مقالة منهجية

البثق الهيدروليكي من الحبل الشوكي وعزل الظهرية جذر العقد في القوارض

53K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/55226

⸱

يناير 22, 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biomedicine, Aarhus University

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نقدم بروتوكولا للبثق الهيدروليكي للحبل الشوكي بالإضافة إلى تحديد وعزل العقد الجذرية الظهرية المحددة (DRGs) في نفس القوارض. بالمقارنة مع طرق عزل الحبل الشوكي القياسية ، فإن هذه الطريقة أسرع بكثير وتقلل من خطر تلف الأنسجة.

الملخص

تقليديا ، يتم عزل الحبل الشوكي عن طريق استئصال الصفيحة الفقرية ، أي عن طريق فتح الفقرات الشوكية واحدة تلو الأخرى. هذا يستغرق وقتا طويلا وقد يؤدي إلى تلف الحبل الشوكي الناجم عن عملية التشريح. هنا ، نوضح كيف يمكن بثق الحبل الشوكي باستخدام الضغط الهيدروليكي. يتم تقليل وقت المناولة بشكل كبير إلى بضع دقائق فقط ، مما يقلل من تلف البروتين. يؤدي انخفاض خطر تلف أنسجة الحبل الشوكي إلى تحسين التحليل الكيميائي المناعي اللاحق. من خلال إجراء بثق الحبل الشوكي الهيدروليكي بدلا من استئصال الصفيحة الفقرية التقليدي ، يمكن استخدام القوارض لعزل DRG ، وبالتالي تقليل عدد والسماح بالتحليل عبر الأنسجة من نفس القوارض. نعرض طريقة متسقة لتحديد وعزل DRGs وفقا لتوطينها بالنسبة إلى costae. ومع ذلك ، من المهم تعديل هذه الطريقة مع المعين المستخدم ، حيث قد يختلف عدد أجزاء الحبل الشوكي ، الصدري وأسفل الظهر ، وفقا لنوع وسلاله بالإضافة إلى ذلك ، نوضح المزيد من أمثلة المعالجة للأنسجة المعزولة.

المقدمة

ويتمثل الهدف العام من هذه الطريقة هو عزل النخاع الشوكي وكذلك لتحديد وعزل DRGs 1 و 2. قذف هيدروليكي من الحبل الشوكي هي طريقة أسرع بكثير من الطريقة التقليدية من العزلة الحبل الشوكي عن طريق الثقب، أي عن طريق كسر فقرات العمود الفقري في وقت واحد، وهذا الأسلوب يقلل من خطر تلف الأنسجة الناجمة عن عملية تشريح 3 و 4 . DRGs قد يكون من الصعب التعرف عليها. التحديد الصحيح مهم للغاية لتحليل الأنسجة، وعلى سبيل المثال بعد إصابة العصب الوركي. بواسطة ترقيم DRGs وفقا لتوطين قريبهم إلى الأضلاع، DRGs يمكن التعرف على الدوام.

الأنسجة المعزولة بفعل تقنيات تظاهر هنا يمكن تطبيقها على مجموعة واسعة من التحليلات بما في ذلك الغرب النشاف 5،6، 7 QPCR وتلطيخ المناعى 8.

عند تحديد DRGs، فمن المهم أن نأخذ في الاعتبار أن يعرف عدد القطع في النخاع الشوكي تختلف مع نوع الحيوان وسلالة 9 و 10 و 11. مزايا في أداء هذا الأسلوب في الفئران هي العدد الكبير من المتغيرات المعدلة وراثيا المتاحة ونفقات السكن منخفضة نسبيا. مزايا في استخدام الفئران هي العائد الأنسجة عالية نسبيا، وإذا تنطوي على إصابات الأعصاب، سيتم تخفيف الإجراءات مع حجم.

البروتوكول

تم التعامل مع جميع الحيوانات في الامتثال الكامل للوائح الدنماركية والأوروبية. عدد إذن: 2012-15-2934.

