Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Emanuele Rizzuto; Simona Pisu; Carmine Nicoletti; Zaccaria Del Prete; Antonio Musar&#242;

doi:10.3791/55227

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Research Article

قياس الأداء الوظيفي الوصلات العصبية العضلية

DOI: 10.3791/55227

August 6, 2017

Emanuele Rizzuto¹, Simona Pisu², Carmine Nicoletti², Zaccaria Del Prete^1,3, Antonio Musarò^2,3

¹Department of Mechanical and Aerospace Engineering,Sapienza University of Rome, ²Institute Pasteur Cenci-Bolognetti, DAHFMO-Unit of Histology and Medical Embryology,Sapienza University of Rome, ³Center for Life Nano Science@Sapienza,Istituto Italiano di Tecnologia

Cite Watch Download PDF Download Material list

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

In This Article

Summary Abstract Introduction Protocol Representative Results Discussion Disclosures Acknowledgements Materials References Reprints and Permissions

Summary

تقييم وظيفي للوصلات العصبية العضلية (NMJ) يمكن أن توفر معلومات أساسية عن الاتصال بين العضلات والأعصاب. هنا يمكننا وصف بروتوكول شامل تقييم وظائف العضلات و NMJ استخدام اثنين الاستعدادات العصبية العضلية المختلفة، أي سولاس الوركي والحجاب الحاجز فرنك.

Abstract

وظائف الوصلات العصبية العضلية (NMJ) يلعب دوراً محوريا عند دراسة الأمراض التي يكون فيها الاتصال بين الخلايا العصبية الحركية في العضلات والبصر، مثل الشيخوخة والتصلب العضلي الجانبي (المرض). يصف لنا هنا بروتوكولا تجريبية التي يمكن استخدامها لقياس الأداء الوظيفي NMJ عن طريق الجمع بين نوعين من التحفيز الكهربائي: المباشر الغشاء العضلي وتنشيط عن طريق العصب. يمكن أن تساعد مقارنة استجابة العضلات لهذه التحفيز مختلفة اثنين تعريف، على المستوى الوظيفي، التعديلات المحتملة في NMJ التي تؤدي إلى انخفاض الوظيفية في العضلات.

ﻫx vivo الاستعدادات المناسبة للدراسات التي تسيطر عليها جيدا. هنا يصف لنا على بروتوكول مكثف لقياس العديد من المعلمات للعضلات ووظائف NMJ لإعداد العصب الوركي سولاس وإعداد عصب الحجاب الحاجز فرنك. البروتوكول تستغرق حوالي 60 دقيقة، وتتم دون انقطاع عن طريق مصنوعة خصيصا البرمجيات أن التدابير الخصائص الحركية نشل والعلاقة قوة التردد للتحفيز على حد سواء من العضلات والأعصاب ومعلمتين من معلمات محددة إلى NMJ وظيفة، أي فشل كبيرة والتعب إينتراتيتانيك. واستخدمت هذه المنهجية للكشف عن الأضرار في الاستعدادات العصبية العضلية سولاس والحجاب الحاجز باستخدام الماوس SOD1^G93A المعدلة وراثيا، ونموذج تجريبي للمرض أوبيكويتوسلي أوفيريكسبريسيس الفاءق دسموتاز إنزيم متحولة المضادة للأكسدة 1 (SOD1).

Introduction

الوصلات العصبية العضلية (NMJ) هو المشبك الكيميائي يتكون من الاتصال بين اندبلت موتور للألياف العضلية واكسون الحركية الطرفية. لقد ثبت NMJ للعب دور حاسم عندما يكون الاتصال بين العضلات والعصب البصر، كما يحدث في الشيخوخة أو التصلب العضلي الجانبي (المرض). التمكن من قياس العيوب NMJ بشكل منفصل من العيوب العضلية كما العضلات والأعصاب التواصل بطريقة ثنائية الاتجاه¹^،²، قد توفر رؤى جديدة في تفاعلها فيسيوباثولوجيكال. وفي الواقع، قد يساعد هذا التقييم الوظيفي تقييم ما إذا كانت التعديلات الشكلية أو البيوكيميائية تخفيض كبيرة مما يشير إلى وظيفة.

واقترح مقارنة استجابة العضلات الهوس بتحفيز العصب واستجابة العضلات نفسه أثارت قبل التحفيز المباشر غشاء كمقياس غير مباشر لوظائف NMJ. في الواقع، منذ غشاء التحفيز التي يمر إشارات كبيرة، يمكن أن يعزى إلى التغييرات في NMJ أي اختلافات في الاستجابات الهوس اثنين. هذا النهج قد تم على نطاق واسع المقترحة للفئران³^،^،من⁴⁵^،^،من⁶⁷، وتستخدم أيضا لجمع معلومات عن الماوس نماذج⁸^،^،من⁹¹⁰^،^،من¹¹¹².

