يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

3D تجميع المغناطيسي الخلايا الجذعية ومفاعل حيوي النضج لتجديد الغضروف

9.9K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/55221

⸱

أبريل 27, 2017

في هذه المقالة

ملخص

تكون الغضروف من الخلايا الجذعية يتطلب ضبط الأوضاع الثقافة. هنا، نقدم نهج المغناطيسي لتكثيف الخلايا، وهي خطوة ضرورية لبدء تكون الغضروف. وبالإضافة إلى ذلك، وتبين لنا أن نضوج الحيوي في مفاعل حيوي ينطبق التحفيز الميكانيكي للبنيات الخلوية ويعزز الغضروفية إنتاج المصفوفة خارج الخلية.

الملخص

تبقى الهندسة الغضروف تحديا يرجع إلى صعوبات في خلق زرع في المختبر وظيفية مماثلة لأنسجة الأم. نهج استكشافها مؤخرا لتطوير بدائل ذاتي ينطوي على تمايز الخلايا الجذعية إلى غضروفية. لبدء هذا تكون الغضروف، وعلى درجة من الضغط من مطلوب الخلايا الجذعية. وبالتالي، أثبتنا جدوى خلايا التكثيف مغناطيسيا، سواء داخل السقالات سميكة وخالية من سقالة، وذلك باستخدام مصادر المجال المغناطيسي المنمنمة كما الجذابون الخلية. وقد استخدم هذا النهج المغناطيسي أيضا لتوجيه الانصهار الكلي ولبناء خالية من سقالة، نظمت، ثلاثي الأبعاد (3D) الأنسجة عدة مليمترات في الحجم. بالإضافة إلى وجود حجم المعزز، قدمت الأنسجة التي شكلتها انصهار مدفوعة المغناطيسي زيادة كبيرة في التعبير عن الكولاجين II، ولوحظ اتجاه مماثل للتعبير aggrecan. كما تعرض الغضروف الأصلي للقوات رقبعة أثرت هيكل 3D لها، وقد أجريت أيضا نضوج ديناميكي. تم استخدام مفاعل حيوي التي توفر المحفزات الميكانيكية للثقافة السقالات المصنف مغناطيسيا على مدى فترة 21 يوما. مفاعل حيوي نضوج تحسنت إلى حد كبير تكون الغضروف في السقالات cellularized. وكانت المصفوفة خارج الخلية التي تم الحصول عليها في ظل هذه الظروف الغنية في الكولاجين II وaggrecan. يحدد هذا العمل إمكانات مبتكرة من التكثيف المغناطيسي للخلايا الجذعية وصفت ونضوج الحيوي في مفاعل حيوي لتحسين التمايز مكون للغضروف، سواء خالية من سقالة وضمن السقالات السكاريد.

المقدمة

يتم استخدام الجسيمات النانوية المغناطيسية بالفعل في العيادة وكلاء النقيض للتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI)، وتطبيقاتها العلاجية الحفاظ على التوسع. على سبيل المثال، فقد تبين مؤخرا أن الخلايا المسمى يمكن التلاعب في الجسم الحي باستخدام مجال مغناطيسي خارجي، ويمكن أن توجه و / أو الاحتفاظ بها في موقع محدد من زرع 1، 2، 3. في مجال الطب التجديدي، ويمكن استخدامها لهندسة الأنسجة المنظمة في المختبر 4، بما في ذلك الأنسجة الوعائية 5، 6،

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. بناء الأجهزة المغناطيسية

ملاحظة: الأجهزة المستخدمة لزرع الخلايا تختلف تبعا لتطبيق (الشكل 1). لتشكيل المجاميع، ويقتصر عدد الخلايا إلى 2.5 × 10 5 / مجموع المباراتين، وبالتالي فإن نصائح المغناطيسية يجب أن تكون رقيقة جدا (750 ميكرون في القطر). البذور 1.8 سم 2/7 السقالات ملم سميكة، ويجب أن يكون المغناطيس أكبر (3 مليمتر في القطر)، وسوف تضمن الهجرة الخلية من خلال مسام السقالة.

  1. بناء جهاز مع المغناطيس الصغيرة للتشكيل الكلي (الشكل ....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

أولا، وحدات يمكن تشكيلها على حدة باستخدام المغناطيس الصغيرة عن طريق إيداع 2.5 × 10 5 الخلايا الجذعية المسمى (الشكل 2A). هذه المجاميع واحدة (~ 0.8 مم في الحجم) ويمكن بعد ذلك أن تنصهر في الهياكل أكبر بفضل متتابعة، والانصهار الناجم مغناطيسيا. على سبيل المثال، في يوم 8 من النضج مكون للغضروف، وضعت المجاميع على اتصال في أزواج لتشكيل الحلل. تم تجميع تواءم في يوم 11 عن طريق دمج 2 الحلل. وأخيرا، في يوم 15، وتنصهر 4 تواءم لتشكيل ب.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

أولا، لأن التقنيات المعروضة هنا تعتمد على استيعاب النانوية المغناطيسية، وقضية واحدة مهمة هي نتائج النانوية بمجرد توطين داخل الخلايا. صحيح أن جزيئات الحديد قد يؤدي السمية المحتملة أو ضعف القدرة على التمايز اعتمادا على حجمها، والطلاء، ووقت التعرض 19 و 22. ومع ذلك، فقد أظهرت العديد من الدراسات أي تأثير على وظائف الخلية عندما تم استخدام الجسيمات النانوية الحديد مغلفة 23 في شكل magnetoferritin، وهي جسيما.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

فإن الكتاب أن نعترف QuinXell تقنيات وCellD، ولا سيما لوثار غرانيمان ودومينيك غزلان لمساعدتهم في مفاعل حيوي. نشكر كاثرين لو سيماء، الذين قدموا لنا مع بولولان / السقالات السكاريد ديكستران. وأيد هذا العمل من قبل الاتحاد الأوروبي (مشروع ERC-2014-الترس ماتيس 648779) والتي AgenceNationalede للبحوث (ANR)، فرنسا (مشروع MagStem ANR-11 SVSE5).

