مقالة منهجية

محلي الميدان مضان المجهر: التصوير الإشارات الخلوية في قلوب سليمة

DOI:

10.3791/55202

⸱

مارس 8, 2017

 ,  ,  , 
1School of Natural Sciences, University of California, Merced, 2Centro de Investigaciones Cardiovasculares, Universidad de la Plata and Conicet, 3Facultad de Ingenieria, Universidad Nacional de Entre Rios, 4Department of Physiology, Midwestern University, 5School of Engineering, University of California, Merced

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في القلب، والأحداث الجزيئية تنسيق وظيفة الكهربائية ومقلص من الجهاز. وهناك مجموعة من تقنيات المجهر مضان ميدانية محلية المعروضة هنا يمكن تسجيل المتغيرات الخلوية في قلوب سليمة. تحديد آليات تحديد وظيفة القلب أمر بالغ الأهمية في فهم الكيفية التي يعمل بها القلب في حالات المرضية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في القلب، وعادة ما تكون أداء دراسات الإشارات الجزيئية في myocytes معزولة. ومع ذلك، فإن العديد من الحالات المرضية مثل نقص التروية وعدم انتظام ضربات القلب لا يمكن إلا أن يكون مفهوما بشكل كامل على مستوى الجهاز كله. هنا، نقدم هذه التقنية باستخدام التحليل الطيفي للالمحلي مضان الحقل المجهري (LFFM) التي تسمح للقياس الإشارات الخلوية في قلب سليمة. وتستند هذه التقنية على مزيج من القلب perfused Langendorff والألياف البصرية لتسجيل إشارات الفلورسنت. LFFM لها تطبيقات مختلفة في مجال علم وظائف الأعضاء القلب والأوعية الدموية لدراسة القلب في الظروف العادية والمرضية. يمكن رصد المتغيرات القلب متعددة باستخدام المؤشرات الفلورسنت مختلفة. وتشمل هذه عصاري خلوي [كا 2+]، داخل الهيولى العضلية شبكية [كا 2+] وإمكانات الغشاء. تحقيقات الفلورسنت الخارجية متحمسون ومضان المنبعثة الكشف مع ثلاثة ترتيبات مختلفة من تقنية LFFM epifluorescenceق الواردة في هذه الورقة. الخلافات المركزية بين هذه التقنيات هي نوع من مصدر الضوء المستخدمة في الإثارة وعلى طريقة التضمين ضوء الإثارة. وLFFM نابض (PLFFM) يستخدم نبضات ضوء الليزر بينما موجة مستمرة LFFM (CLFFM) يستخدم ضوء الليزر المستمر للإثارة. وأخيرا، تم استخدام الضوء الثنائيات (المصابيح) كمصدر الضوء الثالث. ويسمى هذا الترتيب غير متماسك نابض المجهر مضان LED (PLEDFM).

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والقلب هو الجهاز المركزي للنظام القلب والأوعية الدموية. يبدأ تقلص القلب بزيادة في داخل الخلايا [كا 2+]. العلاقة بين استثارة الكهربائية والتغيرات في الخلايا إطلاق الكالسيوم 2+ تمت دراسته تاريخيا في الخلايا نأت إنزيمي 1 و 2. ومع ذلك، وخلايا القلب هي كهربائيا، عملية الأيض وميكانيكيا مقترنة 3 و 4. عندما معزولة، وmyocytes ليست فقط جسديا وفكت، ولكنها مختلطة myocytes من طبقات مختلفة خلال التفكك 5. وعلاوة على ذلك، على الرغم من المزايا الهائلة التي ظهرت من دراسة الخلايا المعزولة في ظل الظروف المشبك الجهد، 6، 7، 8 الطبيعة الجوهرية للقلب باعتبارها علوة مخلى الكهربائيةيس يطرح السؤال عن كيفية مختلفة وظيفيا وفصل الخلايا من تلك الموجودة في الأنسجة 3.

في هذا المخطوط، وصفنا التقدم التي تم الحصول عليها في علم وظائف الأعضاء القلب عن طريق استخدام المحلي مضان الحقل المجهري تقنيات (LFFM) في قلب سليمة. يستخدم LFFM مؤشرات لقياس الفلورسنت متعددة المتغيرات الفسيولوجية مثل عصاري خلوي كا 2+، داخل شبكية الهيولى العضلية (SR) كا 2+ وغشاء المحتملة. هذه القياسات يمكن الحصول في وقت واحد وبالتزامن مع الضغط البطيني 9، 10، كهربية 9، إمكانات العمل الكهربائية (الجزائرية) والتسجيلات الحالية الأيونية والتحلل الضوئي فلاش من المركبات في قفص 4 و 11. وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذه القياسات يمكن الحصول على سرعة القلب سليما على ترددات أعلى قريبr لمعدلات الفسيولوجية. على الرغم من أن العديد من المواد 9، 11، 12، 13، 14 وقد نشرت من قبل مجموعتنا باستخدام تقنيات LFFM، وافتراض التعقيدات التقنية المرتبطة مع هذه التقنية قد تحول دون استخدام هذه ضخم في دراسة الظواهر الفسيولوجية خارج الجسم الحي في القلب وغيرها من الأجهزة.