1. إعداد الحقنة لالبثق الهيدروليكية من الحبل الشوكي

  1. للحصول على الفئران الكبار، واستخدام الحقنة 10 مل. بالنسبة للماوس الكبار، واستخدام 5 مل حقنة. لالجراء، واستخدام حقنة مل 2.5.
  2. ضبط غير مرشح ماصة مناسبة عالميا ل2-200 الماصات ميكرولتر من تقليم نهاية واسعة من طرف ماصة حتى تناسبها بحزم إلى الحقنة. مكان غيض ماصة المعدل على حقنة. لالجراء، استخدم 23 G أو إبرة مماثلة بدلا من غيض ماصة المعدل.
  3. نضح الجليد الباردة برنامج تلفزيوني العقيمة وترك حقنة على الجليد حتى استخدامها مرة أخرى.

2. القتل الرحيم

  1. لا يؤدون خلع عنق الرحم، حيث سيؤدي ذلك إلى زعزعة الاستقرار في فقرات العمود الفقري مما يجعل قذف المستحيل.
  2. للبالغين الفئران / الماوس، الموت ببطء باستخدام الغاز مثل CO 2 أو isofluRANE. هذه المواد الضارة. أداء القتل الرحيم في غطاء الدخان والتعامل مع المواد وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسة. (تنبيه: CO 2: H280، P410، P403، الأيزوفلورين: H361d، P260، P281، P280)
    1. للتأكد من أن القوارض ميت، وضمان عدم وجود رد فعل من قبل معسر مخلب مع ملاقط. قطع رأس القوارض باستخدام مقص كبيرة. لالجراء، الموت ببطء عن طريق قطع الرأس.

3. عزل العمود الفقري

  1. رش الماء على الفراء للسيطرة على الشعر.
  2. باستخدام زوج من مقص، وقطع مفتوحة الفراء على طول العمود الفقري في اتجاه القاصي وعزل العمود الفقري عن طريق خفض على كلا الجانبين على طول العمود الفقري الماضي عظم الحوض. قطع الحبل الشوكي بشكل أقصى للعظم الحوض مع زوج من مقص.
    ملاحظة: هو الرمز محور منقاري-الذيلية كما المحور الداني القاصي في جميع أنحاء البروتوكول.
    1. تقليم العمود الفقري باستخدام زوج من مقص لتجنب proximal-الأكثر والبعيدة في أقصى المناطق لأنها قد تجعل العمود الفقري أيضا S على شكل لنجاح قذف الحبل الشوكي. تأكد من أن الحبل الشوكي مرئيا في كلا الجانبين. إذا كان الحبل الشوكي غير مرئية، وتقليم العمود الفقري مع مقص حتى يصبح الحبل الشوكي مرئية.

4. الهيدروليكية بثق الحبل الشوكي

  1. وضع طبق بتري (100 ملم في القطر) مليئة برنامج تلفزيوني العقيمة على الجليد.
  2. تصويب العمود الفقري من خلال تطبيق السبابة على جزء عازمة (القريبة في أقصى النهاية) من العمود الفقري، وبالتالي استقامة العمود الفقري قدر الإمكان.
    1. لالجراء، وتجنب الانحناء في العمود الفقري، كما سيتم تعطيل فقرات تقديم قذف الحبل الشوكي المستحيل.
  3. إدراج غيض ماصة (23 إبرة G لالجراء، بدلا من 18 إبرة G لفئران بالغة) في البعيدة في أقصى نهاية العمود الفقري. في حالة إدخالها بشكل صحيح، واستقرت طرف في تجويف الشوكي.
  4. تأكد من أن العمود الفقري وتقويمها قدر الإمكان. الضغط المستمر، وقذف الحبل الشوكي في طبق بيتري على الجليد. ضمان أن يتم الاحتفاظ الحبل الشوكي رطبة على الجليد عن طريق الحفاظ عليه في برنامج تلفزيوني حتى مزيد من المعالجة.

figure-protocol-1
الشكل 1: النخاع الشوكي التمثيلية. مقذوف هيدروليكيا النخاع الشوكي. من اليسار إلى اليمين: الفئران الكبار، والماوس الكبار، الجرو الماوس. التوسعات قطني ملحوظ الجزاء من قبل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

5. تحديد الظهرية جذر العقد (DRGs)

