تقييم وظيفي للوصلات العصبية العضلية (NMJ) يمكن أن توفر معلومات أساسية عن الاتصال بين العضلات والأعصاب. هنا يمكننا وصف بروتوكول شامل تقييم وظائف العضلات و NMJ استخدام اثنين الاستعدادات العصبية العضلية المختلفة، أي سولاس الوركي والحجاب الحاجز فرنك.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وظائف الوصلات العصبية العضلية (NMJ) يلعب دوراً محوريا عند دراسة الأمراض التي يكون فيها الاتصال بين الخلايا العصبية الحركية في العضلات والبصر، مثل الشيخوخة والتصلب العضلي الجانبي (المرض). يصف لنا هنا بروتوكولا تجريبية التي يمكن استخدامها لقياس الأداء الوظيفي NMJ عن طريق الجمع بين نوعين من التحفيز الكهربائي: المباشر الغشاء العضلي وتنشيط عن طريق العصب. يمكن أن تساعد مقارنة استجابة العضلات لهذه التحفيز مختلفة اثنين تعريف، على المستوى الوظيفي، التعديلات المحتملة في NMJ التي تؤدي إلى انخفاض الوظيفية في العضلات.
ﻫx vivo الاستعدادات المناسبة للدراسات التي تسيطر عليها جيدا. هنا يصف لنا على بروتوكول مكثف لقياس العديد من المعلمات للعضلات ووظائف NMJ لإعداد العصب الوركي سولاس وإعداد عصب الحجاب الحاجز فرنك. البروتوكول تستغرق حوالي 60 دقيقة، وتتم دون انقطاع عن طريق مصنوعة خصيصا البرمجيات أن التدابير الخصائص الحركية نشل والعلاقة قوة التردد للتحفيز على حد سواء من العضلات والأعصاب ومعلمتين من معلمات محددة إلى NMJ وظيفة، أي فشل كبيرة والتعب إينتراتيتانيك. واستخدمت هذه المنهجية للكشف عن الأضرار في الاستعدادات العصبية العضلية سولاس والحجاب الحاجز باستخدام الماوس SOD1G93A المعدلة وراثيا، ونموذج تجريبي للمرض أوبيكويتوسلي أوفيريكسبريسيس الفاءق دسموتاز إنزيم متحولة المضادة للأكسدة 1 (SOD1).
المقدمة
الوصلات العصبية العضلية (NMJ) هو المشبك الكيميائي يتكون من الاتصال بين اندبلت موتور للألياف العضلية واكسون الحركية الطرفية. لقد ثبت NMJ للعب دور حاسم عندما يكون الاتصال بين العضلات والعصب البصر، كما يحدث في الشيخوخة أو التصلب العضلي الجانبي (المرض). التمكن من قياس العيوب NMJ بشكل منفصل من العيوب العضلية كما العضلات والأعصاب التواصل بطريقة ثنائية الاتجاه1،2، قد توفر رؤى جديدة في تفاعلها فيسيوباثولوجيكال. وفي الواقع، قد يساعد هذا التقييم الوظيفي تقييم ما إذا كانت التعديلات الشكلية أو البيوكيميائية تخفيض كبيرة مما يشير إلى وظيفة.
واقترح مقارنة استجابة العضلات الهوس بتحفيز العصب واستجابة العضلات نفسه أثارت قبل التحفيز المباشر غشاء كمقياس غير مباشر لوظائف NMJ. في الواقع، منذ غشاء التحفيز التي يمر إشارات كبيرة، يمكن أن يعزى إلى التغييرات في NMJ أي اختلافات في الاستجابات الهوس اثنين. هذا النهج قد تم على نطاق واسع المقترحة للفئران3،،من45،،من67، وتستخدم أيضا لجمع معلومات عن الماوس نماذج8،،من910،،من1112.
هنا، نحن تصف بالتفصيل إجراء للمكوس واختبار الاستعدادات العصبية العضلية اثنين، أي الأعمال التحضيرية سولاس الوركي والحجاب الحاجز فرنك. استخدام مصنوعة خصيصا البرمجيات، وصممنا على بروتوكول اختبار مستمر الذي يجمع بين قياس العديد من المعلمات التي تميز وظيفة NMJ والعضلات، مما تسفر عن إجراء تقييم شامل للأضرار NMJ بشكل منفصل عن العضلات. على وجه الخصوص، تدابير البروتوكول القوة نشل حركية العضلات، ومنحني قوة التردد لمباشرة والعصبية التحفيز، فشل كبيرة13 سواء إطلاق نار والترددات تيتانيك و التعب إينتراتيتانيك7.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على جميع التجارب الحيوانية من قبل لجنة الأخلاقيات في جامعة سابينزا في روما-وحدة علم الأنسجة والأجنة الطبية، وأُجريت وفقاً للإصدار الحالي من القانون الإيطالي بشأن حماية الحيوانات.