وتستند هذه التقنية LFFM (الشكل 1) على قياسات epifluorescence الحصول عليها باستخدام الألياف الضوئية المتعدد في اتصال مع الأنسجة. مثل أي تقنية التصوير اتصال مضان، يعتمد قرار بصري على قطر والفتحة العددية (NA) من الألياف. وهناك قطر أعلى NA وأصغر من الألياف تزيد من دقة مكانية القياسات. ناس وأقطار الألياف يمكن أن تتراوح 0،22-0،66 ومن 50 ميكرومتر إلى 1 ملم، على التوالي. فيوالتجعيد لNA تحسين إشارة إلى نسبة الضوضاء (S / N) بقبول الفوتونات قادمة من زاوية الصلبة أكبر. من أجل أن تكون بمثابة جهاز epifluorescence، وتركز شعاع الضوء في الألياف البصرية مع عدسة شبه كروي أو هدف epifluorescence حيث NA العدسة والمباراة الألياف. هذا مطابقة يعظم نقل الطاقة لإثارة ولجمع الظهر الفوتونات المنبعثة من fluorophore.

من أجل إثارة المؤشرات الفلورسنت الخارجية التي تم تحميلها في الأنسجة، ومصادر الضوء المختلفة وطرق الإضاءة يمكن استخدامها. لدينا دراسات رائدة باستخدام نابض المجال المحلي مضان المجهر 3، 12 (PLFFM) المستخدمة في بيكو ثانية ليزر منخفضة التكلفة (الشكل 1A، PLFFM). هذا النوع من مصدر الضوء لديه ميزة كبيرة من المثير جزء كبير من جزيئات fluorophore تحت منطقة الإضاءة دون تبيض كبير الصبغة المناسبلنبض قصيرة المدد 12. بالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام نبضات فائقة القصر سمح لتقييم مدى الحياة مضان من صبغ 12. عمر مضان هو الخاصية التي يمكن استخدامها لتحديد جزء من جزيئات الصبغة بد أن الكالسيوم 2+. للأسف، والنرفزة الزمنية للالبقول والاختلافات في السعة من نبض لنبض تحد من تطبيق هذه الاستراتيجية التجريبية إلى الحالات التي يكون فيها التغيير في مضان التي تنتجها يجند ملزم لصبغ كبير.

عادة ما تستخدم موجة مستمرة (CW) ليزر كمصدر للإضاءة الرئيسية في LFFM (الشكل 1B، CLFFM). شعاع الليزر يمكن أن تضيء باستمرار الأنسجة أو يمكن أن يكون منظم ferroelectrically. التشكيل متعلق بالعازل الكهربائي الشفاف من الحزم يسمح توليد نبضات ميكروثانية الضوء. يمكن التحكم هذا التشكيل من قبل الأجهزة الخارجية. هذا الإجراء لا يقلل فقط بشكل كبير رانه النرفزة الزمنية للنبضات الضوء ولكنه يسمح أيضا خلط أشعة موجات مختلفة. يتم خلط الحزم من مضاعفة أشعة من الليزر المختلفة. ونتيجة لذلك، يمكن أن الأصباغ متعددة ذات الخواص الطيفية المختلفة يكون متحمس لإجراء قياسات لمجموعة من المتغيرات الفسيولوجية، على سبيل المثال، Rhod-2 للعصاري خلوي كا 2+، MagFluo4 للداخل ريال كا 2+ ودي-8-ANEPPS ل غشاء المحتملة.

على الرغم من أن أشعة الليزر الحالية المزايا المختلفة كمصدر للضوء في LFFM، وأنواع أخرى من مصادر الضوء يمكن أن تستخدم بما في ذلك الثنائيات الباعثة للضوء (المصابيح). في هذه الحالة، تكون مصدر ضوء الإثارة لLED InGaN (الشكل 1C، PLEDFM). في المصابيح، وتنبعث الفوتونات بشكل عفوي عندما الإلكترونات من نطاق التوصيل تمتزج مع الثقوب في عصابة التكافؤ. الفرق مع ليزر الحالة الصلبة هو أن الانبعاثات لا يحفزه الفوتونات الأخرى. وهذا يؤدي إلى شعاع غير متماسك وانبعاث الطيف الأوسع للنظام بيانات تطبيق القانون.

