التسامي DAN مصفوفة للكشف والتخيل من Gangliosides في الجرذ أنسجة المخ لMALDI التصوير قياس الطيف الكتلي

مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز / التأين (MALDI) التصوير الطيف الكتلي (IMS) أصبحت سعى للغاية بعد تقنية لرؤية التوزيع المكاني للدهون، والببتيدات والبروتينات عبر السطوح عينة سليمة. MALDI IMS كان يعرف سابقا باسم تقنية تحليلية لالتحاليل تنقيته قبل، ولكن في السنوات الأخيرة، فقد كان لافتا الانتباه في العديد من التخصصات الأخرى بسبب القدرة على الجمع بين دقة قياس الطيف الكتلي مع ارتفاع القرار نقاط مرجعية التشريحية / البصرية دون تحتاج لأي وضع العلامات الخارجي. مع استمرار تجمع علمي من الباحثين الاستفادة من هذه التقنية في النمو، وهناك زيادة الحاجة إلى بروتوكولات سهلة لمتابعة موحدة للمساعدة في تطوير وتعظيم الاستفادة من التجارب IMS. Gangliosides، مجموعة من الدهون غشاء فيرة للغاية في النظام العصبي المركزي، وتعتبر مثالية لإجراء التجارب MALDI IMS كما مواقعها، وجزءا لا يتجزأ من داخل الغشاء، يجعل SPECI معينوفاق المستحيل للكشف عن استخدام التقليدية المناعي وضع العلامات. بالإضافة إلى ذلك، لقد أظهرنا، وذلك باستخدام MALDI IMS، أن هذه الدهون، التي تعمل كما جهري من الإشارات الخلوية، من بين أمور أخرى، لديها أنماط التوزيع التشريحي فريدة من نوعها في الدماغ القوارض الصحي التي يتم تعديلها بعد إصابات الدماغ ^{3، 4، 5.} تقع Gangliosides في مجموعة والشامل أعلى بالمقارنة مع معظم أنواع الدهون، وبالتالي فهي أكثر ملاءمة لمنصة MALDI التصوير.

الشكل 1: سير العمل من MALDI IMS تجربة. الرسم البياني لسير العمل العام من تجربة MALDI IMS باستخدام التسامي. هو مقطوع الأنسجة المجمدة في -80 درجة مئوية في ناظم البرد و 10 ميكرومتر أقسام هي التي شنت ذوبان الجليد على الشرائح ايتو موصل. ثم يتم وضع الشريحة في مجفف حتى التسامي. سليتندس دي في جهاز التسامي ويتم تطبيق طبقة حتى من مصفوفة على سطح عينة الأنسجة. يتم تجميد عينات بين عشية وضحاها في الثلاجة -20 درجة مئوية ثم توضع في مجفف لمدة 10 دقيقة. مرة واحدة وقد تم تطبيق المعايير، يتم إدراج العينات في الصك MALDI حيث يتم توجيه الليزر عبر الأنسجة مما تسبب جزيئات المستوعبة في مصفوفة لتأيين. السفر الأيونات أسفل أنبوب الطيران ومنفصلة على أساس كتلتها (الوقت من الطيران / TOF) حتى وصولها إلى كاشف. يتم عرض المعلومات على وفرة الأيونية في التحاليل ضمن الكتلة للتهمة (م / ض) مجموعة محددة سلفا على حد سواء صورة الجزيئية والطيف الشامل. ويمكن استخدام هذه البيانات لكلا تصور وقياس وفرة الأيونية الحليلة المصالح داخل الأنسجة المصورة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

إعداد عينةلMALDI IMS غير متغيرة بصورة كبيرة حيث أن كل خطوة من خطوات العملية يجب أن تكون مخصصة للالتحاليل من الفائدة. والسمة المميزة لتجاربه التي تستند MALDI-هو استخدام طلاء مصفوفة المتوضعة على سطح العينة قبل التحليل. بالإضافة إلى دور امتصاص ونقل الطاقة من الإشعاع من الليزر أثناء عملية الاجتثاث، مصفوفة يخدم أيضا لعزل التحاليل المختلفة من العينة، مما يسهل تحليل المركبات من الفائدة ^{6 و 7.} تطبيق متجانس من مصفوفة لسطح العينة هي الخطوة الأكثر أهمية في عملية إعداد العينات. غير لائق مصفوفة ترسب يمكن أن يؤدي إلى كبيرة تشكيلات غير متجانسة مصفوفة الكريستال وتطوير الأعمال الفنية، وانخفاض ايون إشارة، وضعف استنساخ ^7.