1. الإعداد التجريبي
- قم بتجهيز النظام التجريبي المكون من مشغل/محول طاقة واحد، ومحفزين، وجهاز عضلات in-vitro واحد، وحمام أنسجة تحضيري واحد، وقطب امتصاص واحد، وراسم تذبذب رقمي واحد، ومجهر ستيريو واحد، ومسلط ضوء بارد واحد، ولوحة استحواذ واحدة، وكتلة توصيل واحدة، وجهاز كمبيوتر شخصي.
ملاحظة: تم برمجة برنامج التحكم هنا باستخدام LabView وصُمم لضمان مرونة ودقة وقابلية تكرار عالية للتحفيزات. يمكن للمستخدم، لكل عملية تحفيز، اختيار عرض النبضة، والتردد، والمدة، وتحديد ما إذا كان سيتم إيصال التحفيز إلى الغشاء أو عبر العصب. كما يمكن للمستخدم تحديد طول فترة الراحة قبل كل عملية تحفيز.
2. تقييمات الخصائص الانقباضية للوصلة العصبية العضلية في عضلة السمان وعضلة الحجاب الحاجز
- إحماء النظام
- قم بتحضير محلول Krebs Ringer المنظم14 وضعه في حوض جهاز التثبيت وفي حوض تحضير الأنسجة. ضع طبقاً بقطر 60 مم مُحضراً بـ 4 ml من السيليكون في حوض تحضير الأنسجة.
- قم بتشغيل حمام الماء الدوار واضبط درجة الحرارة على 30 °C للعضلة النعلية وعلى 27 °C لعضلة الحجاب الحاجز.
- اسمح لخليط 95% O2 - 5% CO2 بالتدفق في كلا الحوضين.
- قم بتشغيل المشغل/المحول والمحفزين النبضيين واضبط قيم التيار على 300 mA لتحفيز الغشاء وعلى 5 mA لتحفيز العصب.
ملاحظة: سبق أن ثبت أن قيمة التيار 300 mA لا تسبب أي انقباض ملحوظ في الفروع العصبية عند إضافة D-tubocurarine إلى المحلول15. وتتوافق قيمة التيار 5 mA مع كمية التيار المطلوبة لتحفيز العضلة عبر العصب دون إحداث تداخل مع تحفيز الغشاء الناجم عن المحلول. وبما أن المسافة بين قطب الشفط والعضلة تعتمد على طول العصب، فيجب ضبط قيمة التيار هذه بعناية قبل كل تجربة، كما هو موضح أدناه.
- تشريح العضلة النعلية والحجاب الحاجز
- قم بالتضحية بالفأر عن طريق خلع الفقرات العنقية لتقليل المعاناة، ثم استأصل العضلات المخصصة للاختبار فوراً كما يلي.
- تحضير وتشريح وتجهيز العضلة النعلية والعصب الوركي
- رش الإيثانول بتركيز 70% على ساق الفأر وأزل الجلد الذي يغطي الساق. اصنع شقاً في الجزء العلوي من الساق باستخدام مقص ثم اسحب الجلد بقوة. اعزل وتر أخيل عن الظنبوب ثم اقطع وتر أخيل باستخدام المقص.
- ثبّت الوتر بإحكام باستخدام ملقط واسحب العضلة التوأمية الساقية برفق جنباً إلى جنب مع العضلة النعلية. وبمجرد ظهور الوتر القريب للعضلة النعلية، اقطع ربلة الساق بالكامل باستخدام المقص مع الاستمرار في الإمساك بوتر أخيل. ضع عينة النسيج فوراً في حوض تحضير الأنسجة.
- ضع حوض التحضير تحت المجهر المجسم وثبّت ربلة الساق في طبق السيليكون باستخدام دبابيس من الفولاذ المقاوم للصدأ بقطر 0.20 mm. باستخدام ملقط، ثبت الوتر القريب للعضلة النعلية واسحبه برفق للكشف عن التعصيب الوركي.
- بمجرد ظهور التعصيب (الشكل 1)، قم بإزالة الأنسجة المحيطة بعناية للكشف عن حوالي 5 mm من العصب. استخدم مقصاً دقيقاً لقطع العصب. وأثناء تثبيت العضلة النعلية بإحكام عند الوتر القريب باستخدام ملقط، اسحبها مرة أخرى واستأصلها عن طريق قطع وتر أخيل بالمقص.
- مرر سلك نايلون عبر فتحة ذراع الرافعة للمشغل/المحول. اصنع عروة في نهاية السلك وأمسك بوتر أخيل قبل سحب السلك للخلف حتى تصل العضلة إلى حوض جهاز التثبيت. ثبت الوتر القريب داخل المشبك الثابت واربط سلك النايلون حول ذراع الرافعة. اترك العضلة لتتوازن في المحلول.
- حدد الطول الأمثل الأولي (L0).