هنا، نحن تصف بالتفصيل إجراء للمكوس واختبار الاستعدادات العصبية العضلية اثنين، أي الأعمال التحضيرية سولاس الوركي والحجاب الحاجز فرنك. استخدام مصنوعة خصيصا البرمجيات، وصممنا على بروتوكول اختبار مستمر الذي يجمع بين قياس العديد من المعلمات التي تميز وظيفة NMJ والعضلات، مما تسفر عن إجراء تقييم شامل للأضرار NMJ بشكل منفصل عن العضلات. على وجه الخصوص، تدابير البروتوكول القوة نشل حركية العضلات، ومنحني قوة التردد لمباشرة والعصبية التحفيز، فشل كبيرة¹³ سواء إطلاق نار والترددات تيتانيك و التعب إينتراتيتانيك⁷.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب على من قبل لجنة الأخلاقيات بجامعة سابينزا في روما - وحدة علم الأنسجة والأجنة الطبية وتم إجراؤها وفقا للنسخة الحالية من القانون الإيطالي لحماية.

< p class = "jove_title" >1. الإعداد التجريبي

قم بإعداد النظام التجريبي المكون من 1 مشغل / محول طاقة ، 2 محفزات ، 1 جهاز عضلي في المختبر ، 1 حمام أنسجة تحضيري ، 1 قطب شفط ، 1 راسم الذبذبات الرقمي ، 1 مجهر مجسم ، 1 إضاءة ضوء بارد ، 1 لوحة اقتناء ، 1 كتلة موصل وجهاز كمبيوتر شخص><ي. ملاحظة: هنا تمت برمجة برنامج الأوامر في LabView وتم تصميمه لضمان مرونة عالية ودقة وتكرار المحفزات. لكل تحفيز ، يمكن للمستخدم تحديد عرض النبضة والتردد والمدة وتحديد ما إذا كان يتم توصيله إلى الغشاء أو من خلال العصب. يمكن للمستخدم أيضا تحديد طول فترة الراحة قبل كل تحفيز.