نظرا لتقارب بعض المصفوفات لعزل التحاليل محددة، ونوع من مصفوفة اختيار لتجربة يمكنتغيير كبير في النتيجة. المصفوفات المستخدمة في التصوير من البروتينات والببتيدات غالبا ما تختلف عن تلك المستخدمة لنسبة الدهون في التصوير وعملية تعقيدا بسبب الحاجة إلى إجراءات إضافية مثل الغسيل والإماهة الخطوات من أجل الكشف عن إشارات بنجاح من الأنسجة. على الرغم من وجود غسل خطوات لتعزيز الإشارات الدهون ^8، فهي ليست شرطا مسبقا للكشف عن معظم أنواع الدهون. عند اختيار مصفوفة لتجربة الدهون التصوير، فمن المهم النظر في قطبية الدهون من الاهتمام حيث سيؤدي ذلك إلى تضييق نطاق المصفوفات مناسبة. على سبيل المثال، gangliosides تحتوي على بقايا حمض اللعابي الذي منحهم الاستقطاب السلبي العام. وهناك عدد من المصفوفات التي يمكن أن يلتفظ بفعالية وتأيين gangliosides من الأنسجة. ومع ذلك، هناك عوامل مثل قمم المشتقة من مصفوفة في الطيف والاستقرار في المصفوفة تحت فراغ يجب أن تؤخذ قيد النظر. 1،5-diaminonapthalene (DAN) مصفوفة مستقرة بما فيه الكفاية في ظل ظروف أداة فراغ بالنسبة لغالبية تطبيقات التصوير وأظهرت درجة عالية من الحساسية لالامتزاز الدهون، ويمكن استخدامها لتحليل الدهون في كل من وسائط أيون الإيجابية والسلبية ^2. DAN مصفوفة، بالمقارنة مع غيرها من المصفوفات السلبي الدهون تقارب مثل حمض dihydroxybenzoic (DHB)، 9-aminoacridine (9-AA)، و5-كلورو-2-mercaptobenzothiazole (CMBT)، وكان قادرا على يلتفظ gangliosides من دماغ الفئران أكثر كفاءة الأنسجة في وضع الأيونات السالبة (مخطوطة قيد الإعداد).

اختيار الطريقة الملائمة لترسب مصفوفة غير ذات أهمية متساوية للاختيار المصفوفة نفسها. طرق مصفوفة ترسب الرطب حيث يذوب المصفوفة الصلبة في المذيبات العضوية، وأودعت التي تعمل بالهواء المضغوط أو آليا الرشاشات أو راصدي، هي فعالة بشكل خاص لالامتزاز من البروتينات والببتيدات كسائل يتخلل العينة للسماح للخارجction من المركبات وشارك في بلورة مع المصفوفة. على الرغم من أن هذه التقنيات يمكن أن تستخدم أيضا لتطبيقات الدهون، عدم التمركز تحليلها ومصفوفة متفاوتة تشكيلات الكريستال والحدوث بسبب وفرة عالية وقابلية ذوبان الدهون في المذيبات، وخاصة في الأنسجة ^{2 و 9.} لأن الدهون هي المتأينة بسهولة من الأنسجة الجافة التقنيات ترسب مصفوفة مثل التسامي، وتقديم بسيط، والتكلفة بديل فعال للرشاشات في حين التحايل على العديد من العيب من هذه التقنيات. ويعزى نجاح التسامي في التجارب MALDI IMS إلى ميزات مثل التشكل الجريزوفولفين المصفوفة مما يزيد من مساحة السطح لمصفوفة الحليلة ملزمة، وزيادة نقاء مصفوفة، ومتجانسة ترسب مصفوفة مما يؤدي إلى زيادة استنساخ مقارنة مع تقنيات المصفوفة الرطب ^{1 و 10.}

التسامي invoالتلاميذ تسخين مصفوفة مسحوق تحت فراغ تحت سطح العينة تبريد مما أدى إلى الحالة الصلبة إلى غاز مرحلة الانتقال من مصفوفة مسحوق تليها ترسب على سطح عينات الأنسجة على الفور. خلال التسامي، ويمكن التحكم ترسب مصفوفة بعوامل مختلفة مثل الساعة ودرجة الحرارة والضغط لتقديم نتائج استنساخه للغاية. تجربة التسامي واحدة يمكن أن تتخذ في أي مكان 5-20 دقيقة اعتمادا على نوع من مصفوفة محددة، والتي يمكن إعادة استخدامها عدة مرات قبل التخلص منها. جهاز يمكن شراؤها تجاريا في جزء صغير من سعر الرشاشات الآلية ويسهل تفكيكها للتنظيف والصيانة. منخفضة التكلفة والبساطة النسبية لهذه التقنية ترسب مصفوفة تجعله مثاليا للباحثين بداية أو التوسع فيها تطبيقات الدهون التصوير في MALDI IMS. على الرغم من أن المعلومات بالتفصيل بروتوكولات للتسامي من الأنسجة لIMS تم الإبلاغ عن ^11، وعدد قليل بروتوكولات موحدة توجد ثهيك التركيز على العمل الأساسية المعنية مع إجراء تجربة التسامي لتصوير الدهون كتلة عالية في وضع الأيونات السالبة، مما يجعل من الصعب تحديد الأسلوب دون محاكمة واسعة والخطأ. ما يلي هو بروتوكول تجريبي يهدف إلى سد هذه الفجوة من أجل التسامي DAN مصفوفة على أقسام دماغ الفئران للتصوير عالية الدقة والكشف عن gangliosides.