- أولاً، قم بمد العضلة لتحميلها مسبقاً عند 10 mN (تضمن هذه القيمة أقصى قوة ارتجاف بناءً على الخبرة). ثم مد العضلة برفق لتغيير الحمل المسبق وحفزها بسلسلة من النبضات المنفردة. يتم تحقيق الطول الأمثل عند قياس أقصى قوة ارتجاف.
- تحضير وتشريح وتجهيز الحجاب الحاجز والعصب الحجابي
- رش الإيثانول بتركيز 70% على جلد الفأر. أزل الجلد الذي يغطي عضلة الحجاب الحاجز عن طريق إجراء شق فوق عظمة القص باستخدام مقص وسحب الجلد بقوة.
- باستخدام مقص، اقطع البطن أفقياً أسفل عظمة القص وأزل الأمعاء والأعضاء برفق باستخدام ملقط. استخدم مقصاً سميكاً لقطع العمود الفقري.
- اقطع الأضلاع على مسافة حوالي 1 cm فوق عظمة القص وتابع أفقياً. أزل الأعضاء الخارجية برفق باستخدام ملقط واقطع العمود الفقري للحصول على حلقة دائرية من الأضلاع تحتوي على الحجاب الحاجز.
- اغسل التحضير في طبق يحتوي على محلول Krebs Ringer المنظم ثم ضعه في طبق السيليكون داخل حوض تحضير الأنسجة، بحيث يكون الجانب العلوي موجهاً للأعلى وعظمة القص موجة للأمام.
- باستخدام المجهر المجسم، أزل الرئتين والأعضاء المتبقية بعناية؛ سيكون العصب الحجابي مرئياً على الجانب الأيمن (الشكل 2A).
- قم بتقليم الأضلاع لترك حلقة بحوالي 2 mm على طول الحجاب الحاجز.
- باستخدام ملقط، ثبت دبوساً واحداً من الفولاذ المقاوم للصدأ بقطر 0.20 mm على الوتر المركزي للحجاب الحاجز عند النقطة المقابلة لتعصيب العصب الحجابي، ودبوساً آخر على الأضلاع على نفس المحور لتحديد شريحة الحجاب الحاجز المطلوبة.
- ثبت دبوسين إضافيين على الوتر المركزي ودبوسين آخرين على الأضلاع على جانبي الشريحة المختارة لفرد الحجاب الحاجز. إذا لزم الأمر، نظف العصب الحجابي من النسيج الضام المحيط باستخدام ملقط.
- باستخدام شفرة منحنية، اقطع الحجاب الحاجز على جانبي التعصيب لتحديد شريحة (وتر-عضلة-ضلع) كما هو موضح في الشكل 2B.
- مرر سلك نايلون عبر فتحة ذراع الرافعة للمشغل/المحول. اصنع عروة في نهاية السلك وأمسك بالوتر قبل سحب السلك للخلف حتى تصل العضلة إلى حوض جهاز التثبيت.
- ثبت الأضلاع داخل المشبك الثابت واربط سلك النايلون حول ذراع الرافعة.
- اترك العضلة لتتوازن في المحلول وحدد الطول الأمثل الأولي (L0).
- مد العضلة لتحميلها مسبقاً عند 5 mN. مد العضلة برفق لتغيير الحمل المسبق وحفزها بسلسلة من النبضات المنفردة. يتم تحقيق الطول الأمثل عند قياس أقصى قوة ارتجاف.
الشكل 1 - تحضير العضلة النعلية والعصب الوركي. العضلة النعلية والعصب الوركي أثناء العملية الجراحية لإجراء الاختبارات الوظيفية. يتم كشف العصب الوركي باستخدام زوج من الملاقط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2 - تحضير العصب الحجابي-الحجاب الحاجز. تظهر الصورة مرحلة استئصال تحضير العصب الحجابي-الحجاب الحاجز (A) والشريحة التي سيتم تثبيتها للاختبارات الوظيفية (B). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
- قياس خصائص الوصل العضلي العصبي (NMJ) بشكل منفصل عن انقباض العضلات
- حدد أفضل شدة تيار للتحفيز عبر العصب، وتحقق من أن نبضات التيار التي يتم إيصالها عبر قطب الشفط لا تسبب انقباض العضلات نتيجة انتشار التيار في الحمام.
- ضع قطب الشفط بالقرب من العضلة واسحب العصب للداخل. أثناء زيادة شدة التيار تدريجياً (بدءاً من 5 mA)، قم بتحفيز العضلة بسلسلة من النبضات المنفردة. يتم تحديد قيمة التيار المثلى عندما تكون قوة النفضة في حدها الأقصى.
- ادفع العصب خارج القطب وأرسل بضع نبضات منفردة. تأكد من أن العضلة لا تنقبض بسبب التداخل مع تحفيز الغشاء عن طريق المحلول. اسحب العصب للداخل مرة أخرى.
- قم بتشغيل البرنامج واختيار ملف الإدخال لتنفيذ بروتوكول الاختبار المطلوب.