فئة

2. تقييمات خصائص انقباض NMJ لعضلات النعل والحجاب الحاجز

إحماء النظام
1. قم بإعداد Krebs Ringer buffer¹⁴ وضعها في حمام جهاز التثبيت وحمام الأنسجة التحضيرية. ضع طبقا مقاس 60 مم محضرا ب 4 مل من السيليكون في حمام المناديل التحضيري.
2. قم بتشغيل الحمام المائي المتداول واضبط درجة الحرارة على 30 درجة مئوية للعضلة النعل وعلى 27 درجة مئوية لعضلة الحجاب
3. اترك خليط 95٪ O₂ - 5٪ CO₂يتدفق إلى كلا الحمامين.
4. قم بتشغيل المشغل / محول الطاقة ومحفزي النبض واضبط القيم الحالية على 300 مللي أمبير لتحفيز الغشاء وإلى 5 مللي أمبير لتحفيز العصب.
  ملاحظة: لقد ثبت سابقا أن القيمة الحالية 300 مللي أمبير لا تسبب أي تقلص كبير على الفروع العصبية عند إضافة D-tubocurarine إلى المحلول< فئة sup = "xref">15. تتوافق القيمة الحالية 5 مللي أمبير مع مقدار التيار المطلوب لتحفيز العضلات عبر العصب دون إحداث تداخل مع تحفيز الغشاء الناجم عن المحلول. نظرا لأن المسافة بين قطب الشفط والعضلة تعتمد على طول العصب ، يجب تعديل هذه القيمة الحالية بعناية قبل كل تجربة ، كما هو موضح أدناه.
تسلخ السليوس والحجاب الحاجز
1. التضحية بالفأر عن طريق خلع عنق الرحم لتقليل المعاناة ، واستئصال العضلات على الفور لاختبارها على النحو التالي.
2. تحضير وتشريح وإعداد وليليوس وركي
  1. رش 70٪ من الإيثانول على ساق الفأر وإزالة الجلد الذي يغطي الساق. قم بعمل شق في الجزء العلوي من الساق بمقص ثم اسحب الجلد بقوة. اعزل وتر العرقوب عن الظنبوب ثم اقطع وتر العرقوب بمقص.
  2. قم بتثبيت الوتر بإحكام باستخدام زوج من الملقط واسحب عضلة المعدة برفق مع النعل. بمجرد أن ينكشف الوتر القريب من النعل ، اقطع ربلة الساق بالكامل بمقص مع الاستمرار في الإمساك بوتر العرقوب. ضع عينة الأنسجة على الفور في حمام الأنسجة التحضيرية.
  3. ضع الحمام التحضيري تحت المجهر المجسم وقم بتثبيت العجل في طبق السيليكون باستخدام دبابيس من الفولاذ المقاوم للصدأ بقطر 0.20 مم. باستخدام زوج من الملقط ، قم بتثبيت الوتر القريب من النعل واسحبه برفق لفضح التعصيب الوركي.
  4. بمجرد الكشف عن التعصيب (<فئة قوية = "xfig">الشكل 1) ، قم بإزالة الأنسجة المحيطة بعناية لكشف حوالي 5 مم من العصب. استخدم مقصا جيدا لقطع العصب. أثناء تثبيت النعل بإحكام على الوتر القريب بزوج من الملقط ، اسحبه مرة أخرى واستئصله عن طريق قطع وتر العرقوب بزوج من المقص.
  5. مرر سلك نايلون من خلال فتحة ذراع ذراع المشغل / محول الطاقة. قم بإنشاء حبل المشنقة في نهاية السلك وامسك وتر العرقوب قبل سحب السلك للخلف حتى تصل العضلة إلى حمام جهاز التثبيت. قم بتثبيت الوتر القريب داخل المشبك الثابت واربط سلك النايلون حول ذراع الرافعة. اسمح للعضلات بالتوازن في المحلول.
  6. حدد الطول الأمثل الأولي (L₀).
    1. أولا ، قم بتمديد العضلات لتحميلها مسبقا عند 10 مللي نيوتن (تضمن هذه القيمة أقصى قوة ارتعاش (بناء على الخبرة)). بعد ذلك ، قم بتمديد العضلات برفق لتغيير الحمل المسبق وتحفيزها بسلسلة من النبضات المفردة. يتم تحقيق الطول الأمثل عند قياس أقصى قوة ارتعاش.
3. تحضير الحجاب الحاجز والتشريح والإعداد
  1. رش 70٪ إيثانول على جلد الفأر. قم بإزالة الجلد الذي يغطين عضلة الحجاب الحاجز عن طريق عمل شق على عظم القص بمقص وشد الجلد بقوة.
  2. باستخدام مقص ، قم بقص البطن أفقيا أسفل القص وقم بإزالة الأمعاء والأعضاء برفق باستخدام زوج من الملقط. استخدم مقصا سميكا لقطع العمود الفقري.
  3. اقطع الضلوع حوالي 1 سم فوق القص واستمر أفقيا. قم بإزالة الأعضاء الخارجية برفق باستخدام زوج من الملقط وقطع العمود الفقري للحصول على حلقة دائرية من الأضلاع تحتوي على الحجاب
  4. اغسل المستحضر في طبق يحتوي على مخزن Krebs Ringer المؤقت ثم ضعه في طبق السيليكون داخل حمام المناديل التحضيرية ، بحيث يكون الجانب العلوي متجها لأعلى والقص متجها للأمام.
  5. باستخدام المجهر المجهري ، قم بإزالة الرئتين والأعضاء المتبقية بعناية ؛ سيكون العصب الحجابي مرئيا على الجانب الأيمن (<فئة قوية = "xfig">الشكل 2 أ).
  6. قم بقص الضلوع لتترك حلقة حوالي 2 مم على طول الحجاب الحاجز.
  7. باستخدام الملقط ، قم بتثبيت دبوس واحد من الفولاذ المقاوم للصدأ بقطر 0.20 مم على الوتر المركزي للحجاب الحاجز عند النقطة المقابلة لتعصيب العصب الحجابي ، ودبوس آخر على الأضلاع على نفس المحور لتحديد شريط الحجاب الحاجز المثير للاهتمام.
  8. قم بتثبيت دبابيس إضافية على الوتر المركزي ودبابيس أخرى على الأضلاع على جانبي الشريط المحدد لوضع الحجاب الحاجز. إذا لزم الأمر ، قم بتنظيف العصب الحجابي من النسيج الضام المحيط باستخدام الملقط.
  9. باستخدام شفرة منحنية ، قم بقص الحجاب الحاجز على جانبي التعصيب لتحديد شريط الوتر والعضلة والضلع كما هو موضح في <فئة قوية = "xfig">الشكل 2 ب.
  10. مرر سلك نايلون من خلال فتحة ذراع ذراع المشغل / محول الطاقة. قم بإنشاء حبل المشنقة في نهاية السلك وامسك الوتر قبل سحب السلك للخلف حتى تصل العضلة إلى حمام جهاز التثبيت.
  11. قم بتثبيت الأضلاع داخل المشبك الثابت واربط سلك النايلون حول ذراع الرافعة.
  12. اسمح للعضلات بالتوازن في المحلول وتحديد الطول الأمثل الأولي (L0).
    1. قم بتمديد العضلات لتحميلها مسبقا عند 5 ملي نيوتن. قم بتمديد العضلات برفق لتغيير الحمل المسبق وتحفيزها بسلسلة من النبضات المفردة. يتم تحقيق الطول الأمثل عند قياس أقصى قوة ارتعاش.

<فئة قوية = "xfig">الشكل 1 - تحضير العصب الوركي اللوليوسي. العصب الوركي اللوليجي أثناء العملية الجراحية للاختبارات الوظيفية. يتعرض الوركي باستخدام زوج من الملقط. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >

<فئة قوية = "xfig">الشكل 2 - تحضير العصب الحجابي الحجابي. تظهر الصورة مرحلة من استئصال تحضير العصب الحجابي الحجابي (A) والشريط المراد تركيبه للاختبارات الوظيفية (B). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