  1. انقسام العمود الفقري في جزأين طولية متساوية باستخدام مقص ووضع العمود الفقري الانقسام تحت المجهر.
  2. تحديد شريحة T13 فقرة من قبل تحديد موقع الحجز على القاصي أقصى الضلعي على العمود الفقري العمود الالتفات عدم الخلط بين الأضلاع مع الأعصاب الوربية المجاورة. وترد البعيدة في أقصى الضلعي إلى الجزء القريب من قطاع فقرة T13 ويقع T13 DRG بشكل أقصى للT13 فقرة وقريب إلى فقرة L1.
  3. تحديد DRGs ما يصاحب ذلك في اتجاه البعيدة. لفأر بالغ، تظهر DRGs المصاحبة بيضاء مع ظهري واضحة للعيان والجذور البطنية. بالنسبة للماوس الكبار، تظهر DRGs المصاحبة بيضاء مع ظهري واضحة للعيان والجذور البطنية. لالجراء، ويبدو DRGs يصاحب ذلك مجالات واضحة.

figure-protocol-2
الشكل 2: تحديد DRGs في العمود الفقري بعد قذف الحبل الشوكي. وقد تم تقسيم العمود الفقري مما يسمح التصور من DRGs كما يتبين من السهام. يتضح من الفئران الكبار والجرو الماوس. المرجع = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig2large.jpg" الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

6. عزل DRGs

  1. أطباق عدد بيتري (30 ملم في القطر) وفقا لDRGs محددة لتكون معزولة، على سبيل المثال L3، L4، L5. ملء أطباق بتري مع الثلج الباردة برنامج تلفزيوني العقيمة ووضعها على الجليد.
  2. باستخدام المقص الصغير، وقطع ظهري وبطني جذور أقرب إلى DRGs ممكن لإطلاق سراحهم مع تجنب الإضرار DRGs.
  3. مع غيض من ملاقط مغلقة، مغرفة برفق DRGs ونقلها إلى أطباق بتري مرقمة المقابلة.

figure-protocol-3
الشكل (3): الممثل عزل DRGs. من اليسار إلى اليمين: الفئران الكبار، والماوس الكبار، الجرو الماوس."_blank"> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