ملاحظة: يتضمن ملف الإدخال جميع معاملات التحفيز اللازمة لتنفيذ البروتوكول كاملاً. وبالرغم من استخدام نفس هيكل البروتوكول لكلتا العضلتين، إلا أن معاملات التحفيز تختلف بناءً على ما إذا كان البروتوكول يشير إلى العضلة النعلية أو عضلة الحجاب الحاجز.- تحفيز العصب الوركي-العضلة النعلية (انظر الجدول 1)
- استخدم عرض النبضات التالي لجميع عمليات التحفيز الكهربائي: 1.4 ms لتحفيز العصب الوركي و 0.1 ms للتحفيز المباشر للعضلة النعلية. يستغرق البروتوكول كاملاً 65 min تقريباً.
- تحفيز العصب الحجابي-عضلة الحجاب الحاجز (انظر الجدول 2)
- استخدم عرض النبضات التالي لجميع عمليات التحفيز الكهربائي: 1.8 ms لتحفيز العصب الحجابي و 0.2 ms للتحفيز المباشر لعضلة الحجاب الحاجز. يستغرق البروتوكول كاملاً 55 min تقريباً.
- في نهاية البروتوكول التجريبي، قم بقياس طول والوزن الرطب للعضلة باستخدام فرجار تماثلي بدقة 0.05 mm وميزان دقيق بدقة 0.1 mg، على التوالي.
- احسب مساحة المقطع العرضي (CSA) بقسمة كتلة العضلة على حاصل ضرب طول الليفة المثالي (Lf) وكثافة العضلات الهيكلية للثدييات (1.06 mg/mm3)16.
ملاحظة: يتم الحصول على Lf بضرب L0 في نسبة طول الليفة/طول العضلة (0.71 للعضلة النعلية16 و 1 لعضلة الحجاب الحاجز17).
- احسب مساحة المقطع العرضي (CSA) بقسمة كتلة العضلة على حاصل ضرب طول الليفة المثالي (Lf) وكثافة العضلات الهيكلية للثدييات (1.06 mg/mm3)16.
- تحفيز العصب الوركي-العضلة النعلية (انظر الجدول 1)
- حدد أفضل شدة تيار للتحفيز عبر العصب، وتحقق من أن نبضات التيار التي يتم إيصالها عبر قطب الشفط لا تسبب انقباض العضلات نتيجة انتشار التيار في الحمام.
| نوع التجربة | التردد | المدة | التكرارات | تحفيز العضلة أو العصب | الغرض |
| (Hz) | (s) | ||||
| تقلص نفضي | نبضة واحدة | 1 | العضلة | قوة وحركية التقلص النفضي | |
| راحة | 30 | ||||
| تقلص نفضي | نبضة واحدة | 1 | العصب | ||
| راحة | 30 | ||||
| تقلص نفضي | نبضة واحدة | 1 | العضلة | ||
| راحة | 30 | ||||
| تقلص نفضي | نبضة واحدة | 1 | العصب | ||
| راحة | 120 | ||||
| كزاز غير اندماجي | 40 | 0.8 | 1 | العصب | منحنيات القوة/التردد لتحفيز العصب والعضلات |
| راحة | 180 | ||||
| كزاز غير اندماجي | 60 | 0.8 | 1 | العضلة | |
| راحة | 180 | ||||
| كزاز اندماجي | 80 | 0.8 | 1 | العصب | |
| راحة | 180 | ||||
| كزاز غير اندماجي | 20 | 0.8 | 1 | العضلة | |
| راحة | 180 | ||||
| كزاز غير اندماجي | 60 | 0.8 | 1 | العصب | |
| راحة | 180 | ||||
| كزاز اندماجي | 80 | 0.8 | 1 | العضلة | |
| راحة | 180 | ||||
| كزاز غير اندماجي | 20 | 0.8 | 1 | العصب | |
| راحة | 180 | ||||
| كزاز غير اندماجي | 40 | 0.8 | 1 | العضلة | |
| راحة | 300 | ||||
| نموذج الإجهاد | 35 | 0.8 | تحفيز عضلي واحد يليه 14 تحفيزاً عصبياً مع وقت راحة قدره 1.2 s لكل منها، وتكرر العملية 20 مرة | فشل النقل العصبي (NF) | |
| راحة | 900 | ||||
| نموذج الإجهاد | 80 | 0.8 | تحفيز عضلي واحد يليه 14 تحفيزاً عصبياً مع وقت راحة قدره 1.2 s لكل منها، وتكرر العملية 20 مرة | فشل النقل العصبي (NF) والإجهاد داخل الكزاز (IF) | |
الجدول 1 - بروتوكول تحفيز العصب الوركي-العضلة النعلية. يدرج الجدول تسلسل الاختبارات التي تشكل البروتوكول الكامل لاختبار تحضيرات العصب الوركي-العضلة النعلية.