أنواع مختلفة من المصابيح عالية الطاقة يمكن استخدامها. للحصول على تسجيلات AP باستخدام دي-8-ANEPPS ول Ca 2+ تسجيل العابرين باستخدام فلوو-4 أو ماج-فلوو-4، استخدمنا LED التي لديها ذروة الانبعاثات نموذجي في 485 نانومتر (الأزرق) ونصف عرض 20 نانومتر (1D الشكل). ل Ca 2+ العابرين سجلت مع Rhod-2، وكان LED ذروة الانبعاثات نموذجي في 540 نانومتر (الأخضر) ونصف بعرض 35 نانومتر (1D الشكل). المصابيح تنبعث في طول موجة الفرقة، وبالتالي تتطلب المرشحات لتضييق الانبعاثات الطيفية. وبالإضافة إلى ذلك، وعلى ضوء نابض يمكن أن تتولد بمعدل 1.6 كيلو هرتز مع مدة 20 ميكرو ثانية. ونابض المصابيح مع سريع MOSFET السلطة تأثير الحقل الترانزستور. التسجيلات في وقت واحد مع مؤشرات مختلفة يمكن أن يقوم بها الوقت مضاعفة المصابيح. للأسف، الضوء المنبعث من المصابيح هو أكثر صعوبة في التركيز على الألياف البصرية مقارنة مع شعاع الليزر. وهكذا، فإن العيب الرئيسي مناجي المصابيح هو أن ملامح الانبعاثات لديها التشريد الزاوي (± 15 درجة) من المحور الرئيسي، ويجب استخدام والبصرية المساعدة لتصحيح ذلك.

في كل من التكوينات البصرية التي سبق وصفها، وينعكس ضوء الإثارة بمساعدة مرآة مزدوج اللون. وتركز شعاع في وقت لاحق من قبل عدسة شبه كروي والهدف المجهر على الألياف البصرية المتعدد الذي يتوضع على الأنسجة. كما هو الحال في أي ترتيب epifluorescence، ومرآة مزدوج اللون يخدم أيضا للفصل بين الإثارة من الضوء المنبعث. طيف الضوء المنبعث يسافر الى الوراء من خلال مرشح حاجز لإزالة أي الإثارة ينعكس. وأخيرا، يركز الضوء المنبعث مع هدف الصعود إلى مكشاف ضوئي (الشكل 1).

يتم تنفيذ تنبيغ من الضوء إلى تيار كهربائي من خلال ثنائيات ضوئية السيليكون الانهيار. هذه الثنائيات لديها استجابة سريعة وحساسية عالية تسمح منخفض كشف الضوء. الphotocurrent التي تنتجها فوتوديوديس سيل يمكن تضخيمه بطريقتين: مكبر للصوت transimpedance وجود مقاوم عنصر ردود الفعل (الشكل 1E) أو عن طريق تكامل لتحويل التيار إلى الجهد (الشكل 1F). باستخدام النهج الأول، والجهد الناتج يتناسب مع photocurrent والمقاوم ردود الفعل. ويرد مثال نموذجي للكشف مقاوم من نبضات الليزر بيكو ثانية في أرقام 2A، 2B و2C. يوضح 2A الفريق خرج مكبر للصوت transimpedance ويظهر لوحة 2B توسع الوقت الفاصل الزمني المشار إليها بعلامة النجمة (*). تم تنفيذ خوارزمية ذروة تتبع للكشف عن الذروة (أحمر) وقاعدة (الأخضر) للردود الفلورسنت 12. قياس مضان قاعدة يوفر المعلومات من كلا التيار المظلم من الثنائي الضوئي الانهيار والتدخلات التي أدخلها دوري الدرجة المحيطةحزب التحرير واقتران الكهرومغناطيسي. ويرد تمثيل قمم وقواعد في الشكل 2C. يوضح هذا الرقم مضان المنبعثة من الصبغة (Rhod-2) منضمة إلى الكالسيوم 2+ خلال دورة القلب من قلب ينبض ببغاء.

في الطريقة الثانية، والجهد الناتج من تكامل هو وظيفة من ردود الفعل الحالية وبالسعة (أرقام 2D، 2E، و2F). ويبين الشكل 2F دورتين متتاليتين التكامل: الأول مع عدم وجود إضاءة في الهواء الطلق، والثاني مع نبضات الضوء التطبيقية من الصمام نابض. ويرد وصف مفصل في أرقام 2G و 2H. هذا النهج، على الرغم من أن أكثر شاقة، ويوفر أكبر S / N نظرا لعدم وجود الضوضاء الحرارية في مكثف ردود الفعل. ويتضمن الصك مرحلة التوقيت الذي يولد كل السيطرة والمتنوعة من ضوء الإثارة والأوامر والتكامل headstage والدقةفترات آخرون. عادة ما يتم إجراء هذا مع دائرة معالجة الإشارات الرقمية التي تنفذ أيضا تمايز الرقمي للإشارة خرج متكاملة من خلال حساب والانحدار على الانترنت من بيانات. في حالة استخدام ردود الفعل مقاوم، أي لوحة اقتناء / D يمكن استخدامها.