7. معالجة الأنسجة لمزيد من التحليل

  1. النشاف الغربي
    1. عزل منطقة الأنسجة من الاهتمام، على سبيل المثال الشوكي توسيع الحبل القطني. إذا لزم الأمر، فصل الحبل الشوكي إلى الجانبين المماثل و المقابل وزيادة في ظهري وبطني قرون.
    2. وضع الأنسجة في تحلل العازلة مثل عازلة TNE تحلل (10 ملم تريس، قاعدة، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، 1٪ NP40 في ضعف المقطر H 2 O) التي تحتوي على مثبطات الانزيم المناسبة على الجليد.
    3. تجانس الأنسجة لحوالي 30 ثانية على الجليد باستخدام طحن مدقة الميكانيكية.
    4. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 16000 x ج في 4 درجات مئوية، واستخدام طاف لمزيد من المعالجة وفقا لبروتوكولات القياسية 5، 6 أو الاحتفاظ طاف في -20 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
  2. الحمض النووي الريبي تحليل
    1. عزل الأنسجة من الاهتمام.
    2. المكان على الفور الأنسجة في حل استقرار RNA لتحقيق الاستقرار في الحمض النووي الريبي للتخزين.
    3. عزل الحمض النووي الريبي وفقا لبروتوكولات القياسية 7.
    4. تحويل الحمض النووي الريبي إلى [كدنا وأداء QPCR وفقا لبروتوكولات القياسية 7.
  3. المناعية
    1. لالأنسجة الطازجة والمجمدة (التي تنطبق على الحبل الشوكي):
      1. إعداد مسحوق الثلج الجاف عن طريق تحطيم مكعبات الثلج الجاف إلى مبلغ مماثل لملعقتين من مسحوق. تغطية مكعبات الثلج الجاف في قطعة قماش ويطحنون مكعبات باستخدام مطرقة. وضع الفضة احباط (حوالي 5 سم × 5 سم) على طبقة من مكعبات الثلج الجاف وتغطية احباط الفضة مع مسحوق الثلج الجاف.
      2. وضع منطقة النخاع الشوكي تم اختيارها لإجراء المزيد من التحليلات على مسحوق الثلج الجاف باستخدام الملقط، والسماح لها المفاجئة للتجمد، ونقل النخاع الشوكي لأنبوب البرد. خليها على الثلج الجاف في جميع الأوقات أو تخزينه في -80 درجة مئوية حتى زيادة لناه.
      3. نقل النخاع الشوكي لناظم البرد (-20 درجة مئوية). إذا لزم الأمر، وتقليم الحبل الشوكي داخل ناظم البرد. وضع الحبل الشوكي في تضمين المواد داخل ناظم البرد من أجل إرفاقه القرص العينة.
      4. قطع الحبل الشوكي في سمك المطلوب، على سبيل المثال 5 ميكرون، وجمع على لوحات الزجاج. تسخين لوحات الزجاج مع الإصبع مباشرة قبل جمع الأنسجة لأفضل المرفق. إبقاء أي نوع من الأنسجة المتبقية في أنابيب البرد في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
      5. ترك الأجزاء على لوحات الزجاج داخل ناظم البرد حتى على استعداد لمرحلة ما بعد التثبيت.
      6. بعد إصلاح الأجزاء عن طريق الغمر في PFA 4٪ لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      7. أداء تلطيخ وفقا لبروتوكولات موحدة 8.
    2. الأنسجة ثابتة لباجتزاء البرد (التي تنطبق على الحبل الشوكي وDRGs)
      1. إصلاح الحبل الشوكي وDRGs في 4٪ PFA (2 ح لالحبل الشوكي، و 1.5 ساعة لDRGs الماوس و4 ساعات لDRGs الفئران) في4 ° C (مكان الحبل الشوكي في وضع أفقي لمنعها من تحديد في موقف عازمة).
      2. نقل الأنسجة إلى 25٪ ث / ت السكروز بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. الأنسجة يمكن تخزينها في 25٪ ث / ت السكروز تستكمل مع بضعة قطرات من 10٪ أزيد الصوديوم لمنع التلوث الميكروبي في 4 درجات مئوية حتى استخدامها مرة أخرى. إذا لزم الأمر، وتقليم الحبل الشوكي لتعويض توسيع قطني فقط على لوحة سيليكون أو ما شابه ذلك.
      3. باستخدام غيض من منشفة ورقية، ونضح حل السكروز الزائد من الأنسجة.
      4. شغل في منتصف الطريق العفن البرد مع تضمين المواد. دفع أي فقاعات على جوانب القالب البرد مع أدوات مثل ملاقط مغلقة.
      5. وضع النسيج على المواد التضمين باستخدام الملقط وضمان التوجه النسيج المطلوب.
      6. ملء القالب البرد تماما مع تضمين المواد ودفع أي فقاعات في اماكن بعيدة من الأنسجة ممكن (مثلا باستخدام الملقط مغلقة).
      7. ملء طبق بتري (100 ملمفي القطر) مع 2-methylbutane. هذه المادة هي الضارة. تنفيذ هذه الخطوة في غطاء الدخان والتعامل مع مادة فقا للمبادئ التوجيهية مؤسسة (تنبيه: H224، H304، H336، H411، P210، P280، P273، P301، P331، P304 / P340، P309 / P310).
      8. وضع طبق بيتري على طبقة من الثلج الجاف وإضافة اثنين من مكعبات الثلج الجاف إلى طبق بيتري. مكان القالب البرد في طبق بتري والسماح للمواد التضمين لتجميد تماما.
      9. الحفاظ على الأنسجة جزءا لا يتجزأ من على الثلج الجاف في جميع الأوقات أو في -80 درجة مئوية ملفوفة في بارافيلم حتى مزيد من المعالجة.
      10. قطع الأنسجة على ناظم البرد (-20 درجة مئوية) في سمك المطلوب، على سبيل المثال 5 ميكرون.
      11. أداء تلطيخ وفقا لبروتوكولات موحدة 8.
    3. الأنسجة ثابتة للالبارافين التضمين (تنطبق على الحبل الشوكي وDRGs)
      1. إصلاح الحبل الشوكي وDRGs في 4٪ PFA (2 ح لالحبل الشوكي، و 1.5 ساعة لDRGs الماوس و4 ساعات لDRGs الفئران) في 4 درجات مئوية (مكان الحبل الشوكيفي وضع أفقي لمنعها من تحديد في موقف عازمة).
      2. نقل الأنسجة إلى 25٪ ث / ت السكروز بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. الأنسجة يمكن تخزينها في 25٪ ث / ت السكروز تستكمل مع بضعة قطرات من 10٪ أزيد الصوديوم لمنع التلوث الميكروبي في 4 درجات مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
      3. عزل منطقة الأنسجة من الاهتمام، على سبيل المثال الشوكي توسيع الحبل القطني.
      4. ملء دمج منتصف الطريق العفن مع البارافين.
      5. تهدئة تضمين العفن لفترة وجيزة عن طريق وضعها على منطقة التبريد من آلة تضمين الى التشدد في البارافين قليلا. وهذا ما يسمح لأفضل المواقع الأنسجة.
      6. وضع الأنسجة في الاتجاه المطلوب في قالب التضمين. ملء القالب تضمين مع البارافين وتبرد فورا.
      7. وضع قالب التضمين التي تحتوي على البارافين في 4 درجات مئوية خلال الليل على السماح لها تتصلب تماما وإزالة كتلة البارافين تحتوي على أنسجة من العفن التضمين.
      8. أقسام قطع سمشراح نا في سمك المطلوب، على سبيل المثال 5 ميكرون.
      9. أداء تلطيخ وفقا لبروتوكولات موحدة 8.