| نوع التجربة | التردد | المدة | التكرارات | تحفيز العضلات أو الأعصاب | الغرض |
| (Hz) | (s) | ||||
| نفضة | نبضة واحدة | 1 | عضلة | قوة النفضة وحركيتها | |
| راحة | 30 | ||||
| نفضة | نبضة واحدة | 1 | عصب | ||
| راحة | 30 | ||||
| نفضة | نبضة واحدة | 1 | عضلة | ||
| راحة | 30 | ||||
| نفضة | نبضة واحدة | 1 | عصب | ||
| راحة | 120 | ||||
| كزاز غير اندماجي | 60 | 0.5 | 1 | عصب | منحنيات القوة/التردد لتحفيز الأعصاب والعضلات |
| راحة | 120 | ||||
| كزاز اندماجي | 100 | 0.5 | 1 | عضلة | |
| راحة | 180 | ||||
| كزاز غير اندماجي | 40 | 0.5 | 1 | عصب | |
| راحة | 120 | ||||
| كزاز غير اندماجي | 20 | 0.5 | 1 | عضلة | |
| راحة | 120 | ||||
| كزاز غير اندماجي | 80 | 0.5 | 1 | عصب | |
| راحة | 150 | ||||
| كزاز غير اندماجي | 80 | 0.5 | 1 | عضلة | |
| راحة | 150 | ||||
| كزاز غير اندماجي | 20 | 0.5 | 1 | عصب | |
| راحة | 120 | ||||
| كزاز اندماجي | 100 | 0.5 | 1 | عضلة | |
| راحة | 150 | ||||
| كزاز اندماجي | 100 | 0.5 | 1 | عصب | |
| راحة | 180 | ||||
| كزاز غير اندماجي | 60 | 0.5 | 1 | عضلة | |
| راحة | 300 | ||||
| نموذج الإرهاق | 35 | 0.33 | تحفيز عضلي واحد يليه 14 تحفيزاً عصبياً مع وقت راحة قدره 0.67 s لكل منها، مكررة 20 مرة | فشل النقل العصبي (NF) | |
| راحة | 900 | ||||
| نموذج الإرهاق | 80 | 0.33 | تحفيز عضلي واحد يليه 14 تحفيزاً عصبياً مع وقت راحة قدره 0.67 s لكل منها، مكررة 20 مرة | فشل النقل العصبي (NF) والإرهاق داخل الكزاز (IF) | |
الجدول 2 - بروتوكول تحفيز العصب الحجابي-الحجاب الحاجز.يسرد الجدول تسلسل الاختبارات التي تشكل البروتوكول الكامل لاختبار تحضيرات العصب الحجابي-الحجاب الحاجز.
3. تحليل البيانات
ملاحظة: في نهاية البروتوكول، قم بحساب جميع المعايير المطلوبة على النحو التالي.
- من خلال التحفيز بنبضة واحدة
- احسب قوة الارتجاف (mN؛ أقصى قوة نشطة يتم توليدها أثناء الارتجاف) وقوة الارتجاف النوعية (mN/mm2). يتم حسابها بطرح قيمة التحميل المسبق الأولية من أقصى قوة تولدها العضلة. ثم تحسب قوة الارتجاف النوعية بقسمة قوة الارتجاف على مساحة المقطع العرضي (CSA) للعضلة.
- احسب زمن الوصول إلى ذروة التوتر (TTP) (ms) باعتباره الزمن المنقضي من إطلاق النبضة حتى الوصول إلى قوة الارتجاف.
- احسب نصف زمن الاسترخاء (1/2RT) (ms) باعتباره الزمن المنقضي من قوة الارتجاف حتى الوصول إلى 50% من قوة الارتجاف.
- احسب dF/dt (mN/ms) باعتبارها القيمة القصوى لمشتق القوة خلال مرحلة الانقباض.
- احسب -dF/dt (mN/ms) باعتبارها القيمة القصوى لمشتق القوة خلال مرحلة الاسترخاء.
- من خلال تحفيزات سلسلة النبضات
- احسب القوة غير المندمجة (mN) والقوة غير المندمجة النوعية (mN/mm2). يتم حسابها بطرح قيمة التحميل المسبق الأولية من أقصى قوة تولدها العضلة. ثم تحسب القوة غير المندمجة النوعية بقسمة القوة غير المندمجة على مساحة المقطع العرضي (CSA) للعضلة.
ملاحظة: القوة غير المندمجة هي أقصى قوة نشطة يتم توليدها خلال سلسلة نبضات بتردد أقل من التردد الكززي. - احسب القوة الكززية (mN) والقوة الكززية النوعية (mN/mm2)؛ القوة القصوى هي أقصى قوة نشطة يتم توليدها خلال سلسلة نبضات يتم تقديمها بالتردد الكززي. يتم حسابها بطرح قيمة التحميل المسبق الأولية من أقصى قوة تولدها العضلة. ثم تحسب القوة الكززية النوعية بقسمة القوة الكززية على مساحة المقطع العرضي (CSA) للعضلة.
