مقالة منهجية

إعادة برمجة خلايا المشروطة للأطفال الإنسان المريء طلائي للاستخدام في هندسة الأنسجة وأمراض التحقيق

DOI:

10.3791/55243

⸱

مارس 22, 2017

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, UConn Health, 2Department of Gastroenterology, Connecticut Children's Medical Center, 3Department of Surgery, Connecticut Children's Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التوسع في خلايا المريء للأطفال الإنسان الظهارية باستخدام برمجة مشروطة يوفر المحققين ويبلغ عدد سكانها المريض محددة من الخلايا التي يمكن استخدامها لهندسة البنى المريء لزرع ذاتي لعلاج العيوب أو الإصابات وتكون بمثابة خزان لفحوصات الكشف العلاجية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن يكون تحديد الخلايا الخاصة بالمريض وتوسيعها في الثقافة لاستخدامها في هندسة الأنسجة والتحقيق في الأمراض أمرا صعبا للغاية. غالبا ما يكون استخدام أنواع مختلفة من الخلايا الجذعية لاشتقاق أنواع الخلايا ذات الأهمية مكلفا ويستغرق وقتا طويلا وغير فعال للغاية. علاوة على ذلك ، يجب إزالة أنواع الخلايا غير المرغوب فيها قبل استخدام مصدر الخلية هذا ، الأمر الذي يتطلب خطوة أخرى في العملية. من أجل الحصول على ما يكفي من الخلايا الظهارية للمريء لهندسة تجويف بنية المريء أو لفحص الأساليب العلاجية لعلاج مرض المريء ، يجب توسيع الخلايا الظهارية للمريء الأصلية دون تغيير تعبيرها الجيني أو النمط الظاهري. توفر إعادة البرمجة المشروطة للأنسجة الظهارية للمريء نهجا واعدا لتوسيع الخلايا الظهارية للمريء الخاصة بالمريض. علاوة على ذلك ، لا تحتاج هذه الخلايا إلى الفرز أو التنقية وستعود إلى الحالة الظهارية الناضجة بعد إزالتها من ثقافة إعادة البرمجة المشروطة. تم وصف هذه التقنية في العديد من دراسات فحص السرطان وتسمح بالتوسع غير المحدود لهذه الخلايا عبر ممرات متعددة. ستساعد القدرة على إجراء فحوصات فحص المريء في إحداث ثورة في علاج أمراض المريء لدى الأطفال مثل التهاب المريء اليوزيني من خلال تحديد آلية الزناد التي تسبب أعراض المريض. بالنسبة لأولئك المرضى الذين يعانون من عيب خلقي أو مرض أو إصابة في المريء ، يمكن استخدام مصدر الخلية هذا كوسيلة لزرع بنية اصطناعية لزرعها لإصلاح أو استبدال المنطقة المصابة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد هندسة الأنسجة المريء والمريء يوزيني (EOE) والتركيز على البحوث في العديد من المختبرات على مدى العقد الماضي. العيوب الخلقية، مثل رتق المريء، وينظر في ما يقرب من 1 في 4000 ولادة حية، مما يؤدي إلى تطوير ناقصة من المريء مما يؤدي إلى عدم القدرة على تناول الطعام 1. وكانت الإصابة وانتشار EOE في الارتفاع منذ التعرف على كيان المرض في عام 1993. وقوع EOE تختلف 0،7 حتي 10 / 100،000 فرد في السنة وتراوح انتشار ،2-43 / 100000 2. نهج الجراحية جذابة جديدة لعلاج الفجوة الطويلة رتق المريء يتمثل في توليد بنيات الأنسجة لزرع باستخدام خلايا المريض نفسه. وهذه الخلايا بالتزامن مع السقالات الاصطناعية توليد وبناء ذاتي التي لا تتطلب قمع المناعي. وقد بدأت بعض الجماعات بالفعل للتحقيق في الولايات المتحدة(ه) من خلايا شبيهة بخلايا المنشأ لهندسة الأنسجة المريء 3 فضلا عن استخدام الخلايا الظهارية المريء الأم إلى إعادة في الغشاء المخاطي 4-7. الأمراض التي تكون موجودة في المريء من الأطفال المرضى من الصعب تشخيص أو دراسة دون تدخل في كثير من الأحيان. وعلاوة على ذلك، النماذج الحيوانية الاستفادة أو في المختبر تخليد نماذج خط الخلية لأمراض الأطفال مثل EOE لا تشمل المرض والتسبب في الدقيق أو الاختلافات المحددة للمرضى 8. ولذلك، فإن القدرة على دراسة عملية مرض المريض في المختبر من أجل تحديد المرض مما اثار مستضدات معينة، وتقييم الآليات الكامنة وتحقيق العلاجات الدوائية ستكون رواية وتوفير الأطباء مع المعلومات التي يمكن أن تساعد في علاج المريض.