وأخيرا، تقنية LFFM لدينا تنوعا للغاية ويمكن تكييفها لتسجيل من أكثر من منطقة. إضافة الخائن شعاع في مسار الضوء يسمح لنا لتقسيم الضوء إلى اثنين من الألياف البصرية. كل الألياف الضوئية ومن ثم يمكن وضعها على مناطق مختلفة من الأنسجة ل، بشكل مستقل، والإثارة وانبعاث سجل من تحقيقات الفلورسنت الخارجية. يسمح هذا التعديل لنا لتقييم مدى الاختلافات الإقليمية تشريحية التأثير على المتغيرات الفسيولوجية. ويبين الشكل 3 الخائن شعاع التي يجري استخدامها لتقسيم ضوء الإثارة CW تستخدم مثل أن اثنين من الألياف الضوئية لقياس بطريق داخل الخلايا الكهربائية أو [كا 2+] مستويات الذكاءح قاصر-الغازية. إشارات بطريق يمكن تسجيلها عن طريق وضع الألياف واحد على البطانة والآخر على طبقة النخاب الجدار البطيني. ولذلك، فإن تقنية LFFM لديه القدرة على قياس مدار الساعة من الإشارات الخلوية في مناطق مختلفة، ويمكن استخدامها لاختبار إذا تحدث التغييرات الإقليمية في إطار الحالات المرضية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد وافق هذا البروتوكول وعن التعامل مع الفئران عن طريق لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام جامعة كاليفورنيا ميرسيد (رقم 2008-201). وأجريت التجارب مع الببغاوات في عام 1999 وفقا لسياسات عامة للاستخدام الحيواني التي وضعتها اللجنة العلمية للمعهد الفنزويلي للبحوث العلمية (أيفيتش).

1. Langendorff تعيين إعداد ما يصل

  1. يعد حل تايرود التي تحتوي على تركيزات المذاب التالية في ملي: 140 كلوريد الصوديوم، 5.4 بوكل، 2 CaCl 2، 1 MgCl 2، 0.33 نا 2 هبو 4، 10 الجلوكوز، 10 HEPES. ضبط درجة الحموضة من الحل تايرود إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم وتصفية حل من خلال مرشح 0.22 ميكرون.
  2. تحميل حل تايرود في 60 المحاقن مل وجميع أنابيب من Langendorff الأفقي انشاء 11، 12 هو موضح في الشكل (4). تأكد للقضاء على جميع فقاعات الهواء.
  3. حل يوازن تايرود مع 100٪ O 2 باستخدام البلاستيك "حجر الهواء" المغمورة كما هو موضح في الشكل (4).
    1. ربط الأنابيب البلاستيكية لخزان O 2.
    2. إضافة محول المحملة البلاستيك لخفض و"أنبوب 5 في حل تايرود في مل حقنة 60.
    3. نعلق حجر الهواء من البلاستيك لنهاية "أنبوب 5 حتى O 2 الإرادة فقاعة للخروج الى حل تايرود.
  4. وضع خياطة الجراحية غير قابل للامتصاص حول إبرة تستخدم قنية. ويقترن الإبرة إلى مشعب (انظر الشكل 4) الذي يسمح الرجعية نضح مع حلول مختلفة. وأخيرا، سيتم مقنى الشريان الأورطي للقلب في الإبرة.

