مقالة منهجية

وبسيط خلية الدم الحمراء تحلل طريقة لإنشاء خطوط الخلايا B Lymphoblastoid

DOI:

10.3791/55191

⸱

يناير 14, 2017

 ,  , 
1Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, 2Genetic Resources Center, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم تطوير خلايا الدم الحمراء طريقة تحلل بسيط لإنشاء B-LCLs مع كفاءة عالية تخليد، الأمر الذي يتطلب كمية صغيرة من الدم وتوفير الوقت من بدء لالحفظ بالتبريد.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوجد عدد من الطرق لتحويل الخلايا الليمفاوية البائية بواسطة فيروس إبشتاين بار في المختبر إلى خطوط خلايا خالدة. لقد طورنا طريقة جديدة باستراتيجية قوية وبسيطة لإنشاء B-LCLs ، طريقة تحلل خلايا الدم الحمراء. قامت هذه الطريقة بتبسيط إجراء فصل PBMC مع إزالة خلايا الدم الحمراء ، واستخدمت أقل من 0.5 مل من الدم الكامل لإنشاء خطوط الخلايا الخالدة ب EBV ، والتي يمكن أن تتكاثر إلى أعداد خلايا كبيرة في فترة زمنية قصيرة نسبيا بمعدل نجاح 100٪. هذه الطريقة بسيطة وموثوقة وموفرة للوقت وتنطبق على علاج عدد كبير من العينات السريرية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = 'jove_content'> يمكن تحويل الخلايا البائية المريحة بواسطة فيروس إبشتاين بار (EBV) في المختبر إلى خطوط خلايا أرومية ليمفاوية ب تتكاثر بنشاط (B-LCLs). تتشابه B-LCLs مع الخلايا الجرثومية في التمايز والتطور ، وكان معدل الطفرات الجسدية ل B-LCLs 0.3٪ فقط 1 ، مع تغيير جيني ونمط ظاهري ضئيل. لذلك ، فإن B-LCLs ، كبدائل لخلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMCs) ، قد سرعت بشكل كبير تقدم علم الجينوم والنسخ ودراسة البروتينات للأمراض المرتبطة بEBV 2،3. علاوة على ذلك ، فإن B-LCLs لها أيضا تطبيق مهم في فحص الأجسام المضادة وحيدةالنسيلة 4،5.

< p class = 'jove_content'>تم تطوير عدة طرق لتخليد الخلايا الليمفاوية البائية بواسطة EBV. تشمل الإجراءات الأكثر شيوعا عزل الخلايا الليمفاوية البائية واستخدام خطوط خلايا B95-8 لإنتاج EBV المعدي. من العزلة إلى التحول ، تنقسم هذه الأساليب إلى ثلاث استراتيجيات. يتم فصل الخلايا الليمفاوية عن الدم الطازج عن طريق الطرد المركزي المتدرج للكثافة وتحويل EBV مباشرة6-8 ، والتي تسمى طريقة فصل تدرج الكثافة في هذه الدراسة. ومع ذلك ، فإن تقنيات أخرى تتغلب على صعوبة شحن الدم الطازج وتستخدم إجراء لتجميد الخلايا الليمفاوية المنقاة والذوبان اللاحق وعدوى EBV9-11. يمكن أيضا استخدام الدم الكامل المحفوظ بالتبريد لعزل الخلايا الليمفاوية البائية والتحويل12،13. بالإضافة إلى الطرد المركزي المتدرج للكثافة لفصل الخلايا الليمفاوية البائية ، يستخدم بعض الباحثين فارز الخلايا المغناطيسية لاختيار الخلايا الليمفاويةالبائية 12. ومع ذلك ، فإن الفصل المغناطيسي هو عملية مكلفة ومعقدة وتستغرق وقتا طويلا. على الرغم من أن هذه الطرق مفيدة لتخليد الخلايا الليمفاوية البائية بمعدل نجاح مرتفع ، إلا أن الحاجة إلى علاج عدد كبير من العينات السريرية والحجم الصغير نسبيا من الدم تتطلب طريقة أبسط لإنشاء خط خلوي دائم.