النتائج

النخاع الشوكي مقذوف هيدروليكيا عرض سطح التالفة السلس هو مبين في الشكل 1. يمكن بسهولة التعرف على توسيع قطني باعتبارها منطقة سميكة من الحبل الشوكي، ومحاصر في الشكل 1. ظهري وبطني الجانبين من الحبل الشوكي يمكن تحديدها عن طريق العين وفقا لشكلها. في الشكل 1، والجانب البطني يواجه المشاهد، التعرف عليها عن طريق خط الوسط واحد واضح على طول الحبل الشوكي بأكمله. خطين أوسع على طول الحبل الشوكي تسمح التعرف على الجانب الظهري. وفي البعيدة في أقصى النهاية، ذيل الفرس قد أحيانا لا تزال تعلق في الفئران الكبار والفئران الكبار.

ويمكن تحديد DRGs الفردية فقط، بينما تقع في العمود الفقري، الشكل 2. بعد العزلة، الشكل (3)، وDRGs الفرد لا يمكن تحديدها من خلال المظهر. إذا لزم الأمر، ولذا فمنمهم للحفاظ على فصل واضح على العزلة. بعد العزلة، والحبل الشوكي وDRGs يمكن معالجتها والملون كما هو موضح في الخطوة 7.3 و الممثلة في الشكل (4). ويبين الشكل 4A على تلطيخ المناعى من قسم DRG حيث الخلايا العصبية والخلايا الدبقية الفضائية المحيط بهم هي واضحة للعيان. قبل التحديد الصحيح للDRG أنه من الممكن تحليل أثر إصابات الأعصاب الوركي على سوما من الخلايا العصبية المصابة وكذلك على الخلايا الدبقية الأقمار الصناعية المحيطة بها. ويبين الشكل 4B تلطيخ نيسل من الحبل الشوكي مقذوف هيدروليكيا حيث الأنسجة سليمة كما يتضح من حواف السلس للقسم.

figure-results-1
الشكل 4: أقسام الأنسجة التمثيلية. A. تلطيخ المناعى من قسم DRG. ب. نيسل الملون التقطيعةن من الحبل الشوكي مقذوف هيدروليكيا. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

إذا حدث اضطراب في العمود الفقري، مثلا عن طريق خلع عنق الرحم، والحبل الشوكي تقسيم أثناء قذف. إذا لا يمكن مقذوف الحبل الشوكي، قد تكون قلصت العمود الفقري قليلا عند كلا الطرفين، ويمكن تكرار محاولة قذف. في حال هناك حاجة إلى الحبل الشوكي بأكمله لمزيد من التحليل، أي التي تتكون من توسيع عنق الرحم وكذلك توسيع قطني، وينبغي تقليص العمود الفقري إلا قليلا. إذا كانت هناك حاجة فقط توسيع قطني لمزيد من التحليل، ينبغي أن يقص الحبل الشوكي وفقا لهذا البروتوكول. يجب تقويمها العمود الفقري باستخدام أطراف الأصابع لتخفيف قذف.