2. إعداد الحيوانية والقلب تشريح

  1. وزن وحقن الفأر مع الهيبارين (مثل الفأر من وزنه 20 غراما، حقن مع 20 وحدة أو 200 ميكرولتر) لمدة 15 دقيقة قبل القتل الرحيم خلع عنق الرحم. تخدير الببغاوات وفقا رس أدلة استخدام الحيواني من بروتوكول IACUC الخاص بك ومن ثم المضي قدما في خلع عنق الرحم.
    ملاحظة: استخدم 8 أسابيع الفئران القديمة أو 20 الببغاوات ز.
  2. إزالة القلب من تجويف الصدر بعد euthanization. استخراج قلوب ببغاء في بنفس الطريقة تماما كما هو موضح بالنسبة للفئران.
    1. تنظيف الصدر الفأر مع الايثانول.
    2. باستخدام مقص تشريح، وجعل شق في البطن ومن ثم تقطيع الجانبين نحو الرقبة.
    3. سحب الأنسجة قطع ويعلقون عليه.
    4. قطع الحجاب الحاجز. كن حذرا عندما قطع الحجاب الحاجز لتجنب إتلاف القلب.
    5. إزالة الرئتين والأنسجة المحيطة بها.
    6. استخدام ملاقط لحلج القطن في القلب من دون الضغط عليه. قطع الشريان الأورطي لأطول فترة ممكنة.
  3. نقل قلب على وزن قارب صغير مع ما يقرب من 1 مل من محلول تايرود.
  4. باستخدام خياطة الجراحية غير قابل للامتصاص، ربط الشريان الأورطي على الجهاز Langendorff الأفقي عبرإبرة. ربط الشريان الأورطي في القلب بمساعدة اثنين من ملاقط غرامة. تبدأ الرجعية نضح عن طريق فتح صمام تقع في سلسلة مع 60 المحاقن مل تحتوي على حل تايرود.
  5. السماح القلب لتستقر لمدة 10 دقيقة. استخدام هذا الوقت لتنظيف الدم والأنسجة الدهنية المحيطة القلب قبل تحميل الصبغة. سحب الأنسجة الدهنية بالقرب من قاعدة للقلب مع ملاقط وقطع باستخدام مقص تشريح الصغيرة. يجب التأكد من القيام بذلك تحت ضوء مجهر تشريح.

3. عصاري خلوي كا 2+ القياسات: إعداد صبغ Rhod-02:00

  1. إضافة 20 ميكرولتر من 20٪ pluronic (السطحي غير الأيونية) في DMSO إلى قارورة بلاستيكية مغلفة الخاصة المقدمة من قبل الشركة المصنعة صبغ يحتوي على 50 ميكروغرام من الصبغة.
  2. مزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا، وتجنب الفقاعات.
  3. نقل DMSO مختلطة مع السطحي غير الأيونية وصبغ من الخاصة القارورة البلاستيكية المعبأة في قارورة زجاجية واضحة. إضافة 1 مل من تايرود المحاليلنشوئها إلى قارورة زجاجية واضحة.
  4. يصوتن لمدة 15-20 دقيقة في sonicator حمام.
  5. يروي الصبغة باستخدام مضخات تحوي لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    1. وضع الصبغة في غرفة صبغ.
    2. استخدام المشبك الميكانيكية لضغط جميع خطوط أنابيب أخرى متصلة متعددة. يتم وضع المشبك فوق متعددة. هذا سيمنع أي ارتجاع في أنابيب متصلة 60 المحاقن مل.
    3. بدوره على مضخة تحوي نضح لبدء تعميم الصبغة. إغلاق فورا 3-الطريقة صمام أقل من مل حقنة 60.
    4. وضع أنبوب صغير متصل شفط مضخة تحوي القادمة إلى قلب إعادة توزيع الصبغة التي تم perfused في القلب.

4. البينية ريال كا 2+ القياسات: إعداد صبغ ماج Fluo4AM

  1. إعداد ماج Fluo4AM في بنفس الطريقة التي Rhod-02:00. الرجوع إلى قسم 3 للحصول على تعليمات خطوة حكيمة.
  2. بعد عملية الشراءص تحميل الصبغة، افتح صمام تقع في سلسلة مع 60 المحاقن مل تحتوي على حل تايرود لبدء الرجعية الارواء. تأكد من إزالة المشبك فوق متعددة.
  3. إضافة حل تايرود إلى غرفة الأفقية والاحماء إلى 37 درجة مئوية.
  4. الرجعية يروي مع حل تايرود لمدة 45 دقيقة لإزالة الصبغة عصاري خلوي.

5. غشاء القياسات المحتملة: إعداد صبغ دي-8-ANEPPS

  1. إضافة 5 مل من 99٪ من الإيثانول إلى القارورة صبغ يحتوي على 5 ملغ من الصبغة.
  2. قسامة 10 ميكرولتر إلى 500 فرد 1 قارورة بلاستيكية مل باستخدام ماصة مكرر.
  3. يجفف في فراغ السرعة ومخزن في -20 درجة مئوية.
  4. إضافة 20 ميكرولتر من 20٪ pluronic في DMSO إلى قارورة من البلاستيك مع 10 ميكروغرام من الصبغة المجفف.
  5. مزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا، وتجنب الفقاعات.
  6. نقل مزيج تحتوي على DMSO مع pluronic وصبغ من قنينة بلاستيكية لاسطوانة تخرج (10 مل). إضافة حل تايرود لفو النهائيلوم من 5 مل.
  7. يصوتن لمدة 20-25 دقيقة في sonicator حمام.
  8. يروي في قلب لمدة 30 دقيقة باستخدام مضخات تحوي. الرجوع إلى تعليمات متدرجة في القسم 3.5.