طريقة أخرى أقل استخداما هي استخدام الدم الكامل كمصدر للخلايا المنواة لعدوى EBV وإنشاء B-LCLS. تعمل هذه الطرق على تبسيط التقنية عن طريق حذف إجراء الفصل. يكفي فقط كمية صغيرة من الدم الكامل ، سواء كانتطازجة 14 أو مجمدة15،16 ، للحصول على خطوط الخلايا. لسوء الحظ ، هناك تباين كبير في النجاح من المستندات15 ، 16 والعديد من اختبارات التحقق الخاصة بنا. علاوة على ذلك ، يصعب التعرف على المستعمرات المحولة تحت المجهر بسبب الشوائب الكبيرة الملوثة. وبالتالي ، يلزم وجود طريقة أكثر موثوقية للتحول.

بناء على الاعتبارات المذكورة أعلاه ، قمنا بتطوير طريقة جديدة لإنشاء B-LCLs دون تنقية سابقة للخلايا الليمفاوية ، تسمى طريقة تحلل خلايا الدم الحمراء. هذه الطريقة مريحة وموفرة للوقت وتنطبق على عدد كبير من العينات. كان أقل من 0.5 مل من الدم الكامل كافيا للحصول على B-LCLs التي يمكن الحصول عليها بسهولة من الرضع وكبار السن دون الإضرار بصحتهم بشكل كبير.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات من معهد علم الوراثة وعلم الأحياء التنموي، وبروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية المؤسسية لرفاهية الإنسان.

1. إعداد EB الفيروسات

  1. في يوم 1، ذوبان الجليد B95-8 الخلايا والثقافة في 6 مل كاملة RPMI 1640 المتوسطة، على أن تستكمل مع 10٪ مصل الجنين البقري، 2 مم L-الجلوتامين، والمضادات الحيوية (100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، و 100 U / مل البنسلين) في T25 الثقافة قارورة. ضع قارورة الثقافة في 5٪ CO 2 حاضنة عند 37 درجة مئوية.
  2. في يوم 2، ومراقبة مورفولوجيا الخلايا تحت المجهر. الخلايا هي في حالة جيدة عندما تكون مشرق وجولة. إضافة 10 مل الكامل المتوسط ​​1640 RPMI.
  3. في يوم 4، إضافة 10 مل جديدة كاملة RPMI 1640 المتوسطة، ومن ثم نقل إلى قارورة ثقافة T75.
  4. في يوم 8، إضافة 20 مل الكامل المتوسط ​​1640 RPMI.
  5. الحفاظ على الخلايا لمدة 8 أيام دون إضافة متوسطة جديدة، أي الموت جوعا.
  6. في يوم 16، ومراقبة الخلايالاحظ تحت المجهر. جمع الخلايا في أنبوب الطرد المركزي 15 مل، 12 مل / أنبوب.
  7. البرد الحفاظ على -80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، ومن ثم ذوبان الجليد بسرعة عند 37 درجة مئوية. كرر 3 مرات حتى يتم الإفراج عن جزيئات الفيروس من الخلايا.
  8. أجهزة الطرد المركزي في 240 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  9. تصفية طاف من خلال مرشح 0.22 ميكرون، قسامة، 12 مل / أنبوب، ومخزن في -80 درجة مئوية.

2. علاج من الدم الكامل مع خلايا الدم الحمراء الاحتياطي تحلل

  1. إضافة 0.5 مل من الدم الكامل anticoagulated من EDTA · K 2 إلى أنبوب 15 مل.
  2. وضع 1 مل عازلة خلايا الدم الحمراء تحلل (المصفاة بنسبة 0.22 ميكرون تصفية وإذابة إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام) إلى الدم الكامل وتخلط جيدا. ضع الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 دقائق. ثم إضافة 5-7 مل برنامج تلفزيوني 1X بسرعة إلى رد فعل توقف.
  3. أجهزة الطرد المركزي في 240 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. وخلايا الدم البيضاء يعجل في الجزء السفلي من الأنبوب.
  4. تجاهل طاف، وتغسل الأمطار عن طريق إضافة 7 مل 1640 وسط قاعدي. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 240 x ج في درجة حرارة الغرفة. كرر مرتين.
  5. Resuspend وبيليه الخلية في 300 متوسطة التحول ميكرولتر (المتوسط ​​1640 RPMI، التي تحتوي على 20٪ الجنين المصل البقري و 10 ميكروغرام / مل راصة دموية نباتية (فا)).