قياس خصائص NMJ بشكل منفصل عن انقباض العضلات
1. اضبط أفضل شدة تيار للتحفيز عبر العصب وتحقق من أن النبضات الحالية التي يتم توصيلها عبر قطب الشفط لا تثير تقلص العضلات عن طريق انتشار التيار في الحمام.
  1. ضع قطب الشفط بالقرب من العضلة واسحب العصب للداخل. مع زيادة شدة التيار بلطف (بدءا من 5 مللي أمبير) ، قم بتحفيز العضلات بسلسلة من النبضات المفردة. يتم تحديد القيمة الحالية المثلى عندما تكون قوة الارتعاش هي الأقصى.
  2. ادفع العصب خارج القطب الكهربائي وقم بتوصيل بضع نبضات مفردة. تأكد من أن العضلات لا تنقبض بسبب التداخل مع تحفيز الغشاء عن طريق المحلول. اسحب العصب مرة أخرى.
2. قم بتشغيل البرنامج وحدد ملف الإدخال لتشغيل بروتوكول الاختبار المطلوب.
  ملاحظة: يتضمن ملف الإدخال جميع معلمات التحفيز اللازمة لتشغيل البروتوكول بأكمله. على الرغم من استخدام نفس هيكل البروتوكول للعضلتين ، إلا أن معلمات التحفيز تختلف اعتمادا على البروتوكول الذي يشير إلى عضلات النعل أو الحجاب الحاجز.
  1. تحفيز العصب الوركي الوحشي (انظر الجدول 1)
    1. استخدم عرض النبض التالي لجميع المحفزات الكهربائية: 1.4 مللي ثانية لتحفيز العصب الوركي و 0.1 مللي ثانية للتحفيز المباشر للنعل. يستمر البروتوكول الكامل حوالي 65 دقيقة.
  2. تحفيز العصب الحجابي الحجابي (انظر الجدول 2)
    1. استخدم عرض النبض التالي لجميع المحفزات الكهربائية: 1.8 مللي ثانية لتحفيز العصب الحجابي و 0.2 مللي ثانية للتحفيز المباشر للحجاب الحاجز. يستمر البروتوكول الكامل حوالي 55 دقيقة.
  3. في نهاية البروتوكول التجريبي ، قم بقياس طول العضلة ووزنها الرطب باستخدام الفرجار التناظري بدقة 0.05 مم ومقياس دقيق بدقة 0.1 مجم ، على التوالي.
    1. احسب مساحة المقطع العرضي (CSA) بقسمة كتلة العضلات على ناتج طول الألياف الأمثل (L_f) وكثافة عضلات الهيكل العظمي للثدييات (1.06 مجم / مم³) < فئة الدعم = "xref" >16.
      ملاحظة: يتم الحصول على L_f بضرب L₀في نسبة طول الألياف / طول العضلات (0.71 للعضلة الوحيدة < فئة sup = "xref" >16 و 1 لعضلة الحجاب الحاجز < فئة sup = "xref" >17).

نوع التجربة تردد مدة التكرار تحفيز العضلات أو الأعصاب قصد (هرتز) (ق) نشل نبضة واحدة 1 عضل قوة الارتعاش والحركية استراح 30 < td colspan = "2" > نشل نبضة واحدة 1 عصب استراح 30 < td colspan = "2" > نشل نبضة واحدة 1 عضل استراح 30 < td colspan = "2" > نشل نبضة واحدة 1 عصب استراح 120 حيا الكزاز غير الملتهر 40 0.8 1 عصب منحنيات القوة / التردد لتحفيز الأعصاب والعضلات استراح 180 < td colspan = "2" > الكزاز غير الملتهر 60 0.8 1 عضل استراح 180 < td colspan = "2" > كزاز منصهر 80 0.8 1 عصب استراح 180 < td colspan = "2" > الكزاز غير الملتهر 20 0.8 1 عضل استراح 180 < td colspan = "2" > الكزاز غير الملتهر 60 0.8 1 عصب استراح 180 < td colspan = "2" > كزاز منصهر 80 0.8 1 عضل استراح 180 < td colspan = "2" > الكزاز غير الملتهر 20 0.8 1 عصب استراح 180 < td colspan = "2" > الكزاز غير الملتهر 40 0.8 1 عضل استراح 300 ريال نموذج التعب 35 0.8 1 تحفيز العضلات متبوعا ب 14 تحفيزا عصبيا مع وقت راحة 1.2 ثانية لكل منهما ، يتكرر 20 مرة فشل النقل العصبي (NF) استراح 900 ريال نموذج التعب 80 0.8 1 تحفيز العضلات متبوعا ب 14 تحفيزا عصبيا مع وقت راحة 1.2 ثانية لكل منهما ، يتكرر 20 مرة فشل النقل العصبي (NF) والتعب العصبي (IF)

الجدول 1 - بروتوكول تحفيز العصب الوركي اللوليوي. يسرد الجدول تسلسل الاختبارات التي تشكل البروتوكول الكامل لاختبار مستحضرات العصب الوركي الوحي.