6. تسجيل إشارات النخابية

  1. بعد تحميل الصبغة، الرجعية يروي القلب مع حل تايرود عن طريق إزالة المشبك فوق متعددة. فتح صمام تقع في سلسلة مع مل حقنة 60 تحتوي على حل تايرود. الرجعية يروي حل تايرود لمدة 10 دقيقة لتحقيق الاستقرار في القلب.
  2. تملأ الغرفة الأفقية مع حل تايرود وتشغيل وحدة بلتيير لتحقيق درجة حرارة الحمام إلى 37 درجة مئوية.
  3. ضع الألياف الضوئية على سطح القلب.
    1. وضع الألياف البصرية داخل ماصة 2 مل ثم نعلق ماصة لmicromanipulator.
    2. استخدام micromanipulator للضغط قليلا من الألياف البصرية على سطح LV.
  4. وتيرة خارجيا صناعة الثقيلةRT مع مشجعا التي تسيطر عليها مولد الموجة.
    1. برمجة مولد موجة لتوفير نبض مربع ويبلغ عرضه 1 مللي ثانية.
    2. تعيين مشجعا لتكون متزامنة من الخارج وربط المدخلات الخارجية للمولد الموجة.
    3. إلى كل ناتج من التحفيز والتشجيع، قم بتوصيل سلك مع إبرة الوخز بالإبر ملحوم في نهاية المطاف.
    4. وضع كل من إبر الوخز في قمة القلب حوالي 3 ملم بعيدا عن بعضها البعض.
    5. فقط بعد أن يتم وضع الإبر في الأنسجة، بدوره على إخراج مشجعا لمنع الصدمات الكهربائية.
  5. في اقتناء البرمجيات، وضبط التردد الاستحواذ إلى 10 كيلو هرتز.

7. تسجيل إشارات الشغاف

  1. الرجوع إلى الخطوة 6.1 و 6.2 لتحقيق الاستقرار في القلب بعد تحميل الصبغة.
  2. باستخدام نقطة 23Ga حادة حول حجم الألياف البصرية، وجعل ثقب صغير في سطح القلب في LV بالقرب من الحاجز.
    3. <لى> ضع علامة intravitreal محول جراحة بضع الصلبة للمساعدة في تحديد المواقع أول الألياف البصرية في شغاف باستخدام micromanipulator.
  3. وتيرة خارجيا القلب. الرجوع إلى الخطوة 6.4.
  4. في اقتناء البرمجيات، وضبط التردد الاستحواذ إلى 10 كيلو هرتز.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ا ف ب والكالسيوم 2+ العابرين في البطانة والنخاب