بروتوكول ينطبق على القوارض من جميع الأعمار، وهنا يتضح من الماوس الكبار (8 أسابيع)، الجرو الفأر (5 أيام)، والفئران الكبار (10 أسبوعا). اعتمادا على نوع الحيوان والتوتر، وعدد الفقرات الصدرية والقطنية الأقسام قد تختلف 9، 10 و 11. اعتمادا على البروتينات ليتم تحليلها، يمكن perfused القوارض الكبار مع حلول تثبيط انزيم قبل القتل الرحيم. إذا كان أداء تجربة تنطوي إصابة العصب من جانب واحد، والحبل الشوكي ويمكن تقسيمها إلى الجانبين المماثل و المقابل باستخدام الملقط غاية في الدقة على الفور بعد قذف. وعلاوة على ذلك، كل جانب ويمكن تقسيمها إلى ظهري وبطني الجانبين. الأنسجة ثم يمكن معالجتها لإجراء المزيد من التحليلات، على سبيل المثال النشاف الغربي.

Transcardial نضح-تثبيت مع PFA قبل قذف الحبل الشوكي وينبغي تجنبها، لأن هذا يجعل الحبل الشوكي غير مرنة ويمنع الحبل الشوكي البثق الهيدروليكي. سوف هيدروليكي قذف الحبل الشوكي المسيل للدموع قبالة الجذور الظهرية. للتجارب حيث ضرورية الجذور الظهرية المرفقة، ويوصى الثقب. وعلاوة على ذلك، يتم فقدان السحايا في العمود الفقري بواسطة البثق الهيدروليكي، والتي يمكن تجنبها عن طريق الثقب القياسية 3.

ويمكن أيضا أن يؤديها قذف هيدروليكي من الحبل الشوكي والعزلة DRG باستخدام الاوكسيجين السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF) بدلا من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني. استخدام ACSF يسمح الحفاظ على الأنسجة المعزولة في بيئة أفضل الفسيولوجية، وهو أمر مهم لا سيما في حالة التسجيلات الكهربية اللاحقة 12 و 13. بديلا لACSF يمكن أن يكون برنامج تلفزيوني يحتوي على 1 جرام / لتر جلوكوز لتوليد الثقافات DRG الأساسي 14.

قذف هيدروليكي من الحبل الشوكي هي طريقة أسرع بكثير من الطريقة التقليدية من العزلة الحبل الشوكي عن طريق الثقب، وتقليل الوقت اللازم التعامل مع الأنسجة، وبالتالي يقلل من خطر تلف البروتين. نضح مع تثبيتي قبل عزل الحبل الشوكي عن طريق الثقب قد يقلل من خطر تلف الأنسجة أثناء تشريح وخلال إزالة النهائية للالحبل الشوكي من العمود الفقري. ومع ذلك، تثبيت الأنسجة يحول دون تطبيقها على التحليلات مثل الغرب النشاف. عائدات البثق الهيدروليكية هيكليا الأنسجة التالفة 3 مناسبة لمجموعة واسعة من التحليلات.