كانت هناك العديد من أنواع الخلايا ذاتي أو المريض محددة التي تم اقتراحها لاستخدامها في TISSUالهندسة الإلكترونية ودراسة المرضية الأمراض التي تصيب البشر. ومع ذلك، تقتصر بعض هذه أنواع الخلايا في قدرتها على توليد ما يكفي من الخلايا من النمط الظاهري محدد البذور سقالة كبيرة أو أداء إنتاجية عالية في الدراسات المختبرية. وقد تم استخدام الخلايا الجذعية المحفزة أو متعددة القدرات موضوع الكثير من النقاش الأبحاث، ولكن، والقيود وأوجه القصور لاستخدام هذه الخلايا قد وصفت بشكل جيد 9. استخدام الخلايا الجذعية الجنينية البشرية وناقش غاية وتقدم العديد من القضايا الأخلاقية. الأهم من ذلك، هذه الخلايا تشكل مسخي المبيض، والتي تتشابه إلى الورم، إذا لم تكن متباينة من دولة المحفزة فيها قبل تسليمها إلى الحية المضيفة 10. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام الخلايا الجذعية الجنينية لا يكون المريض محددة، ويمكن أن يثير رد فعل الصنعية والحاجة إلى قمع المناعة 10. الناجم عن الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) هي الخلايا المحفزة التي يمكن أنأن تستمد من خلايا المريض نفسه. الخلايا الجسدية، مثل خلايا الجلد، ويمكن أن يتسبب في حالة المحفزة باستخدام مجموعة متنوعة من تقنيات متكاملة وغير متكاملة. هذه الخلايا بعد ذلك بمثابة مصادر خلية المريض محددة لهندسة الأنسجة أو التحقيق المرض. دمج المادة الوراثية غير المرغوب فيها في هذه الخلايا هو مصدر قلق كثير وقد وصفت وحتى لو المتتاليات هي تماما iPSCs إزالتها تظهر للحفاظ على "الذاكرة" جينية نحو نوع من الخلايا التي كانت مستمدة 11. هذه الخلايا أيضا ستشكل مسخي المبيض في الجسم الحي إن لم يكن يفرق قبل الزرع (11). وقد تم التحقيق في العديد من البروتوكولات التمايز التركيز على الأنساب الظهارية 12، 13، 14، ومع ذلك، فمن المهم جدا أن نلاحظ أن أنواع الخلايا مما يؤدي في نهاية التمايز ليست متجانسة و Oنلي امتلاك جزء من نوع من الخلايا في المصالح. وهذا يؤدي إلى انخفاض المحصول والحاجة إلى تنقية نوع من الخلايا المطلوبة. على الرغم من أن iPSCs هي مصدر الخلايا المحتمل المريض محددة، وعملية للحصول على نوع من الخلايا في المصالح إما هندسة الأنسجة أو التحقيق المرض غير فعال جدا.