نوع التجربة تردد مدة التكرار تحفيز العضلات أو الأعصاب قصد (هرتز) (ق) نشل نبضة واحدة 1 عضل قوة الارتعاش والحركية استراح 30 < td colspan = "2" > نشل نبضة واحدة 1 عصب استراح 30 < td colspan = "2" > نشل نبضة واحدة 1 عضل استراح 30 < td colspan = "2" > نشل نبضة واحدة 1 عصب استراح 120 حيا الكزاز غير الملتهر 60 0.5 1 عصب منحنيات القوة / التردد لتحفيز الأعصاب والعضلات استراح 120 حيا < td colspan = "2" > كزاز منصهر 100 0.5 1 عضل استراح 180 < td colspan = "2" > الكزاز غير الملتهر 40 0.5 1 عصب استراح 120 حيا < td colspan = "2" > الكزاز غير الملتهر 20 0.5 1 عضل استراح 120 حيا < td colspan = "2" > الكزاز غير الملتهر 80 0.5 1 عصب استراح 150 حيا < td colspan = "2" > الكزاز غير الملتهر 80 0.5 1 عضل استراح 150 حيا < td colspan = "2" > الكزاز غير الملتهر 20 0.5 1 عصب استراح 120 حيا < td colspan = "2" > كزاز منصهر 100 0.5 1 عضل استراح 150 حيا < td colspan = "2" > كزاز منصهر 100 0.5 1 عصب استراح 180 < td colspan = "2" > الكزاز غير الملتهر 60 0.5 1 عضل استراح 300 ريال نموذج التعب 35 0.33 دولار 1 تحفيز العضلات متبوعا ب 14 تحفيزا عصبيا مع وقت راحة 0.67 ثانية لكل منهما ، يتكرر 20 مرة فشل النقل العصبي (NF) استراح 900 ريال نموذج التعب 80 0.33 دولار 1 تحفيز العضلات متبوعا ب 14 تحفيزا عصبيا مع وقت راحة 0.67 ثانية لكل منهما ، يتكرر 20 مرة فشل النقل العصبي (NF) والتعب العصبي (IF)

الجدول 2 - بروتوكول تحفيز العصب الحجابي الحجابي. يسرد الجدول تسلسل الاختبارات التي تشكل البروتوكول الكامل لاختبار مستحضرات العصب الحجابي الحجابي.

3. تحليل البيانات

ملاحظة: في نهاية البروتوكول ، احسب جميع المعلمات المطلوبة على النحو التالي.

من تحفيز النبضة الواحدة
1. حساب قوة الارتعاش (mN؛ القوة النشطة القصوى المتولدة أثناء الارتعاش) وقوة الارتعاش المحددة (mN/mm²). قم بحسابه عن طريق طرح قيمة التحميل المسبق الأولية إلى أقصى قوة تولدها العضلات. احسب قوة الارتعاش المحددة كقوة ارتعاش مقسومة على CSA العضلي.
2. احسب الوقت حتى ذروة التوتر (TTP) (مللي ثانية) كوقت من إطلاق النبض إلى قوة الارتعاش.
3. احسب نصف وقت الاسترخاء (1/2RT) (مللي ثانية) كوقت من قوة الارتعاش إلى 50٪ من قوة الارتعاش.
4. احسب dF / dt (mN / ms) كقيمة قصوى لمشتق القوة أثناء مرحلة الانكماش.
5. احسب -dF / dt (mN / ms) كقيمة قصوى لمشتق القوة أثناء مرحلة الاسترخاء.
من محفزات قطار النبض
1. احسب القوة غير المنصهرة (mN) والقوة المحددة غير المنصهرة (mN/mm²). قم بحسابه عن طريق طرح قيمة التحميل المسبق الأولية إلى أقصى قوة تولدها العضلات. احسب القوة المحددة غير المنصهرة كقوة غير منصهرة مقسومة على عضلة CSA.
  ملاحظة: القوة غير المدمجة هي القوة النشطة القصوى المتولدة أثناء قطار النبض بتردد أقل من تردد الكزاز.
2. احسب القوة الكزازية (mN) وقوة الكزاز المحددة (mN/mm2)؛ القوة القصوى هي القوة النشطة القصوى المتولدة أثناء قطار النبض الذي يتم تسليمه بتردد الكزاز. قم بحسابه عن طريق طرح قيمة التحميل المسبق الأولية إلى أقصى قوة تولدها العضلات. احسب قوة الكزاز المحددة كقوة الكزاز مقسومة على CSA العضلي.
3. حساب منحنى قوة التردد. ارسم قيمة القوة (أو القوة المحددة) التي تم الحصول عليها لكل تحفيز مقابل زيادة وتيرة التحفيز. عادة ، يبدأ بتحفيز النبضة المفردة وينتهي بتردد الكزاز.
من نماذج التعب
1. احسب فشل النقل العصبي (NF) على النحو التالي:
  
  حيث MF هو انخفاض القوة بعد تحفيز العضلات و F هو انخفاض القوة بعد تحفيز الأعصاب ، ويتم قياسه في قطار النبض الأول بعد تحفيز العضلات.
2. احسب التعب intratetanic (IF) على النحو التالي:
  
  حيث F_lp هي القوة الناتجة عن العضلات عند آخر نبضة للتحفيز ، و F_m هي القوة القصوى التي تولدها العضلة أثناء نفس قطار النبض. فيما يتعلق بتحفيز الأعصاب ، احسب التعب العصبي في قطار النبض الأول مباشرة بعد التحفيز المباشر.

< p class = "jove_title" >4. التحليل الإحصائي

ملاحظة: يجب اختيار نماذج التحليل الإحصائي وفقا لما إذا كانت استجابة العضلات لكل من التحفيز العصبي والأغشائي تتم مقارنتها داخل نفس النموذج الحيواني أو بين نموذجين مختلفين من< فئة الدعم = "xref" >18^،< sup class = "xref">19.