- احسب منحنى القوة-التردد. قم برسم قيمة القوة (أو القوة النوعية) التي تم الحصول عليها لكل تحفيز مقابل التردد المتزايد للتحفيز. وعادة ما يبدأ هذا المنحنى بتحفيز النبضة الواحدة وينتهي بالتردد الكززي.
- احسب القوة غير المندمجة (mN) والقوة غير المندمجة النوعية (mN/mm2). يتم حسابها بطرح قيمة التحميل المسبق الأولية من أقصى قوة تولدها العضلة. ثم تحسب القوة غير المندمجة النوعية بقسمة القوة غير المندمجة على مساحة المقطع العرضي (CSA) للعضلة.
- من خلال نماذج الإجهاد
- احسب فشل النقل العصبي (NF) كما يلي:
حيث MF هو انخفاض القوة بعد تحفيز العضلة و F هو انخفاض القوة بعد تحفيز العصب، ويقاس ذلك في أول سلسلة نبضات بعد تحفيز العضلة. - احسب الإجهاد داخل الكزاز (IF) كما يلي:
حيث Flp هي القوة التي تولدها العضلة عند النبضة الأخيرة من التحفيز، و Fm هي أقصى قوة تولدها العضلة خلال سلسلة النبضات نفسها. وفيما يتعلق بتحفيز العصب، يتم حساب الإجهاد داخل الكزاز في أول سلسلة نبضات مباشرة بعد التحفيز المباشر.
- احسب فشل النقل العصبي (NF) كما يلي:
4. التحليل الإحصائي
ملاحظة: يجب اختيار نماذج التحليل الإحصائي بناءً على ما إذا كانت مقارنة استجابة العضلات لكل من التحفيز العصبي والغشائي تتم ضمن نفس النموذج الحيواني أو بين نموذجين حيوانيين مختلفين18,19.
- استخدم اختبار Student's t لـ TTP و 1/2RT و dF/dt و -dF/dt في حال مقارنة استجابات العضلات للتحفيز المباشر وغير المباشر فقط. أما في حال مقارنة تحضيرات عضلية تم الحصول عليها من سلالتين مختلفتين من الفئران، فاستخدم تحليل التباين ثنائي الاتجاه (2-way ANOVA) مع اعتبار نوع التحفيز وسلالة الفئران كعوامل ثابتة. وعندما يعطي تحليل التباين ثنائي الاتجاه نتيجة ذات دلالة إحصائية، استخدم اختبارات المقارنات المتعددة للبحث عن الفروق الإحصائية.
- بالنسبة لمنحنى القوة-التردد (في حال مقارنة استجابات العضلات للتحفيز المباشر وغير المباشر فقط)، استخدم تحليل التباين ثنائي الاتجاه (2-way ANOVA) مع اعتبار نوع التحفيز وتردد التحفيز كعوامل ثابتة. واستخدم اختبارات المقارنات المتعددة إذا لزم الأمر.
- في حال مقارنة تحضيرات عضلية تم الحصول عليها من سلالتين مختلفتين من الفئران، استخدم تحليل التباين ثلاثي الاتجاه (3-way ANOVA) مع اعتبار نوع التحفيز وتردد التحفيز وسلالة الفئران كعوامل ثابتة.
- عندما ينتج عن تحليل التباين ثلاثي الاتجاه تأثير معنوي لعواملي سلالة الحيوان ونوع التحفيز، استخدم تحليل التباين ثنائي الاتجاه (2-way ANOVA) لتحديد الفروق الجوهرية بين مجموعتين في كل مرة. على سبيل المثال، يمكن تقييم الفروق بين استجابة العضلات للمجموعتين تجاه تحفيز الغشاء، أو بين استجابة العضلات للتحفيز المباشر وغير المباشر ضمن مجموعة واحدة.
- في حال مقارنة تحضيرات عضلية تم الحصول عليها من سلالتين مختلفتين من الفئران، استخدم تحليل التباين ثلاثي الاتجاه (3-way ANOVA) مع اعتبار نوع التحفيز وتردد التحفيز وسلالة الفئران كعوامل ثابتة.
- الإجهاد داخل التكزز (Intratetanic fatigue)
ملاحظة: نظراً لأن البروتوكول صُمم لتحفيز الإجهاد استجابةً لتحفيز العصب حتى في فئران المجموعة الضابطة، فإن هذا المعامل يمكن استخدامه فقط لاستقصاء الفروق بين سلالتين من الفئران، حيث إن التحليل الإحصائي ضمن مجموعة واحدة سيعطي دائماً فروقاً ذات دلالة إحصائية.- لمقارنة مجموعتين، استخدم تحليل التباين ثلاثي الاتجاه (3-way ANOVA) مع اعتبار نوع التحفيز والوقت وسلالة الفئران كعوامل ثابتة. وعندما ينتج عن تحليل التباين ثلاثي الاتجاه تأثير معنوي لعواملي سلالة الحيوان ونوع التحفيز، استخدم تحليل التباين ثنائي الاتجاه (2-way ANOVA) لتحديد الفروق الجوهرية بين مجموعتين في كل مرة، كما هو الحال في منحنى القوة-التردد.