3. EBV العدوى

  1. إضافة 60 ميكرولتر من 20 ميكروغرام / مل السيكلوسبورين ألف (CSA) إلى تعليق خلية.
  2. بسرعة ذوبان قسامة من EBV عند 37 درجة مئوية. إضافة 240 ميكرولتر EBV إلى تعليق الخلية.
  3. تخلط جيدا ووضع تعليق خلية لوحة 96-جيدا، 200 ميكرولتر لكل بئر. لتجنب التبخر، إضافة 200 ميكرولتر برنامج تلفزيوني 1X إلى كل جيدا في جميع أنحاء لوحة 96-جيدا. وضع لوحة في 5٪ CO 2 حاضنة عند 37 درجة مئوية.

4. التوسع والحفظ بالتبريد من B-LCLs

  1. تغيير نصف المتوسط ​​مرة واحدة في الأسبوع لمدة الشهر الأول بعد الإصابة EBV. فقط أونلي سميكةص شظايا خلية مرئيا تحت المجهر في يوم 7 (الشكل 2). بعد شهر واحد من العدوى EBV، مجموعات الخلايا lymphoblastoid مرئية تحت طبقة سميكة من شظايا خلية تحت المجهر (الشكل 2).
  2. تغيير نصف المتوسط كل 3 أيام حتى مجموعات الخلايا مرئية تحت المجهر (الشكل 2) بوضوح. عادة، هذه العملية تستغرق من 10 إلى 20 يوما.
  3. بعد الاختلاط، الماصة الخلايا ونقل إلى لوحة 24 أيضا. مضاعفة حجم مستنبت مع كامل RPMI 1640 في حين أنه يتحول إلى اللون الأصفر. تعتمد هذه العملية على معدل نمو الخلايا.
  4. وفي وقت لاحق، نقل الخلايا إلى T25 قارورة الثقافة. مضاعفة حجم مستنبت لأنه يتحول إلى اللون الأصفر حتى حجم المتوسطة يتوسع إلى 10-15 مل.
  5. تغيير المتوسطة 24 ساعة قبل التجميد. تعليق خلية الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 240 × ز. عدد الخلايا التي تحتوي على عداد الخلايا وتجميد في مناطق ذات كثافة من 5-10 × 10 6 / مل في الابحل سهم ÖZEN تحتوي على 90٪ FBS و 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). تجميد بمعدل 1 درجة مئوية لكل دقيقة إلى -80 درجة مئوية ثم نقل مباشرة إلى النيتروجين السائل.

5. 3- (4،5-Dimethylthiazol-2-YL) -2،5-ثنائي-نتروبلو بروميد (الإنتقالي العسكري) الفحص 17