وتم عزل الخلايا الظهارية البشرية بنجاح من مجموعة متنوعة من كل من الأنسجة المريضة وغير المريضة في الجسم البشري بما في ذلك: سرطان الرئة 15، وسرطان الثدي 16، الأمعاء الدقيقة 17 والقولون 18، المثانة 19 والمريء 20. من المهم أن نلاحظ أن الخلايا الأولية البشرية لديها عدد محدود من المقاطع التي يتم الحفاظ على النمط الظاهري 21، 22. للأسف، وهذا يعني أن عدد الخلايا اللازمة لتحقيق مرض أو لبذر سقالة هندسيالزرع قد لا يتحقق. لذلك، هناك حاجة إلى تقنيات جديدة لتوسيع خلايا المريض في حين لا يزال الحفاظ على النمط الظاهري الظهارية. وقد وصفت إعادة برمجة مشروطة من الخلايا الظهارية الطبيعية والسرطانية باستخدام الخلايا المغذية ومثبط ROCK في 2012 من قبل ليو وآخرون. 2 3. وقد استخدمت هذه التقنية لتوسيع الخلايا الظهارية السرطانية التي تم الحصول عليها من خزعات من البروستات وسرطان الثدي باستخدام الخلايا المغذية المشع، ROCK المانع والمتوسطة برمجة المشروط. وكان الهدف هو توليد ما يكفي من الخلايا لفحوصات في المختبر مثل فحص المخدرات. هذه التقنية قادرة على توسيع الخلايا الظهارية إلى أجل غير مسمى ب "إعادة برمجة" هذه الخلايا الجذعية أو حالة تشبه السلف، وهو التكاثري للغاية. وقد ثبت أن هذه الخلايا غير قابلة للمكون للأورام ولا تمتلك القدرة على تشكيل مسخي المبيض 23 و 24. وعلاوة على ذلك، لاكانت شذوذ الكروموسومات أو التلاعب الجيني الحالية بعد الركض هذه الخلايا في الثقافة باستخدام هذه التقنية 23، 24. الأهم من ذلك، هذه الخلايا قادرة على التمايز إلى نوع من الخلايا الأصلية من الفائدة فقط. لذلك، هذه التقنية توفر مخزون كبير من خلايا المريض محددة الظهارية للتحقيق مرض أو هندسة الأنسجة دون الحاجة لتخليد.

الحصول على الأنسجة الظهارية من جهاز معين لدراسة عمليات المرض غالبا ما يكون محدودا وليس من الممكن دائما بسبب خطر المريض. بالنسبة لأولئك المرضى الذين يعانون من أمراض المريء أو عيوب، بالمنظار استرجاع الخزعة هو نهج مينيملي للحصول على الأنسجة الظهارية التي يمكن فصلها وإعادة برمجتها مشروط لتوفير مصدر الخلية إلى أجل غير مسمى غير محددة في الغشاء المخاطي في المريء أن المريض. هذا ثم يسمح لفي الدراسات المختبريةمن الخلايا الظهارية لتقييم العمليات المرض والبحث عن العلاجات المحتملة. عملية مرض واحد التي يمكن أن تستفيد كثيرا من هذا النهج هو الإيزونوفيلي التهاب المريء، والتي وصفت بأنها أمراض الحساسية من المريء 8. اختبارات الحساسية وكذلك طرق علاجية يمكن تقييمها في المختبر باستخدام خلايا الظهارية الخاصة للمريض ويمكن بعد ذلك أن يتم تمرير هذه البيانات على الطبيب المعالج لوضع خطط العلاج الفردي. تقنية إعادة البرمجة الشرطية بالتعاون مع الحصول على الخزعات بالمنظار من الأطفال المرضى وتقدم القدرة على توسيع الخلايا الظهارية المريء العادية إلى أجل غير مسمى من أي مريض. ولذلك يمكن تعاونت هذا المصدر خلية جنبا إلى جنب مع السقالات الطبيعية أو الاصطناعية لتوفير خيار المريض محددة الجراحي للعيوب أو المرض أو الصدمة. أن وجود عدد الخلايا إلى أجل غير مسمى مساعدة مهندس يبني المريء التي تمتلك reseeded تماماالتجويف مع الخلايا الظهارية المريء من أجل المساعدة في تسهيل تجديد أنواع الخلايا المتبقية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم الحصول على عينات للفحص المريء بعد الحصول على الموافقة المسبقة من الآباء / أولياء الأمور من الأطفال المرضى وفقا للمجلس المراجعة المؤسسية (IRB # 13-094).