من أجل مقارنة الإشارات عبر جدار البطين، يتم وضع الألياف البصرية واحد في البطانة والآخر في النخاب. مقارنة مورفولوجية أب المسجلة من البطانة مع واحد من النخاب هو أفضل وسيلة لتقييم وظيفة بطريق. الجدار البطيني هو غير متجانسة للغاية، وبالتالي، فإن ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتتركز هذه الورقة في وصف تقنيات مضان ميدانية محلية لتقييم وظيفة myocytes القلب خارج الحي. دراسة هذه الخلايا في بيئة بالإضافة ليست فقط أكثر الفسيولوجية، ولكن هو أيضا مناسبة للغاية لتقييم الحالات المرضية على مستوى الجهاز. الأحداث الخلوية الكامنة وراء اقتران الإثارة، تقلص (ECC) يمكن تقييمها على مستوى الجهاز كله مع استخدام الاختبارات الجزيئية التي ترصد الكالسيوم داخل الخلايا 2+ ديناميات (Rhod 2 عصاري خلوي كا 2+، ماج Fluo4 ريال كا 2+) و النشاط ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر الدكتور أليسيا Mattiazzi لمناقشة الحرجة من العمل المقدم. وأيد هذا العمل من خلال منحة من المعاهد الوطنية للصحة (R01 HL-084487) إلى الرابطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
كلوريد الصوديومسيجما7647-14-5
D- (+) - الجلوكوزسيجما50-99-7
كلوريد البوتاسيومسيجما7447-40-7
هيبسسيجما7365-45-9
فوسفات الصوديومسيجما10049-21-5
محلول كلوريد الكالسيومسيجما10043-52-4
محلول كلوريد المغنيسيومسيجما7786-30-3
هيردوكسيد الصوديومسيجماS-8045
0.2 & م مرشح غشاء النايلونWhatman7402-004
Manifold MPPWarner64-0216   ؛
21G1.5 إبرة انزلاقيةدقيقة B-D305167
خيط حرير أسود مضفر (خياطة جراحية غير قابلة للامتصاص)AllMech TechLOOK-SP105
حقن الصوديوم الهيبارين 1000USP / ملAllMech TechNDC63323-540-11
DMSO D8779Sigma67-68-5
BlebbistatinSigma856925-71-8
Pluronic F-127 20٪ حلBiotium59004
Materflex C / L مضخة تمعجيةCole-Parmer77122-26
محفز Isostimأدوات الدقة العالميةA320RC
مولد الشكل الموجيTeledyne LecroyWaveStation 2012
منظف بالموجات فوق الصوتية FS20فيشر 1533530
معرف أنابيب Tygon: 1/32 "OD: 3/32" الجدار 1/32 "توريد المكوناتTET-031A
Tygon الأنابيب معرف: 3/32" OD: 5/32" الجدار 1/32 "توريد المكوناتTET-094A
قفل لور محول إلى صمام 3 اتجاهاتCole-ParmerEW-31200-80
محولات الإنطلاق والتجهيزات البلاستيكيةCole-Parmer6365-90
مشبك بلاستيكيWaterZoo2465
PeltierTE TechnologyTE-127-2.0-2.5
Rhod-2AMThermoFisher ScientificR1245MP
Di-8-ANEPPSThermoFisher ScientificD3167
Mag-Fluo-4AMThermoFisher ScientificM14206
إبر البرLHASATC1.20x13
حقنة BD سعة 60 مل مع لوير لوكفيشر Scientific14-820-11
LabViewNational Instruments سرعة
فراغ Eppendorf VagufugeFisher Scientific07-748-13
دائرة معالجة الإشارات الرقمية DSP TMS 320Texas Instrument
Longpass مرآة ثنائية اللون 567 نانومترThorLabsDMLP567L
الهدف 10X NA 0.25 DIN لوني محدد دولي قياسي الهدفإدموند للبصرياتالأسهم # 33-437
الهدف 20X NA 0.40 DIN لوني محدود دولي قياسي الهدفإدموندللبصريات الأسهم # 33-438
مرشح زجاجي ملون Longpass 590 نانومتر   ؛ThorLabsFGL590
ليزر أخضر Nd-YAG 532 نانومتر ، 500 ميجاوات
Micromanipulator لليزرSiskiyouMX130R
متعدد الأوضاع الألياف البصرية 200 & مايكرو ؛ m NA 0.39ThorLabsFT200UMT
LEDs أزرقLumiledsL135-B475003500000
LED أخضرLumiledsL135-G525003500000
مكعب شعاع الفاصل ،ThorLabsBS007
36 بوصة الطول ، السكك البصرية المتشابكةEdmund Optics54-402
2.5 "العرض ، الناقل المتوافقEdmund Optics54-404
0.75 "السفر ، مرحلة الميكرومترEdmund Optics37-983
السكك الحديدية المتشابكة 3 "ThorLabsRLA075 / M
حامل السكك الحديدية المتشابكة 1 "ThorLabsRC1
الانهيار الجليدي الثنائي الضوئي Helix 902Digi-KeyHELIX-902-200
حامل الهدف XY Translator & نب سب.ThorLabsST1XY-S
لوح تجارب ألومنيوم 6 × 6 بوصةThorLabsMB6
Nexus otpical table 4 × 6 'ThorLabsT46HK
مسامير غطاء من الفولاذ المقاوم للصدأThorLabsHW-KIT5 / M
أكريليك   ورقةهوم ديبوت / Lowes
Sylgard مجموعة المطاط الصناعي المصنوعة من السيليكونداو كورنينجسيلجارد 184
إيبوكسي جل وول مارت / هوم ديبوت2 جزء 5 دقائق clr 1 أوقية
21G1.5 إبرة انزلاق دقيقةBD305167
23G إبرة انزلاق دقيقةB-D305145
قاعدة تركيب ، 25 مم × 75 مم × 10 ممThorLabsBA1 / M
أعمدة أرفف سلكية 36 بوصةأرفف أليراAALESW59PO36SR
أليراALESW582424SR
آخر وزاوية المشبكThorLabsSWC / M-P5
حقنة زجاجية لغرفة الصبغWheatonW851020
سدادة مطاطيةأدوات العلومالمنزلية CE-STOP01C
العلميغير المستقطب سلكية

