)ThermoFisherA14291DJدافئ في 37 درجة ؛ C قبل الاستخدام
MatTek 14 مم # 1.0 غطاء زجاجي إدراج طبق ثقافة الخليةشركة MatTekCorporation P35G-1.0-14-C
Modified Eagle Medium (DMEM) يحتوي على 25 ملي مولار HEPESThermoFisher 21063045دافئ في 37 درجة ؛ C قبل الاستخدام
N< / em>-ملح الصوديوم هيدروكسي سلفوسكسينيميد (NHSS)ThermoFisher24510
نيكون A1si المجهر الطيفي متحد البؤرنيكون إنسترومنتس
تريبان بلو داين (0.4٪)  ThermoFisherT10282ك50٪ لتعليق الخلية قبل عد الخلايا
أداة Zeta المحتملةZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd. ، Worcestershire ، المملكة المتحدة)
معالج الموجات فوق الصوتيةSonics and Materials IncGEX 600-5
Mini CetntrifugeBenchmarkMini-fuge-04477
PD-10 Sephadex & trade ؛ G-25 MediumGE Healthcare17-0851-01
Bio-Rad ChemiDoc XRS Imaging SystemBio-RAD76S / 07434
Trypsin-EDTA (0.25٪) ، فينول أحمرThermoFisher25200056
مزيج

المراجع

  1. Nag, O. K., Field, L. D., Chen, Y., Sangtani, A., Breger, J. C., Delehanty, J. B. Controlled actuation of therapeutic nanoparticles: an update on recent progress. Ther. Deliv. 7 (5), 335-352 (2016).
  2. Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO. FASEB J. 28 (3), 1317-1330 (2014).
  3. Spillmann, C. M., Naciri, J., Anderson, G. P., Chen, M. S., Ratna, B. R. Spectral tuning of organic nanocolloids by controlled molecular interactions. ACS Nano. 3 (10), 3214-3220 (2009).
  4. Spillmann, C. M., Naciri, J., Algar, W. R., Medintz, I. L., Delehanty, J. B. Multifunctional Liquid Crystal Nanoparticles for Intracellular Fluorescent Imaging and Drug Delivery. ACS Nano. 8 (7), 6986-6997 (2014).
  5. Timmers, M., Vermijlen, D., Vekemans, K., De Zanger, R., Wisse, E., Braet, F. Tracing DiO-labelled tumour cells in liver sections by confocal laser scanning microscopy. J. Microsc. 208 (Pt 1), 65-74 (2002).
  6. Mufson, E. J., Brady, D. R., Kordower, J. H. Tracing neuronal connections in postmortem human hippocampal complex with the carbocyanine dye DiI. Neurobiol Aging. 11 (6), 649-653 (1990).
  7. Köbbert, C., Apps, R., Bechmann, I., Lanciego, J. L., Mey, J., Thanos, S. Current concepts in neuroanatomical tracing. Prog. Neurobiol. 62 (4), 327-351 (2000).
  8. Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosci. 12 (9), 333-341 (1989).
  9. Gan, W. B., Bishop, D. L., Turney, S. G., Lichtman, J. W. Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye. J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-20 (1999).
  10. Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue. Development. 101 (4), 697-713 (1987).
  11. Ragnarson, B., Bengtsson, L., Haegerstrand, A. Labeling with fluorescent carbocyanine dyes of cultured endothelial and smooth muscle cells by growth in dye-containing medium. Histochemistry. 97 (4), 329-333 (1992).
  12. Korkotian, E., Schwarz, A., Pelled, D., Schwarzmann, G., Segal, M., Futerman, A. H. Elevation of intracellular glucosylceramide levels results in an increase in endoplasmic reticulum density and in functional calcium stores in cultured neurons. J. Biol. Chem. 274 (31), 21673-21678 (1999).
  13. Garrett, R. H., Grisham, C. M. Biochemistry. , 5th, Brooks/Cole Cengage Learning. Belmont, CA. (2013).
  14. Berne, B. J., Pecora, R. Dynamic Light Scattering. , Courier Dover Publications. 41155-41159 (2000).
  15. Kremers, G. J., Piston, D. W., Davidson, M. W. Basics of FRET Microscopy. , http://www.microscopyu.com/articles/fluorescence/fret/fretintro.html (2016).
  16. Chen, H., Kim, S., Li, L., Wang, S., Park, K., Cheng, J. X. Release of hydrophobic molecules from polymer micelles into cell membranes revealed by Förster resonance energy transfer imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6596-6601 (2008).
  17. Campling, B. G., Pym, J., Galbraith, P. R., Cole, S. P. C. Use of the MTT assay for rapid determination of chemosensitivity of human leukemic blast cells. Leukemia Res. 12, 823-831 (1988).
  18. Nag, O. K., Naciri, J., Oh, E., Spillmann, C. M., Delehanty, J. B. Lipid raft-mediated membrane tethering and delivery of hydrophobic cargos from liquid crystal-based nanocarriers. Bioconjug. Chem. 27 (4), 982-993 (2016).
  19. Karve, S., et al. Revival of the abandoned therapeutic wortmannin by nanoparticle drug delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (21), 8230-8235 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

FRET HEK 293T

مقالات ذات صلة