1. أدوات تعقيم والجيلاتين الحل

  1. ملقط الأوتوكلاف، شفرات الحلاقة ومقص قبل التعامل مع الأنسجة لمنع التلوث.
  2. لجعل 200 مل من 0.1٪ محلول الجيلاتين، والجمع بين 200 مل من الماء المقطر مع 0.2 غرام من الجيلاتين. الأوتوكلاف وبارد قبل استخدامها.

2. طلاء لوحات زراعة الأنسجة

  1. حوالي 2 ساعة قبل عزل الخلايا، إضافة ما يكفي من الجيلاتين 0.1٪ لتغطية صحن زراعة الأنسجة (100 ملم)، واحتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة الثقافة الخلية.
    ملاحظة: يمكن أيضا أن تكون هذه اللوحات في وقت سابق ويوضع في حاضنة قبل الاستخدام.

3. صنع انزيم الحل لالتفكك

  1. ما يقرب من 30 دقيقة قبل عزل الخلايا، تزن خارج10 وحدات من dispase على التوازن على أساس وحدة في تركيز مليغرام في القارورة. وضع المسحوق في أنبوب مخروطي 15 مل مع 10 مل من Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) ووضعه في 37 ° C حمام الماء.

4. صنع خلية متوسطة الثقافة

  1. لجعل 50 مل من المتوسط ​​برمجة المشروط، مزج المكونات التالية في أنبوب العقيمة المخروطية: 35 مل من F12 (هام والمتوسطة)، 11.5 مل من DMEM، و 0.5 مل من L-الجلوتامين، 0.5 مل من 100X البنسلين / الستربتومايسين، 2.5 مل من مصل بقري جنيني (FBS)، 250 ميكروغرام من الأنسولين البشري، 500 نانوغرام من عامل نمو البشرة البشري (EGF).
  2. لجعل 500 مل من 3T3 المتوسطة، خلط 50 مل من FBS و 5 مل من 100X البنسلين / الستربتومايسين و 5 مل من L-الجلوتامين مع 500 مل من DMEM.
  3. لجعل 500 مل من الخلايا الكيراتينية المصل خالية المتوسطة، ذوبان الجليد EGF والأبقار النخامية استخراج (BPE) المكملات الغذائية (المتوفرة مع وسائل الإعلام). إضافة ملاحق مل زجاجة 500 متوسطة أساسية وإضافة 5 مل من 100X البنسلين / الستربتومايسين