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fabiato, A., Fabiato, F. Contractions induced by a calcium-triggered release of calcium from the sarcoplasmic reticulum of single skinned cardiac cells. J Physiol. 249 (3), 469-495 (1975).
  2. Mitra, R., Morad, M. A uniform enzymatic method for dissociation of myocytes from hearts and stomachs of vertebrates. Am J Physiol. 249 (5), 1056-1060 (1985).
  3. Escobar, A. L., et al. Developmental changes of intracellular Ca2+ transients in beating rat hearts. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), H971-H978 (2004).
  4. Ramos-Franco, J., Aguilar-Sanchez, Y., Escobar, A. L. Intact Heart Loose Patch Photolysis Reveals Ionic Current Kinetics During Ventricular Action Potentials. Circ Res. 118 (2), 203-215 (2016).
  5. Mitra, R., Morad, M. A uniform enzymatic method for dissociation of myocytes from hearts and stomachs of vertebrates. Am J Physiol. 249, H1056-H1060 (1985).
  6. Fischmeister, R., DeFelice, L. J., Ayer, R. K., Levi, R., DeHaan, R. L. Channel currents during spontaneous action potentials in embryonic chick heart cells. The action potential patch clamp. Biophys J. 46 (2), 267-271 (1984).
  7. Banyasz, T., Horvath, B., Jian, Z., Izu, L. T., Chen-Izu, Y. Profile of L-type Ca(2+) current and Na(+)/Ca(2+) exchange current during cardiac action potential in ventricular myocytes. Heart Rhythm. 9 (1), 134-142 (2012).
  8. Apkon, M., Nerbonne, J. M. Characterization of two distinct depolarization-activated K+ currents in isolated adult rat ventricular myocytes. J Gen Physiol. 97 (5), 973-1011 (1991).
  9. Valverde, C. A., et al. Transient Ca2+ depletion of the sarcoplasmic reticulum at the onset of reperfusion. Cardiovasc Res. 85 (4), 671-680 (2010).
  10. Valverde, C. A., et al. Phospholamban phosphorylation sites enhance the recovery of intracellular Ca2+ after perfusion arrest in isolated, perfused mouse heart. Cardiovasc Res. 70 (2), 335-345 (2006).
  11. Escobar, A. L., et al. Role of inositol 1,4,5-trisphosphate in the regulation of ventricular Ca(2+) signaling in intact mouse heart. J Mol Cell Cardiol. 53 (6), 768-779 (2012).
  12. Mejía-Alvarez, R., et al. Pulsed local-field fluorescence microscopy: a new approach for measuring cellular signals in the beating heart. Pflügers Arch. 445 (6), 747-758 (2003).
  13. Ferreiro, M., Petrosky, A. D., Escobar, A. L. Intracellular Ca2+ release underlies the development of phase 2 in mouse ventricular action potentials. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302 (5), H1160-H1172 (2012).
  14. Kornyeyev, D., et al. Calsequestrin 2 deletion shortens the refractoriness of Ca2+ release and reduces rate-dependent Ca2+-alternans in intact mouse hearts. J Mol Cell Cardiol. 52 (1), 21-31 (2012).
  15. Mattiazzi, A., Argenziano, M., Aguilar-Sanchez, Y., Mazzocchi, G., Escobar, A. L. Ca2+ Sparks and Ca2+ waves are the subcellular events underlying Ca2+ overload during ischemia and reperfusion in perfused intact hearts. J Mol Cell Cardiol. 79, 69-78 (2015).
  16. Kornyeyev, D., Reyes, M., Escobar, A. L. Luminal Ca(2+) content regulates intracellular Ca(2+) release in subepicardial myocytes of intact beating mouse hearts: effect of exogenous buffers. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 298 (6), H2138-H2153 (2010).
  17. Wang, Z. G., Fermini, B., Nattel, S. Repolarization differences between guinea pig atrial endocardium and epicardium: evidence for a role of Ito. Am J Physiol. 260, H1501-H1506 (1991).
  18. Liu, D. W., Gintant, G. A., Antzelevitch, C. Ionic bases for electrophysiological distinctions among epicardial, midmyocardial, and endocardial myocytes from the free wall of the canine left ventricle. Circ Res. 72 (3), 671-687 (1993).
  19. Litovsky, S. H., Antzelevitch, C. Transient outward current prominent in canine ventricular epicardium but not endocardium. Circ Res. 62 (1), 116-126 (1988).
  20. Lukas, A. Electrophysiology of Myocardial Cells in the Epicardial, Midmyocardial, and Endocardial Layers of the Ventricle. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 2 (1), 61-72 (1997).
  21. Antzelevitch, C., Fish, J. Electrical heterogeneity within the ventricular wall. Basic Res Cardiol. 96 (6), 517-527 (2001).
  22. Gomez, A. M. Modulation of electrical heterogeneity by compensated hypertrophy in rat left ventricle. Am J Physiol. 272 (3 Pt 2), H1078-H1086 (1997).
  23. Efimov, I. R. Innovation in optical imaging: looking inside the heart. Heart Rhythm. 4 (7), 925-926 (2007).
  24. Boukens, B. J., Efimov, I. R. A century of optocardiography. IEEE Rev Biomed Eng. 7, 115-125 (2014).
  25. Zhang, H., Iijima, K., Huang, J., Walcott, G. P., Rogers, J. M. Optical mapping of membrane potential and epicardial deformation in beating hearts. Biophysics J. 111 (2), 438-451 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PLEDFM

مقالات ذات صلة