استخدم اختبار Student's t ل TTP و 1/2RT و dF / dt و -dF / dt إذا قارنت استجابات العضلات فقط بالمحفزات المباشرة وغير المباشرة. في حالة مقارنة مستحضرات العضلات التي تم الحصول عليها من سلالة مختلفة من الفأر ، استخدم ANOVA ثنائي الاتجاه مع نوع التحفيز وإجهاد الفأر كعوامل ثابتة. عندما يعرض ANOVA ثنائي الاتجاه نتيجة مهمة ، استخدم اختبارات مقارنة متعددة للبحث عن الاختلافات الإحصائية.
بالنسبة لمنحنى تردد القوة (في حالة مقارنة استجابات العضلات فقط بالمحفزات المباشرة وغير المباشرة) ، استخدم ANOVA ثنائي الاتجاه مع نوع التحفيز وتواتر التحفيز كعوامل ثابتة. استخدم اختبارات مقارنة متعددة إذا لزم الأمر.
1. في حالة مقارنة مستحضرات العضلات التي تم الحصول عليها من 2 سلالات مختلفة من الفئران ، استخدم ANOVA ثلاثي الاتجاهات مع نوع التحفيز وتكرار التحفيز وإجهاد الفأر كعوامل ثابتة.
  1. عندما ينتج عن ANOVA ثلاثي الاتجاهات تأثيرا كبيرا لعوامل سلالة ونوع التحفيز ، استخدم ANOVA ثنائي الاتجاه لتحديد الاختلافات الدلالية بين مجموعتين في وقت واحد. على سبيل المثال ، يمكن تقييم الاختلافات بين استجابة العضلات للمجموعتين لتحفيز الغشاء ، أو بين استجابة العضلات للتحفيز المباشر وغير المباشر داخل مجموعة واحدة.
التعب الداخلي
ملاحظة: نظرا لأن البروتوكول مصمم للحث على التعب استجابة لتحفيز الأعصاب حتى في الفئران الضابطة ، فلا يمكن استخدام هذه المعلمة إلا للتحقيق في الاختلافات بين سلالات الفئران 2 ، والتحليل الإحصائي داخل مجموعة واحدة سيؤدي دائما إلى اختلافات كبيرة.
1. لمقارنة مجموعتين ، استخدم ANOVA ثلاثي الاتجاهات مع نوع التحفيز والوقت وإجهاد الفأر كعوامل ثابتة. عندما ينتج عن ANOVA ثلاثي الاتجاهات تأثيرا كبيرا لعوامل سلالة ونوع التحفيز ، استخدم ANOVA ثنائي الاتجاه لتحديد الاختلافات الدلالية بين مجموعتين في وقت واحد ، كما هو الحال بالنسبة لمنحنى تردد القوة.
لفشل النقل العصبي ، استخدم ANOVA ثنائي الاتجاه مع سلالة والوقت كعوامل ثابتة. إذا كان يعرض نتائج مهمة ، فاستخدم اختبارات مقارنة متعددة للبحث عن الاختلافات الإحصائية.
ملاحظة: نظرا لأن هذه المعلمة ترجع قيمة واحدة فقط لكل سلالة الماوس، فإنها تسمح بمقارنة نماذج الماوس المختلفة.
بالنسبة لوزن العضلات وطولها و CSA ، استخدم اختبار Student's t للتحقيق في الاختلافات عند مقارنة مستحضرات العضلات والأعصاب من نماذج حيوانية مختلفة.

Representative Results

ينص البروتوكول على وصفت لنا معلومات على إزالة التعصيب الوظيفية في العديد من الأمراض العصبية العضلية أو الشيخوخة-ساركوبينيا. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد ما إذا كان (وإذا كان الأمر كذلك، على أي مستوى) التعديلات العضلات سبب انتقائية من التغيرات التي تحدث في العضلات نفسها أو في الإرسال العصبية العضلية. البيانات المبينة أدناه هي نتائج أعمال سابقة لدينا مجموعة18، أجريت على نموذج الفأر وراثيا SOD1G93A التصلب العضلي الجانبي في المرحلة النهائية من المرض20. الماوس المعدلة وراثيا SOD1G93A أوفيريكسبريسيس أوبيكويتوسلي الفاءق دسموتاز إنزيم متحولة المضادة للأكسدة 1 (SOD1). يبين الشكلان 3 و 4 مدافع/dt وقيم القوة تيتانيك للعصب الوركي سولاس (يسار) والأعمال التحضيرية عصب الحجاب الحاجز فرنك (يمين). وتبين هذه النتائج قدرة تقنية المقترحة هنا للكشف عن العيوب الفنية في عضلات المعدلة وراثيا التي ترتبط NMJ بدلاً من تلك التي تتصل بالعضلات نفسها. في الواقع، عرض العضلات سولاس SOD1G93A مدافع/dt وقوة تيتانيك، استجابة الهوس مخفضة، بالمقارنة مع التحكم والعضلات، وعندما تحفز مباشرة، وعرض تخفيضاً إضافيا عندما تحفز عن طريق العصب. على النقيض من ذلك، تعديلات خفيفة لوحظت في هذين المعيارين عند حفز شرائط عضلة الحجاب الحاجز من خلال الغشاء، بينما تم الكشف عن تعديلات كبيرة عندما تم تحفيز عضلة الحجاب الحاجز عن طريق العصب.