5. التثقيف واضاءة 3T3 الخلايا كمصدر تغذية

  1. إعداد 3T3 المتوسطة، التي تضم DMEM، و 10٪ FBS، 1X البنسلين / الستربتومايسين و2 مم L-الجلوتامين.
  2. ثقافة 3T3 الخلايا في الأنسجة المعالجة T-75 قوارير قبل 3 أيام على الأقل من وصول عينات المرضى.
    1. قبيل وصول عينات المرضى، ويعرض للتريبسين 3T3 الخلايا باستخدام 5 مل من 0.25٪ التربسين-EDTA في القارورة واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق أو حتى معظم الخلايا تطفو
  3. إضافة 5 مل من 3T3 المتوسطة لوقف التفاعل. نضح تعليق الخلية ونقل إلى أنبوب مخروطي 15 مل. تدور لمدة 5 دقائق في 300 × ز.
  4. نضح المتوسطة و resuspend الخلايا في حجم محدد من التريبان الأزرق لعد الخلايا. الجمع بين 10 ميكرولتر من الخلايا مع 10 ميكرولتر من التريبان الأزرق لاستبعاد الخلايا الميتة. تحميل 10 ميكرولتر من هذا الحل على عدادة الكريات لحساب الخلية.
    ملاحظة: للحصول على هذا بروتوالعقيد، كثافة البذر ل3T3 الخلايا المشع هو 10،900 الخلايا لكل سم 2، أي ما يعادل 600000 خلايا لكل لوحة 100 ملم.
  5. قسامة عدد الخلايا اللازمة لوحة لوحة 100 ملم في عينة المريض وresuspend في 25 مل من 3T3 المتوسط ​​في أنبوب مخروطي 50 مل وأشرق مع 3000 راد.
  6. بعد التشعيع، وخلايا تدور باستمرار لمدة 5 دقائق في 300 x ج و resuspend في المتوسط ​​برمجة مشروط في 5 مل لكل لوحة 100 ملم.
  7. تعيين أنبوب جانبا حتى يأخذ الطلاء من خلايا المريض في وقت لاحق في البروتوكول (راجع الخطوة 7.6).

6. الحصول على وحفظ ونقل الأطفال المريء الخزعات

  1. إضافة 5 مل من المصل خالية المتوسطة القرنية كاملة مع 100 ميكروغرام / مل primocin لأنابيب مخروطية 15 مل وإحضاره إلى منشأة طبية على الجليد.
    ملاحظة: هذه الأنابيب المتوسطة يمكن تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أشهر.
  2. الحصول على ما يقرب من 8 الخزعات المريء في منظمة الشفافية الدوليةلي من التنظير ومستقل على النحو التالي:
    1. وضع ستة الخزعات في مل المخروطية 15 تحتوي على كامل القرنية المتوسطة مجانا المصل مع 100 ميكروغرام / مل primocin ومكان على الجليد الرطب.
    2. وضع خزعة واحدة في 5 مل من الفورمالين مخزنة ومكان على الجليد الرطب.
    3. وضع خزعة واحدة في خزعة صغيرة cryomold مع الأمثل مجمع درجة حرارة القطع.
      1. على الفور إسقاط هذا القالب في كوب من نظير البنتان وضعها في النيتروجين السائل. مرة واحدة المجمدة، ضع cryomold في كيس العينة وتخزينها على الثلج الجاف في وعاء رغوة البوليسترين.
  3. وضع أنابيب تحتوي على الخزعات في المتوسطة أو الفورمالين داخل كيس قابل للغلق وبعد ذلك في علبة الشحن التي تحتوي على الجليد الرطب. ختم وتسمية مربع مع التسمية واقية ونقلها إلى المختبر.
    ملاحظة: الحاوية التي تحتوي على الثلج الجاف والخزعة المجمدة مختومة أيضا وصفت مع تسمية اقية.