- بالنسبة لفشل النقل العصبي، استخدم تحليل التباين ثنائي الاتجاه (2-way ANOVA) مع اعتبار سلالة الحيوان والوقت كعوامل ثابتة. وإذا أعطى نتائج ذات دلالة إحصائية، استخدم اختبارات المقارنات المتعددة للبحث عن الفروق الإحصائية.
ملاحظة: بما أن هذا المعامل يعطي قيمة واحدة فقط لكل سلالة من الفئران، فإنه يسمح بمقارنة نماذج الفئران المختلفة. - بالنسبة لوزن العضلة وطولها ومساحة المقطع العرضي (CSA)، استخدم اختبار Student's t لاستقصاء الفروق عند مقارنة تحضيرات العصب والعضلة من نماذج حيوانية مختلفة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ينص البروتوكول على وصفت لنا معلومات على إزالة التعصيب الوظيفية في العديد من الأمراض العصبية العضلية أو الشيخوخة-ساركوبينيا. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد ما إذا كان (وإذا كان الأمر كذلك، على أي مستوى) التعديلات العضلات سبب انتقائية من التغيرات التي تحدث في العضلات نفسها أو في الإرسال العصبية العضلية. البيانات المبينة أدناه هي نتائج أعمال سابقة لدينا مجموعة18، أجريت على نموذج الفأر وراثيا SOD1G93A التصلب العضلي الجانبي في المرحلة النهائية من المرض
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
ويوفر البروتوكول التجريبي المبين أعلاه وسيلة مثالية لقياس وتمييز أي التعديلات الفنية التي حدثت في العضلات مباشرة أو غير مباشر على مستوى الوصلات العصبية العضلية. وبهذا الأسلوب يستند إلى مقياس غير مباشر لوظائف NMJ، لا يمكن استخدامه لإثبات إذا كان أي عيب هو يتصل بالتغييرات الشكلية أو التغيرات البيوكيميائية. على النقيض من ذلك، فإنه يوفر وسيلة فعالة لتحديد ما إذا كان أي من التعديلات الشكلية أو البيوكيميائية خفضت كبيرة مما يشير إلى وظيفة. بيد بعد الانتهاء من قياسات القوة، العضلات يمكن إزالتها من الحمام، مسح، والمثبتة في الطول ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
العمل في مختبر صاحبي تدعمها مؤسسة الغجر والحفل الخيري (منحة لا. GGP14066).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| نظام ذراع الوضع المزدوج | شركة أورورا العلمية | 300B | المحرك / محول الطاقة |
| محفز ؛ | شركة أورورا العلمية | 701B | (العصب) محفز |
| ثنائي الطور عالي الطاقة ؛ | شركة أورورا العلمية | 701C | (العضلات) |
| جهاز العضلات في المختبر ; | شركة أورورا العلمية | 800A | |
| حمام المناديل التحضيرية | Radnoti | 158400 | |
| أحادي القطب شفط الكهربائي | أنظمة AM | 573000 | مع مرجع محلي الصنع |
| راسم الذبذبات | Tektronix | TDS2014 | |
| مجهر مجهر مجسم | نيكون | SMZ 800 | |
| إضاءة باردة | البصريات الضوئية | PL 3000 | |
| لوحة الاستحواذ | الوطنية الأدوات | NI PCIe-6353 | |
| كتلة موصل | الأدوات الوطنية | NI 2110 | |
| الكمبيوتر الشخصي | AMD Phenom II x4 970 | المعالج 3.50 جيجا هرتز مع ويندوز 7 | |
| برنامج LabView 2012 | National Instruments | ||
| Krebs-Ringer بيكربونات Buffer | سيجما ألدريتش | K4002 | عازلة فسيولوجية |
| بيكربونات الصوديوم | Sigma-Aldrich | S5761 ؛ | |
| كلوريد الكالسيوم CaCl 2< / sub> | Sigma-Aldrich | C4901 | اللامائي ، مسحوق ، & ge ؛ 97٪ |
| عازلة HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | &ge ؛ 99.5٪ (معايرة بالتحليل الحجمي) |
| أطباق 60 مم × 15 مم | فالكون | 353004 | البوليسترين |
| سيليكون | سيلجارد & nbsp ؛ | 184 سيليكون | طقم المطاط الصناعي 0.5 كجم. |
| ترموستات | Dennerle | DigitalDuomat 1200 | |
| Pump | Newa Mini | MN 606 | لحوض السمك |
| المقاومة للحرارة | الزواحف المحظوظة | 61403-1 | 50 / 60 هرتز 50 واط |
| دلو | أي 10 لترات | من مادة البولي بروبيلين | |
| O2< / sub> + 5٪ CO2 | Siad | Mix | |
| Gas # 5 Plumps ؛ | أدوات العلوم | الدقيقة 11252-20 | 2 قطعة |
| مقص زنبركي - شفرات 8 مم | أدوات العلوم الدقيقة | 15024-10 | استئصال الأعصاب |
| مقص حاد ؛ | أدوات العلوم الدقيقة | 14059-11 | إزالة العضلات |
| مقص دقيق | فاغنر | 02.06.32 | خارجي من |
| مقبض مشرط الطالب # 3 | أدوات العلوم الجميلة ؛ | 91003-12 | |
| شفرات مشرط #10 | أدوات العلوم الدقيقة | 10010-00 | |
| شفرات مشرط #11 | أدوات العلوم الدقيقة | 10011-00 | |
| سلك نايلون & Oslash ؛ 0.16 ملم | أي |
المراجع
- Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. The "dying-back" phenomenon of motor neurons in ALS. J Mol Neurosci. 43 (3), 470-477 (2011).