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أكسيد الحديد (maghemite) nanoparticules (γ-Fe2O3)PHENIX - جامعة باريس 6صنع وأعطى بواسطة C. Mé nagerمتوسط قطر 8.1 نانومتر وشحنة سطحية سالبة
سقالات بولولان / ديكسترانLIOAD - جامعة نانتصنع وأعطى بواسطة C. Le Visageأعدت من خليط 75:25 من بولولان / ديكستران في ظروف قلوية (10 & nbsp; م هيدروكسيد). المسامية: 185-205  ومايكرو. m; السماكة: 7   ؛ المليمتر; مساحة السطح: 1.8   سم < سوب>2< / سوب>.
نظام تجديد TisXellQuinXell TechnologiesQX900-002مفاعل حيوي ثنائي المحور مع غرفة ثقافة 500 مل   ؛
قفص للسقالات: Histosette II M492   ؛VWR720-0909
الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC)LonzaPT-2501تم استخدام ثلاث دفعات مستقلة
MSCGM BulletKit mediumLonzaPT-3001للحصول على الوسط الكامل ، أضف BulletKit المتوفرة (التي تحتوي على المصل والجلوتامين والمضادات الحيوية) إلى وسيط MSCGM
DMEM مع Glutamax ILife Technologies31966-021لا يوجد بيروفات الصوديوم ، لا HEPES
RPMI medium 1640 ، لا يحتوي على تقنيات الجلوتامينلايف31870-025لا يوجد بيروفات الصوديوم ، لا HEPES
PBS بدون CaCl 2< / sub > بدون MgCl 2< / sub>Life Technologies14190-094
0.05٪ Trypsin-EDTA (1x) LifeTechnologies25300-054
Penicillin (10,000   U/mL) / Streptomycin (10,000  ومايكرو. جم / مل)Life Technologies15140-122
ITS Premix مكمل ثقافة عالمي (20x)محلول كورنينج354352
بيروفات الصوديوم 100 مليسيجماS8636
L-Ascorbic Acid 2-phosphateSigmaA8960تحضير المحلول المركز (25 ملم) في الماء المقطر بشكل مؤقت
L-ProlineSigmaP5607تحضير محلول المخزون 175 ملي مخفف في الماء المقطر وتخزينه في 4   ؛ ° C
ديكساميثازونسيجماD4902تحضير محلول مخزون 1 ملي مخفف في الإيثانول 100٪ وتخزينه عند -20   ؛ ° C
TGF-beta 3 بروتين 10   ومايكرو. زInterchim30R-AT028
ثلاثي سترات الصوديومVWR33615.268تحضير 1 & nbsp ؛ محلول مخزون M مخفف في الماء المقطر ويخزن في 4 & nbsp ؛ ° C
Pullulanase من Bacillus acidopullulyticus< / em>SigmaP2986
Dextranase من Chaetomium erraticum< / em>SigmaD0443
NucleoSpin RNA ExtractionMacherey-Nagel740955.5
SuperScript II Reverse TranscriptaseLife Technologies18064-014
عشوائي التمهيدي - Hexamer بروميجاC1181500 & مايكرو; جم / مل: استخدم 1/2 مخفف ووضع 1 & micro ؛ L لكل
عينة من الحمض النووي الريبي المؤتلف في مثبط الريبونوكليازPromegaN251140 U/µ ؛ L: ضع 1 & micro ؛ L لكل عينة
مزيج النيوكليوتيدات PCR dNTP (10 & nbsp ؛ ملي ميغابايت لكل منهما)Roche10842321
SyBr Green PCR Master MixLife Technologies4368708
الخطوة الأولى بالإضافة إلى تقنيات حياة نظام PCR في الوقت الحقيقي4381792
حل الفورمالين 10٪ محايدSigmaHT5012
OCT حلVWR361603E
IsopentaneSigmaM32631
تولويدين الأزرق OVWR1.15930.0025
الإيثانول المطلقVWR20821.310
التولوينVWR1.08323.1000
تركيب متوسط PertexHistolab840
RPLP0 Primer ل qPCREurogentec5'-TGCATCAGTAC
CCCATTCTATCAT-3 ';
5'-AAGGTGTAATC
CGTCTCCACAGA-3'Aggrecan
Primer for qPCREurogentec5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3'; 3'-TGTAATGGAACACACGATGCCTTT-5'Collagen
II Primer for qPCREurogentec5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3'; 3'-TCCATGTTGCAGAAACCTTCA-5'
Kit من مخزن

المراجع

  1. Naumova, A. V., Modo, M., Moore, A., Murry, C. E., Frank, J. A. Clinical imaging in regenerative medicine. Nat Biotechnol. 32 (8), 804-818 (2014).
  2. Edmundson, M., Thanh, N. T., Song, B. Nanoparticles based stem cell tracking in regenerative medicine. Theranostics. 3 (8), 573-582 (2....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

التمايز الغضروفيأنسجة خالية من السقالاتسقالات متعددة السكرياتالتكثيف المغناطيسيالنضج الديناميكيتعبير الكولاجين IIتعبير الأجريكانوسم الخلايا الجذعية