7. معالجةالأنسجة للمريض للثقافة وتحليل المصب

  1. لدى وصوله الى المختبر، ونقل خزعة المجمدة على الثلج الجاف إلى -80 درجة مئوية الفريزر لباجتزاء المصب أو استخراج الحمض النووي الريبي. وضع العينة في الفورمالين. تخزين في 4 درجات مئوية الثلاجة والسماح لإصلاح بين عشية وضحاها.
  2. تدور الخزعات المتبقية إلى أسفل في 300 x ج، ونضح المتوسطة. إضافة 10 مل من dispase حل للأنبوب مخروطي الشكل، وختم والسماح لها لاحتضان عند 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 15 دقيقة.
  3. بعد الحضانة، وتدور الخزعات إلى أسفل في 300 × ز. نضح الخزعات المتوسطة و resuspend في 5 مل من 0.05٪ التربسين-EDTA.
  4. نقل 5 مل من التربسين-EDTA تحتوي على خزعات لوحة معقمة 100 ملم واللحم المفروم الخزعات باستخدام 2 شفرات الحلاقة معقمة كما غرامة ممكن.
  5. نقل 5 مل من التربسين-EDTA تحتوي على الخزعات المفروم إلى جديد 15 مل المخروطية. شطف لوحة مرتين مع 5 مل إضافية من 0.05٪ التربسين-EDTA وإضافة إلى المخروطيةالة النفخ. احتضان الأنبوب لمدة 10 دقيقة في 37 ° C حمام الماء.
  6. بعد الحضانة، وتدور الخزعات إلى أسفل في 300 x ج (1.4 دورة في الدقيقة) لمدة 5 دقائق، ونضح المتوسط. إضافة 5 مل من المتوسط ​​برمجة مشروط لأنبوب مخروطي الشكل وكذلك 5 مل من المتوسط ​​برمجة المشروط الذي يحتوي على الخلايا المغذية المشع (راجع الخطوة 5.7).
  7. إضافة ROCK المانع (1 ميكرولتر / مل) إلى 10 مل من تعليق خلية ولوحة بعد الشفط الجيلاتين من صحن زراعة الأنسجة. احتضان عند 37 درجة مئوية.

8. التثقيف وخلايا التوسع

  1. بعد حوالي 5 أيام من الثقافة، نضح في والمتوسطة الأولي التي تحتوي على قطع مفروم-الخزعة وشطف طبق 2-3 مرات مع 5 مل برنامج تلفزيوني العقيمة. إضافة سيلة جديدة لوحة بما في ذلك المانع ROCK في 10 ميكرومتر.
  2. عند الوصول إلى 70٪ confluency، توسيع الخلايا. إضافة 5 مل من 0.05٪ التربسين-EDTA لوحة واحتضان في حاضنة 37 درجة مئوية أي أكثر من 2.5 دقيقة لإزالة الالخلايا المغذية ه. وبعد أن الحضانة، ونضح التربسين-EDTA وشطف لوحة مع 5 مل من برنامج تلفزيوني.
  3. نضح في برنامج تلفزيوني وإضافة 5 مل من 0.25٪ التربسين-EDTA لوحة واحتضان لمدة 5-10 دقائق أو حتى الخلايا هي فضفاضة من لوحة. إضافة كميات متساوية من متوسطة إلى لوحة لوقف التفاعل ونقل جميع السوائل إلى أنبوب 50 مل المخروطية وتدور باستمرار في 300 x ج لمدة 5 دقائق.
  4. Resuspend الخلايا في حجم محدد من المتوسطة برمجة المشروط ومزيج 10 ميكرولتر من تعليق مع 10 ميكرولتر من التريبان الأزرق. الاعتماد على عدادة الكريات لتحديد إجمالي عدد الخلايا.
  5. لتوسيع الخلايا، إضافة 1 مليون خلية المريء الإنسان إلى لوحة 150 ملم مع 1.2 مليون المشع 3T3 الخلايا في الحجم الكلي لل15 مل. إضافة ROCK المانع جديدة على 10μM وإضافة تعليق الخلية على طبق الجيلاتين المغلفة 150 ملم.