- Dobrowolny, G., et al. Skeletal Muscle Is a Primary Target of SOD1G93A-Mediated Toxicity. Cell Metab. 8 (5), 425-436 (2008).
- Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Neurotrophins improve neuromuscular transmission in the adult rat diaphragm. Muscle Nerve. 29 (3), 381-386 (2004).
- Prakash, Y. S., Miyata, H., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Inactivity-induced remodeling of neuromuscular junctions in rat diaphragmatic muscle. Muscle Nerve. 22 (3), 307-319 (1999).
- Sieck, D. C., Zhan, W. Z., Fang, Y. H., Ermilov, L. G., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Structure-activity relationships in rodent diaphragm muscle fibers vs. neuromuscular junctions. Respir Physiol Neurobiol. 180 (1), 88-96 (2012).
- Van Lunteren, E., Moyer, M. Effects of DAP on diaphragm force and fatigue, including fatigue due to neurotransmission failure. J Appl Physiol. 81 (5), 2214-2220 (1996).
- Van Lunteren, E., Moyer, M., Kaminski, H. J. Adverse effects of myasthenia gravis on rat phrenic diaphragm contractile performance. J Appl Physiol. 97 (3), 895-901 (2004).
- Lee, Y., Mikesh, M., Smith, I., Rimer, M., Thompson, W. Muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy show profound defects in neuromuscular development even in the absence of failure in neuromuscular transmission or loss of motor neurons. Dev Biol. 356 (2), 432-444 (2011).
- Personius, K. E., Sawyer, R. P. Variability and failure of neurotransmission in the diaphragm of mdx mice. Neuromuscular Disord. 16 (3), 168-177 (2006).
- Röder, I. V., Petersen, Y., Choi, K. R., Witzemann, V., Hammer, J. A., Rudolf, R. Role of myosin Va in the plasticity of the vertebrate neuromuscular junction in vivo. PLoS ONE. 3 (12), e3871(2008).
- Chevessier, F., et al. A mouse model for congenital myasthenic syndrome due to MuSK mutations reveals defects in structure and function of neuromuscular junctions. Hum Mol Genet. 17 (22), 3577-3595 (2008).
- Farchi, N., Soreq, H., Hochner, B. Chronic acetylcholinesterase overexpression induces multilevelled aberrations in mouse neuromuscular physiology. J Physiol. 546 (1), 165-173 (2002).
- Kuei, J. H., Shadmehr, R., Sieck, G. C. Relative contribution of neurotransmission failure to diaphragm fatigue. J Appl Physiol (Bethesda, Md: 1985). 68 (1), 174-180 (1990).
- Del Prete, Z., Musarò, A., Rizzuto, E. Measuring mechanical properties, including isotonic fatigue, of fast and slow MLC/mIgf-1 transgenic skeletal muscle. Ann Biomed Eng. 36 (7), 1281-1290 (2008).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old. J Physiol. 535 (2), 591-600 (2001).
- Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice. J Physiol. 404, 71-82 (1988).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Faulkner, J. A. Force and power output of diaphragm muscle strips from mdx and control mice after clenbuterol treatment. Neuromuscul Disord. 11 (2), 192-196 (2001).
- Rizzuto, E., Pisu, S., Musar, A., Del Prete, Z. Measuring Neuromuscular Junction Functionality in the SOD1 G93A Animal Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Ann Biomed Eng . 43, (2015).
- Soliani, L. Manuale di statistica per la ricerca e la professione statistica univariata e bivariata parametrica e non-parametrica per le discipline ambientali e biologiche. , (2004).
- Gurney, M. E., Pu, H., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science (New York, N.Y). 264 (5166), 1772-1775 (1994).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