الشكل 3 - حركية الهوس. يعني ± ووزارة شؤون المرأة لمدافع/dt سولاس (A) والحجاب الحاجز (ب) الأعمال التحضيرية. عينات سولاس عرض تباطؤ كبير لأسفل عند مباشرة وحفز (-27%)، ومزيد من انخفاض عندما تحفز عن طريق العصب (-58 ٪). عرض عينات من الغشاء تباطؤ فقط عند تنشيط عن طريق العصب (-30%). مقتبس من ريزوتو et al. 18. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4 - قوة تيتانيك. يعني ± ووزارة شؤون المرأة قوة محددة تيتانيك التحضيرات سولاس (A) والحجاب الحاجز (ب). عينات سوليوس عرض تباطؤ كبير لأسفل عند مباشرة وحفز (-26%)، ومزيد من انخفاض عندما تحفز عن طريق العصب (-50%). عرض عينات من الغشاء انخفاض قوة إلا عندما تحفز عن طريق العصب (-44 ٪). مقتبس من ريزوتو et al. 18. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

التقييم إينتراتيتانيك التعب والفشل كبيرة سمحت NMJ معلمات محددة يمكن قياسها. يبين الشكل 5 متوسط القيم من التعب إينتراتيتانيك (إذا كان) يقاس من خلال نموذج التعب تيتانيك عضلات سولاس (الشكل 5A) وشرائط الحجاب الحاجز (الشكل 5 (ب)). كما ورد في المقطع بروتوكول، وضعت نموذج التعب طبقنا بطريقة التشديد على NMJ على الرغم من ليس في العضلات. كنتيجة لذلك، إذا كان قياس لتحفيز العضلات مباشرة تم تبديله ابدأ. في الواقع، إذا حسبت لتحفيز الأعصاب هي المعلمة التي يجب مراعاتها لإجراء مقارنات بين سلالات مختلفة من الماوس. وتظهر النتائج التي توصلنا إليها إذا كان أقل بكثير في سوليوس المعدلة وراثيا وعضلات الحجاب الحاجز من نظرائهم السيطرة. وكان هذا الفرق أكبر في الحجاب الحاجز، الذي تم الكشف عن وجود عيب في العضلات صغيرة، وأصغر في سوليوس، الذي كان يقاس تلف العضلات كبيرة فعلا. ينبغي أن يغيب عن البال أن منذ العضلات سوليوس المعدلة وراثيا تضررت إلى حد كبير، تقييم NMJ فقط الصحيح ليصل إلى 8 دقيقة من التحفيز، وهو الوقت الذي يستغرقه للعضلات وراثيا لإرجاع قيمة خالية من القوة عند حفز. سوليوس المعدلة وراثيا إذا كانت القيم بعد 8 دقيقة لتحفيز التعبير أساسا عن الضوضاء.

الشكل 5 - التعب إينتراتيتانيك. عرض إينتراتيتانيك التعب سولاس (A) والحجاب الحاجز (ب) العضلات انخفاض كبير في الأداء الوظيفي NMJ المعدلة وراثيا. تكون القيم يعني ± sem. مواءمة من ريزوتو et al. 18. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

ويبين الشكل 6 فشل كبيرة في تواتر تيتانيك تقاس في سولاس (الشكل 6A) والحجاب الحاجز (الشكل 6B) العينات. تمشيا مع النتائج، وإذا تم اكتشاف لا عيب في كبيرة في العضلات سولاس، بينما عرض العينات عضلة الحجاب الحاجز زيادة كبيرة في الوصلات العصبية العضلية تعب.

الرقم 6 -فشل كبيرة. فشل كبيرة لم يتم عرض أي تغييرات في عضلات سولاس (A)، في حين سلط الضوء على انخفاض كبير في الأداء الوظيفي NMJ في محوره وراثيا الحجاب الحاجز، شرائط (ب). تكون القيم يعني ± sem. مواءمة من ريزوتو et al. 18. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Disclosures

Acknowledgements

العمل في مختبر صاحبي تدعمها مؤسسة الغجر والحفل الخيري (منحة لا. GGP14066).