  1. إعداد B-LCLs تعليق خلية واحدة مع المتوسط ​​1640 تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني. البذور 3 × 10 4 خلايا لكل بئر على لوحة 96-جيدا، و 100 ميكرولتر لكل بئر.
  2. وضع لوحة في 5٪ CO 2 حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة.
  3. إضافة الإنتقالي العسكري (5 ملغ / مل) إلى الآبار التي الخلايا تنمو والابتعاد عن الضوء لمدة 4 ساعات في 37 درجة مئوية.
  4. أجهزة الطرد المركزي لوحة خلية لمدة 10 دقيقة في 168 × ز.
  5. إزالة طاف وإضافة 100 ميكرولتر DMSO لكل بئر.
    ملاحظة: كن حذرا. لا تلمس البلورات صبغ على شكل إبرة.
  6. يهز لوحة لمدة 10 دقيقة على سرعة منخفضة إلى حل كامل بلورات.
  7. امتصاص التدبير في 570 نانومترباستخدام مطياف صفيحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خلال عملية التحول، وتصور التغييرات الشكلية الخلايا بواسطة المجهر الضوئي (الشكل 2). وكانت مجموعات صغيرة من الخلايا المرئية بشكل واضح مع أسلوب الفصل التدرج الكثافة بعد 7 أيام من الإصابة، في حين فقط طبقة سميكة من شظايا خلية مرئية من الدم الحمراء طريقة خلية تحلل. ومع ذلك، مجموعات الخلايا lymphoblastoid مرئية تحت طبقة سميكة من شظايا خلية 30 إصابة آخر أيام. مع تغيير المتوسطة أكثر تواترا، وانخفاض الحطام الخلية ومجموعات الخلايا هي واضحة لل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم تقريرا عن تطوير طريقة جديدة لتخليد الخلايا البائية الإنسان من الدم الكامل من قبل الناشر خلايا الدم الحمراء، وبقاء الخلية لإنشاء B-LCLs تم تقييمها من قبل الفحص الإنتقالي العسكري. وأظهرت النتائج أن بقاء الخلية من B-LCLs التي وضعتها خلايا الدم طريقة تحلل الأحمر أعلى بكثير من كثافة طريقة فصل الانحدار. والميزة الرئيسية لخلايا الدم الحمراء طريقة تحلل هو أنه بسيط ويتطلب حجم صغير (أقل من 0.5 مل) من الدم لإنشاء خط خلية دائمة مع نسبة نجاح عالية وبقاء الخلية عالية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل المشاريع الرئيسية للأكاديمية الصينية للعلوم (KFZD-SW-205) ، ونظام دعم تكنولوجيا الموارد البيولوجية الاستراتيجي التابع للأكاديمية الصينية للعلوم (CZBZX-1).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أجهزة الطرد المركزيTechcompCT6T
الطرد المركزي عداد الخلايا الآلي  Countstar  IC 1000   ؛لعد الخلايا 
الطيف الضوئي الدقيق EpochBioTek Instruments SN263839لقياس الامتصاص
96 مجموعة زراعة خلايا الآبارCorning Incorporated3599ألواح البوليسترين
24 مجموعة ثقافة خلايا البئرCorning Incorporated3524ألواح البوليسترين
25 سم 2 < / sup> قارورة ثقافة الخليةعش707001البوليسترين & نب سب.
FBSGibco10270مكون من B-LCLs متوسط
RPMI متوسط 1640Gibco31800-022ل B-LCLs متوسط
L-Glutamine   ؛  Amresco0374مكون من B-LCLs متوسط
100x الستربتومايسين محلول البنسلين BioRoYeeBRY-2309BioRoYeeBRY-2309مكون B-LCLs متوسط
Ficoll paque بالإضافة إلىGE & nbsp ؛ الرعاية الصحية17-1440-03ل in vitro< / em> عزل الخلايا الليمفاوية
PHA-MSigmaL8902لتحفيز تكاثر الخلايا الليمفاوية
Cyclosporin ACayman  مادة كيميائية12088لتثبيط تأثير السمية الخلوية للخلايا التائية
عازلة تحلل الخلايا الحمراءTiangenRT122-01لتحلل خلايا الدم الحمراء
MTTAmresco0793للكشف عن صلاحية الخلية
DMSOSigmaD2650لتجميد الخلايا
مقياس