تحديد ثابت من DRGs قد يكون صعبا. ومع ذلك، وهذا أمر ضروري لتحليل الأنسجة، وعلى سبيل المثال بعد إصابة العصب الوركي. بواسطة ترقيم DRGs وفقا لتوطين قريبهم إلى الأضلاع، DRGs يمكن التعرف على الدوام. قد يكون الأمثل تلطيخ من نسيج الحبل الشوكي وكذلك DRGs عن طريق إجراء تغيرات معالجة الأنسجة يتضح الواردة في بروتوكول الخطوة 7.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نود أن نتوجه بخالص الشكر إلى ديفيد كيل ، جامعة آرهوس ، للتصوير والتحرير. تم استخدام برنامج VirtualDub لمعالجة تسلسلات الفيديو المجهرية. نشكر المعهد الدنماركي للبحوث لعلم الأعصاب الانتقالي - DANDRITE ، وشراكة Nordic EMBL ، للوصول إلى المعدات ومؤسسة أبحاث جامعة آرهوس ، ومشروع الاتحاد الأوروبي 7FP PAINCAGE ، و Det Frie Forskningsrad (DFF) ومؤسسة Lundbeck على التمويل.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مقص بون ، ناعم للغاية ، مستقيم ، 8.5 سمF.S.C. (أدوات العلوم الدقيقة)# 14084-08لقطع الحبل الشوكي قبل عزل DRGs (الفأر البالغ ، الفأر البالغ) ؛ يمكن استخدام مصنع آخر
جهاز طرد مركزيEppendorf# 5427 Rللطرد المركزي للأنسجة المتجانسة
Cryostat microtomeLeica Biosystems# CM 3050 Sلقطع الأنسجة المضمنة قبل التلوين ؛ يمكن استخدام نموذج آخر ومصنع
ملقط ، دومون ، # 3FSC (أدوات العلوم الدقيقة)# 11231-30للتعامل مع الحبل الشوكي بعد البثق ؛ يمكن استخدام الشركة المصنعة / النوع الآخر
ملقط ، دومون ، # 5FSC (أدوات العلوم الدقيقة)# 11252-20لعزل DRGs (الفأر البالغ ، الفئران البالغة ، الجرو) ؛ يمكن استخدام مصنع آخر
Isoflurane (furane) IsoFlo Vet 100٪Abbott# 002185للقتل الرحيم ؛ يمكن استخدام مصنع آخر ؛ تنبيه:
السامة Iso-pentane GPR rectapurVWR# 24872.298لتجميد الأنسجة المفاجئة ؛ يمكن استخدام مصنع آخر ؛ تنبيه:
MicrotomeLeica Biosystemsالسامة # RM 2155لتقسيم الأنسجة المدمجة في البارافين ؛ يمكن استخدام نموذج آخر ومصنع
كريات شمع البارافينSigma-Aldrich# 76243لتضمين البارافين ؛ يمكن استخدام مصنع آخر
تضمين أنسجة البارافينLeica Biosystems# EG1160لتضمين البارافين للأنسجة للتقسيم اللاحق ؛ يمكن استخدام نموذج آخر ومصنع
بيليه مدقة ، محرك لاسلكيSigma-Aldrich# Z359971-1EAللتجانس الميكانيكي للأنسجة المعزولة قبل النشاف الغربي ؛ يمكن استخدام مصنع آخر
طبق بتري ، 35 ممثيرمو فيشر علمي# 121 فولتلتخزين DRGs المعزولة ؛ يمكن استخدام مصنع وحجم آخر
طبق بتري ، 100 ممسيجما ألدريتش# P7741لبثق الحبل الشوكي ؛ يمكن استخدام مصنع وحجم آخر
مثبط الفوسفاتيز ،سيجما ألدريتش# 04906845001لإضافة إلى عازلة تحلل TNE إذا لزم الأمر ؛ يمكن استخدام طرف ماصة أخرى
، 1-200 مو ؛ L ، لا يوجد مرشحSarstedt# 70.1189.105للبثق الهيدروليكي ؛ يمكن استخدام مصنع آخر
مثبط البروتياز ، كوكتيل مثبطسيجما ألدريتش# 05892791001لإضافة إلى مخزن تحلل TNE إذا لزم الأمر ؛ يمكن استخدام مصنع آخر
RNAlater حلSigma-Aldrich# R0901لتثبيت الحمض النووي الريبي للتخزين ؛ يمكن استخدام مصنع آخر
Rneasy Protect Mini KiTQiagen# 74124لعزل الحمض النووي الريبي ؛ يمكن استخدام مصنع آخر
مشرط. شفرة جراحية سوان مورتون رقم 11سوان مورتون# REF0203لعزل منطقة أسفل الظهر في الحبل الشوكي ؛ يمكن استخدام مصنع / نوع آخر
مقص ، مستقيم ، نوع 3 ، 25 مم حافة القطعBochem# 4070لعزل العمود الفقري ؛ يمكن استخدام مصنع / نوع آخر
مقص ، 130 مم حافة القطعHounisen# 1902.0130لعزل الحبل الشوكي (الفئران البالغة)
مقص زنبركي ، مستقيم ، 8 ممF.S.C. (أدوات العلوم الجميلة)# 15009-08لقطع العمود الفقري قبل عزل DRGs (الجرو) وعزل DRGs (الفأر البالغ ، الفئران البالغة ، الجرو) ؛ يمكن استخدام الشركة المصنعة الأخرى
المحاقن القياسية ، 2.5 مل ، 5 مل ، 10 ملTerumo# SS02SE1 ؛ # SS05SE1 ؛ # SS10SE1للبثق الهيدروليكي ؛ يمكن استخدام مصنع آخر
مجهر مجهر مجسمة MZ12.5 مع موضوعي 1X وعدسة 10XLeica# 10446370استخدام الشركة المصنعة / النوع الآخر
المعقم PBSGIBCO# 10010-015للبثق الهيدروليكي ؛ يمكن أيضا تصنيعها وفقا للبروتوكولات القياسية
إبرة حقنة 23 جم × 1 بوصة ، 0.6 × 25 ممTerumo Neolus# NN-2325Rللبثق الهيدروليكي في الجراء ؛ يمكن استخدام الشركة المصنعة / النوع الآخر
إبرة حقنة 18 جم × 1 1/2 ، 1.2 × 40 ممTerumo Neolus# NN-1838Sبديل لطرف الماصة للبثق الهيدروليكي في الفئران البالغة ؛ يمكن استخدام مصنع آخر
Tissue-TekSakura# 4583Tssue مواد التضمين للاستقطاق بالتبريد
للموادالكيميائية VWRTNE # 10128-582لتحلل الأنسجة قبل النشاف الغربي ؛ يمكن استخدام مصنع آخر ؛ يمكن أيضا تصنيعها وفقا للبروتوكولات القياسية
المواد الكيميائية محطة كوكتيل مثبط فوسستوب يمكن لاحقا للتحليل الحراري