9. خلايا تجميد وتخزين الإنسان المريء طلائي

  1. لجعل تجميد المتوسطة، إضافة 10٪DMSO إلى متوسطة برمجة المشروط. بعد trypsinizing والعد، قسامة الخلايا لتجميد في أنبوب 50 مل المخروطية جديد وتدور باستمرار في 300 x ج لمدة 5 دقائق.
  2. نضح المتوسطة وإضافة تجميد المتوسطة في حجم 2 مل لكل cryovial. مرة واحدة تعليق خلية متجانسة، قسامة 10 6 خلايا في cyrovials المسمى مسبقا. مكان في وعاء التجميد في -80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة على الأقل قبل تحريك قارورة لتخزين الطويل الأجل النيتروجين السائل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتتلخص ملخص من الخطوات الرئيسية في عزل الخلايا الظهارية المريء من الخزعات المريض في الشكل 1. سوف مستعمرات الخلايا الظهارية تشكل في حوالي 4-5 أيام، وسوف تكون محاطة الخلايا الليفية التغذية (الشكل 2A). ومع توسع هذه المستعمرات أنها سوف تندمج مع غيرها من المستعمرات لتشكيل المستعمرات الكبيرة (الشكل 2B). مرة واحدة أصبحت الثقافات 70٪ متموجة، فإنها تحتاج إلى توسيعها (الشكل 2C). لضمان أن تتم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أهم الخطوات من أجل عزل وتوسيع الخلايا الظهارية المريء من الخزعات المريض هي: 1) عدم الربط على نحو كاف الأنسجة الخزعة مع الحد الأدنى من موت الخلايا. يضاف 2) ضمان المانع ROCK إلى مستنبت الخلية في كل تغيير المتوسط؛ 3) لا تستخدم أكثر من الخلايا المغذية من الموصى بها. 4) الحفاظ على ثقافة العقيم النظيفة؛ و5) خلايا مرور فقط قبل الوصول إلى نقطة التقاء.

نظرا للاختلافات ذات الصلة المريض في عينات الخزعة الحصول عليها من أجل إ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نتوجه بخالص الشكر إلى تمويل البحوث الاستراتيجية لمركز كونيتيكت الطبي للأطفال لدعم هذا العمل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
PrimocinInVivogenant-pm2
IsopentaneSigma Aldrich277258-1L
الجيلاتين من جلد الخنازيرSigma AldrichG1890-100G
DMEMThermofisher Scientific11965092
CryomoldTissueTek4565
Cryomatrix OCTThermofisher Scientific6769006
15 مل أنابيب مخروطية دينفيلScientificC1017-p
مصل كامل من الخلايا الكيراتينية الحرةالحرارة 10724011
البنسلين ستربتومايسينثيرموفيشر علمي15140122
الجلوتاماكسثيرموفيشر 35050061
الأنسولينسيجما ألدريتشI9278-5ml
عامل نمو البشرة البشرية (EGF)PeprotechAF-100-15
ROCK Inhibitor (Y-27632)فيشر Scientific125410
F-12 متوسط Thermofisher Scientific11765054
مصل الأبقار الجنينDenville ScientificFB5001
DispaseThermofisher Scientific17105041
0.05٪ Trypsin-EDTAThermofisher Scientific25300062
0.25٪ Trypsin-EDTAThermofisher Scientific25200072
100 مم أطباقدنفيل ScientificT1110-20
أطباق 150 ممDenville ScientificT1115
50 مل مخروطياتDenville Scientific  C1062-9 
أقراص ملحية مخزنة بالفوسفاتفيشر ScientificBP2944-100
5 مل ماصاتفيشر Scientific1367811D
10 مل ماصاتفيشر Scientific1367811E
25 مل ماصاتفيشر Scientific1367811
9 "ماصات باستورفيشر Scientific13-678-20D
المعاهد الوطنية للصحة 3T3ATCCCRL1658
متوسطة العلمي خلايا