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mohyuddin, A., et al. Genetic instability in EBV-transformed lymphoblastoid cell lines. Biochim Biophys Acta. 1670 (1), 81-83 (2004).
  2. Hu, V. W., Frank, B. C., Heine, S., Lee, N. H., Quackenbush, J. Gene expression profiling of lymphoblastoid cell lines from monozygotic twins discordant in severity of autism reveals differential regulation of neurologically relevant genes. BMC Genomics. 7, 118(2006).
  3. Toda, T., Sugimoto, M. Proteome analysis of Epstein-Barr virus-transformed B-lymphoblasts and the proteome database. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 787 (1), 197-206 (2003).
  4. Chiorazzi, N., Wasserman, R. L., Kunkel, H. G. Use of Epstein-Barr virus-transformed B cell lines for the generation of immunoglobulin-producing human B cell hybridomas. J Exp Med. 156 (3), 930-935 (1982).
  5. Traggiai, E., et al. An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat Med. 10 (8), 871-875 (2004).
  6. Hussain, T., Kotnis, A., Sarin, R., Mulherkar, R. Establishment & characterization of lymphoblastoid cell lines from patients with multiple primary neoplasms in the upper aero-digestive tract & healthy individuals. Indian J Med Res. 135 (6), 820-829 (2012).
  7. Neitzel, H. A Routine Method for the Establishment of Permanent Growing Lymphoblastoid Cell-Lines. Hum Genet. 73 (4), 320-326 (1986).
  8. Oh, H. M., et al. An efficient method for the rapid establishment of Epstein-Barr virus immortalization of human B lymphocytes. Cell Prolif. 36 (4), 191-197 (2003).
  9. Louie, L. G., King, M. C. A Novel-Approach to Establishing Permanent Lymphoblastoid Cell-Lines - Epstein-Barr-Virus Transformation of Cryopreserved Lymphocytes. Am J Hum Genet. 48 (3), 637-638 (1991).
  10. Tremblay, S., Khandjian, E. V. Successful use of long-term frozen lymphocytes for the establishment of lymphoblastoid cell lines. Clin Biochem. 31 (7), 555-556 (1998).
  11. Reidy, J. A., Wheeler, V. A. Sample age and Epstein-Barr virus transformation of cryopreserved lymphocytes. In Vitro Cell Dev Biol. 28 (6), 383-384 (1992).
  12. Amoli, M. M., Carthy, D., Platt, H., Ollier, W. E. R. EBV immortalization of human B lymphocytes separated from small volumes of cryo-preserved whole blood. Int J Epidemiol. 37, suppl 1 41-45 (2008).
  13. Lacelle, C., Wang, E. Establishing lymphoblastoid cell lines from frozen blood of extremely old individuals. Mech Ageing Dev. 123 (10), 1415-1418 (2002).
  14. Tohda, H., Oikawa, A., Kudo, T., Tachibana, T. A greatly simplified method of establishing B-lymphoblastoid cell lines. Cancer Res. 38 (10), 3560-3562 (1978).
  15. Ventura, M., et al. Use of a Simple Method for the Epstein-Barr Virus Transformation of Lymphocytes from Members of Large Families of Reunion Island. Hum Hered. 38 (1), 36-43 (1988).
  16. Chenevixtrench, G., Kerr, B., Walters, M. Lymphoblastoid Cell-Lines from Frozen Whole-Blood - a Quick and Economical Safeguard for Linkage Analysis. Am J Hum Genet. 46 (1), 635-636 (1990).
  17. Hansen, M. B., Nielsen, S. E., Berg, K. Re-Examination and Further Development of a Precise and Rapid Dye Method for Measuring Cell-Growth Cell Kill. J Immunol Methods. 119 (2), 203-210 (1989).
  18. Bogoslovsky, T., et al. Preservation and enumeration of endothelial progenitor and endothelial cells from peripheral blood for clinical trials. Biomark Med. 9 (7), 625-637 (2015).
  19. Ambach, A., Bonnekoh, B., Gollnick, H. Routine flow cytometric immuno-staining of T-cell perforin is preserved using diethylene glycol for erythrocyte-lysis but lost by the use of ammonium chloride. Exp Dermatol. 12 (6), 825-831 (2003).
  20. Beck, J. C., Beiswanger, C. M., John, E. M., Satariano, E., West, D. Successful transformation of cryopreserved lymphocytes: A resource for epidemiological studies. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 10 (5), 551-554 (2001).
  21. Tosato, G., Cohen, J. I. Generation of Epstein-Barr Virus (EBV)-immortalized B cell lines. Curr Protoc Immunol. , Chapter 7, Unit 7 22(2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

MTT

مقالات ذات صلة