المراجع

  1. Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).
  2. Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Res Notes. 9, 82(2016).
  3. Kennedy, H. S., Jones, C. 3rd, Caplazi, P. Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice. J Histotechnol. 36 (3), 86-91 (2013).
  4. Meikle, A. D., Martin, A. H. A rapid method for removal of the spinal cord. Stain Technol. 56 (4), 235-237 (1981).
  5. JoVE Science Education Database. The Western Blot. , JoVE. Cambridge, MA. http://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot (2016).
  6. Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. J Vis Exp. (16), (2008).
  7. Ogrean, C., Jackson, B., Covino, J. Quantitative real-time PCR using the thermo scientific Solaris qPCR assay. J Vis Exp. (40), (2010).
  8. Crosby, K., et al. Immunohistochemistry Protocol for Parraffin-embedded Tissue Sections - ADVERTISEMENT. , JoVE. Cambridge, MA. https://www.jove.com/video/5064/immunohistochemistry-protocol-for-paraffin-embedded-tissue-sections (2014).
  9. Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. The Mouse Nervous System. , 1st edition, Academic Press, Elsevier. 424-426 (2012).
  10. Rigaud, M., et al. Species and strain differences in rodent sciatic nerve anatomy: implications for studies of neuropathic pain. Pain. 136 (1-2), 188-201 (2008).
  11. Green, E. L. Genetic and non-genetic factors which influence the type of the skeleton in an inbred strain of mice. Genetics. 26 (2), 192-222 (1941).
  12. Meyer, A., Gallarda, B. W., Pfaff, S., Alaynick, W. Spinal cord electrophysiology. J Vis Exp. (35), (2010).
  13. Ciglieri, E., Ferrini, F., Boggio, E., Salio, C. An improved method for in vitro morphofunctional analysis of mouse dorsal root ganglia. Ann Anat. , 62-67 (2016).
  14. Peeraer, E., et al. Pharmacological evaluation of rat dorsal root ganglion neurons as an in vitro model for diabetic neuropathy. J Pain Res. 4, 55-65 (2011).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

عزل الحبل الشوكيتشريح القوارضتحضير الأنسجةالتحليل الكيميائي النسيجي المناعيلطخة ويسترنتحليل الحمض النووي الريبيالتقطيع بالتجميدالطمر في البارافين
البثق الهيدروليكي من الحبل الشوكي وعزل الظهرية جذر العقد في القوارض
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.