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Clark, D. C. Esophageal atresia and tracheoesophageal fistula. Am Fam Physician. 59 (4), 910-920 (1999).
  2. Soon, I. S., Butzner, J. D., Kaplan, G. G., deBruyn, J. C. Incidence and prevalence of eosinophilic esophagitis in children. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 57 (1), 72-80 (2013).
  3. Sjöqvist, S., et al. Experimental orthotopic transplantation of a tissue-engineered oesophagus in rats. Nat Commun. 5, 3562(2014).
  4. Saxena, A. K. Esophagus tissue engineering: designing and crafting the components for the 'hybrid construct' approach. Eur J Pediatr Surg. 24 (3), 246-262 (2014).
  5. Saxena, A. K., Ainoedhofer, H., Höllwarth, M. E. Culture of ovine esophageal epithelial cells and in vitro esophagus tissue engineering. Tissue Eng Part C Methods. 16 (1), 109-114 (2010).
  6. Saxena, A. K., Kofler, K., Ainodhofer, H., Hollwarth, M. E. Esophagus tissue engineering: hybrid approach with esophageal epithelium and unidirectional smooth muscle tissue component generation in vitro. J Gastrointest Surg. 13 (6), 1037-1043 (2009).
  7. Macheiner, T., Kuess, A., Dye, J., Saxena, A. K. A novel method for isolation of epithelial cells from ovine esophagus for tissue engineering. Biomed Mater Eng. 24 (2), 1457-1468 (2014).
  8. Mishra, A. Significance of Mouse Models in Dissecting the Mechanism of Human Eosinophilic Gastrointestinal Diseases (EGID). J Gastroenterol Hepatol Res. 2 (11), 845-853 (2013).
  9. Medvedev, S. P., Shevchenko, A. I., Zakian, S. M. Induced Pluripotent Stem Cells: Problems and Advantages when Applying them in Regenerative Medicine. Acta Naturae. 2 (2), 18-28 (2010).
  10. Metallo, C. M., Azarin, S. M., Ji, L., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. Engineering tissue from human embryonic stem cells. J Cell Mol Med. 12 (3), 709-729 (2008).
  11. Lee, H., Park, J., Forget, B. G., Gaines, P. Induced pluripotent stem cells in regenerative medicine: an argument for continued research on human embryonic stem cells. Regen Med. 4 (5), 759-769 (2009).
  12. Ghaedi, M., et al. Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix. J Clin Invest. 123 (11), 4950-4962 (2013).
  13. Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. , (2013).
  14. Ogaki, S., Morooka, M., Otera, K., Kume, S. A cost-effective system for differentiation of intestinal epithelium from human induced pluripotent stem cells. Sci Rep. 5, 17297(2015).
  15. Ehrhardt, C., Kim, K. J., Lehr, C. M. Isolation and culture of human alveolar epithelial cells. Methods Mol Med. 107, 207-216 (2005).
  16. Zubeldia-Plazaola, A., et al. Comparison of methods for the isolation of human breast epithelial and myoepithelial cells. Front Cell Dev Biol. 3, 32(2015).
  17. Spurrier, R. G., Speer, A. L., Hou, X., El-Nachef, W. N., Grikscheit, T. C. Murine and human tissue-engineered esophagus form from sufficient stem/progenitor cells and do not require microdesigned biomaterials. Tissue Eng Part A. 21 (5-6), 906-915 (2015).
  18. Roche, J. K. Isolation of a purified epithelial cell population from human colon. Methods Mol Med. 50, 15-20 (2001).
  19. Southgate, J., Hutton, K. A., Thomas, D. F., Trejdosiewicz, L. K. Normal human urothelial cells in vitro: proliferation and induction of stratification. Lab Invest. 71 (4), 583-594 (1994).
  20. Kalabis, J., et al. Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture. Nat Protoc. 7 (2), 235-246 (2012).
  21. Geraghty, R. J., et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. Br J Cancer. 111 (6), 1021-1046 (2014).
  22. Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S. L., et al. Molecular Cell Biology. , W.H. Freeman. New York. (2000).
  23. Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).
  24. Suprynowicz, F. A., et al. Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (49), 20035-20040 (2012).
  25. Davis, A. A., et al. A human retinal pigment epithelial cell line that retains epithelial characteristics after prolonged culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (5), 955-964 (1995).
  26. Carro, O. M., Evans, S. A., Leone, C. W. Effect of inflammation on the proliferation of human gingival epithelial cells in vitro. J Periodontol. 68 (11), 1070-1075 (1997).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Conditional ReprogrammingEsophageal Epithelial CellsTissue EngineeringPediatric EsophagusEndoscopic BiopsyFeeder Cell RemovalROCK InhibitorEpithelial Cell ExpansionEosinophilic Esophagitis3D Esophageal Scaffold

مقالات ذات صلة