Materials

عالية الطاقة ثنائية الطور محفز النبض محفز النبض

نظام ذراع الوضع المزدوج	شركة أورورا العلمية	300B	المحرك / محول الطاقة
محفز ؛	شركة أورورا العلمية	701B	(العصب) محفز
ثنائي الطور عالي الطاقة ؛	شركة أورورا العلمية	701C	(العضلات)
جهاز العضلات في المختبر ;	شركة أورورا العلمية	800A
حمام المناديل التحضيرية	Radnoti	158400
أحادي القطب شفط الكهربائي	أنظمة AM	573000	مع مرجع محلي الصنع
راسم الذبذبات	Tektronix	TDS2014
مجهر مجهر مجسم	نيكون	SMZ 800
إضاءة باردة	البصريات الضوئية	PL 3000
لوحة الاستحواذ	الوطنية الأدوات	NI PCIe-6353
كتلة موصل	الأدوات الوطنية	NI 2110
الكمبيوتر الشخصي	AMD Phenom II x4 970		المعالج 3.50 جيجا هرتز مع ويندوز 7
برنامج LabView 2012	National Instruments
Krebs-Ringer بيكربونات Buffer	سيجما ألدريتش	K4002	عازلة فسيولوجية
بيكربونات الصوديوم	Sigma-Aldrich	S5761 ؛
كلوريد الكالسيوم CaCl _{2< / sub>}	Sigma-Aldrich	C4901	اللامائي ، مسحوق ، & ge ؛ 97٪
عازلة HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	&ge ؛ 99.5٪ (معايرة بالتحليل الحجمي)
أطباق 60 مم × 15 مم	فالكون	353004	البوليسترين
سيليكون	سيلجارد & nbsp ؛	184 سيليكون	طقم المطاط الصناعي 0.5 كجم.
ترموستات	Dennerle	DigitalDuomat 1200
Pump	Newa Mini	MN 606	لحوض السمك
المقاومة للحرارة	الزواحف المحظوظة	61403-1	50 / 60 هرتز 50 واط
دلو	أي 10 لترات		من مادة البولي بروبيلين
O_{2< / sub> + 5٪ CO2}	Siad		Mix
Gas # 5 Plumps ؛	أدوات العلوم	الدقيقة 11252-20	2 قطعة
مقص زنبركي - شفرات 8 مم	أدوات العلوم الدقيقة	15024-10	استئصال الأعصاب
مقص حاد ؛	أدوات العلوم الدقيقة	14059-11	إزالة العضلات
مقص دقيق	فاغنر	02.06.32	خارجي من
مقبض مشرط الطالب # 3	أدوات العلوم الجميلة ؛	91003-12
شفرات مشرط #10	أدوات العلوم الدقيقة	10010-00
شفرات مشرط #11	أدوات العلوم الدقيقة	10011-00
سلك نايلون & Oslash ؛ 0.16 ملم	أي

References

Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. The "dying-back" phenomenon of motor neurons in ALS. J Mol Neurosci. 43 (3), 470-477 (2011).
Dobrowolny, G., et al. Skeletal Muscle Is a Primary Target of SOD1G93A-Mediated Toxicity. Cell Metab. 8 (5), 425-436 (2008).
Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Neurotrophins improve neuromuscular transmission in the adult rat diaphragm. Muscle Nerve. 29 (3), 381-386 (2004).
Prakash, Y. S., Miyata, H., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Inactivity-induced remodeling of neuromuscular junctions in rat diaphragmatic muscle. Muscle Nerve. 22 (3), 307-319 (1999).
Sieck, D. C., Zhan, W. Z., Fang, Y. H., Ermilov, L. G., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Structure-activity relationships in rodent diaphragm muscle fibers vs. neuromuscular junctions. Respir Physiol Neurobiol. 180 (1), 88-96 (2012).
Van Lunteren, E., Moyer, M. Effects of DAP on diaphragm force and fatigue, including fatigue due to neurotransmission failure. J Appl Physiol. 81 (5), 2214-2220 (1996).
Van Lunteren, E., Moyer, M., Kaminski, H. J. Adverse effects of myasthenia gravis on rat phrenic diaphragm contractile performance. J Appl Physiol. 97 (3), 895-901 (2004).
Lee, Y., Mikesh, M., Smith, I., Rimer, M., Thompson, W. Muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy show profound defects in neuromuscular development even in the absence of failure in neuromuscular transmission or loss of motor neurons. Dev Biol. 356 (2), 432-444 (2011).
Personius, K. E., Sawyer, R. P. Variability and failure of neurotransmission in the diaphragm of mdx mice. Neuromuscular Disord. 16 (3), 168-177 (2006).
Röder, I. V., Petersen, Y., Choi, K. R., Witzemann, V., Hammer, J. A., Rudolf, R. Role of myosin Va in the plasticity of the vertebrate neuromuscular junction in vivo. PLoS ONE. 3 (12), e3871 (2008).
Chevessier, F., et al. A mouse model for congenital myasthenic syndrome due to MuSK mutations reveals defects in structure and function of neuromuscular junctions. Hum Mol Genet. 17 (22), 3577-3595 (2008).
Farchi, N., Soreq, H., Hochner, B. Chronic acetylcholinesterase overexpression induces multilevelled aberrations in mouse neuromuscular physiology. J Physiol. 546 (1), 165-173 (2002).
Kuei, J. H., Shadmehr, R., Sieck, G. C. Relative contribution of neurotransmission failure to diaphragm fatigue. J Appl Physiol (Bethesda, Md: 1985). 68 (1), 174-180 (1990).
Del Prete, Z., Musarò, A., Rizzuto, E. Measuring mechanical properties, including isotonic fatigue, of fast and slow MLC/mIgf-1 transgenic skeletal muscle. Ann Biomed Eng. 36 (7), 1281-1290 (2008).
Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old. J Physiol. 535 (2), 591-600 (2001).
Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice. J Physiol. 404, 71-82 (1988).
Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Faulkner, J. A. Force and power output of diaphragm muscle strips from mdx and control mice after clenbuterol treatment. Neuromuscul Disord. 11 (2), 192-196 (2001).
Rizzuto, E., Pisu, S., Musar, A., Del Prete, Z. Measuring Neuromuscular Junction Functionality in the SOD1 G93A Animal Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Ann Biomed Eng . 43, (2015).
Soliani, L. . Manuale di statistica per la ricerca e la professione statistica univariata e bivariata parametrica e non-parametrica per le discipline ambientali e biologiche. , (2004).
Gurney, M. E., Pu, H., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science (New York, N.Y). 264 (5166), 1772-1775 (1994).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request Permission

Play Video

قياس الأداء الوظيفي الوصلات العصبية العضلية