الشكل 2: التسامي جهاز. صورة (A) والرسم التخطيطي (ب) من جهاز التسامي. توصيل مضخة الفراغ أنابيب المطاط إلى فخ بارد مليئة 300 مل من الايثانول. فخ البارد ثم يتم توصيلها عن طريق أنابيب المطاط إلى جهاز التسامي. يتكون الجهاز يتكون من قطعتين منفصلتين من الأواني الزجاجية التي مختومة مع المعدن U-المفصل. النصف العلوي من sublimatorيحتوي المكثف وهي مليئة طين الجليد. وسجلت لوحة العينة على الجزء السفلي من المكثف، داخل جهاز والزجاج مغلق. يحتوي على النصف السفلي من جهاز التسامي مصفوفة DAN، انتشرت التي تواجه بالتساوي لوحة عينة. خلال التسامي، يتم وضع جهاز والزجاج على حمام الرمل تسخينه إلى 140 درجة مئوية بحلول طبق ساخن أسفله مباشرة. مسبار درجة الحرارة يساعد على الحفاظ على درجة حرارة ثابتة طوال التجربة التسامي من خلال ردود الفعل لدرجة حرارة حمام الرمل بالمقارنة مع درجة الحرارة مسبقا للتجربة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

جميع إجراءات التعامل مع الحيوانات المذكورة أدناه التمسك جامعة جنة رعاية الحيوان يسترن اونتاريو في (2016-014).

1. الأنسجة إعداد وباجتزاء

1. استخراج أنسجة الدماغ من الفئران من خلال عملية تعرف باسم "الطازجة المجمدة استخراج" (الغذاء مقابل التعليم).
   1. الموت ببطء الفئران مع جرعة زائدة من الصوديوم بنتوباربيتال ومراقبة ردود الفعل في الأطراف. مرة واحدة قد توقفت عن ردود الفعل، وقطع رأس فأر باستخدام المقصلة.
   2. بعناية فصل العضلات والأنسجة الأخرى من الجمجمة باستخدام مشرط. استخدام ملقط قطع العظام لكسر في الجمجمة لفضح الدماغ، بدءا من قاعدة الجمجمة (الثقبة ماغنوم) إلى الجزء الأمامي.
   3. مرة واحدة يتعرض لها المخ، حلج القطن بعناية بها مع ملعقة جراحية ووضع على الفور على الثلج الجاف المسحوق لتجميد فلاش.
      ملاحظة: إن الدماغ يكون مرن جدا. لذلك، واتخاذ الحذر الشديد عند وضع الدماغ علىثلج جاف. إذا تم سحق الدماغ أو الضغط على أي سطح، فإنه سيتم تغيير شكله وتجميد في هذا الموقف.
2. إزالة الأنسجة المجمدة الطازجة (لا مع perfused الفورمالديهايد أو جزءا لا يتجزأ من أكتوبر) من - 80 ° C الفريزر وتوضع على الثلج الجاف.
3. ضع عدة قطرات من الماء على حامل ناظم البرد ومكان على أي من الثلج الجاف أو شريط تجميد ناظم البرد. الصحافة الأنسجة طفيفة على حامل ناظم البرد حيث يبدأ لتجميد وعقد حتى يتجمد الماء حول قاعدة النسيج والمراسي في مكانه. إضافة كميات إضافية من الماء لزيادة تأمين الأنسجة على حامل إذا لزم الأمر.
   وتستخدم المياه بدلا من وسائل الاعلام أكتوبر لتركيب الأنسجة من أجل تجنب التلوث من النسيج مع المركبات التي يمكن أن تؤثر على الكشف عن الإشارة المطلوبة: ملاحظة.
4. الأنسجة موقف في ناظم البرد. قسم الأنسجة تصل إلى الموقع التشريحي المطلوب. تأكد من أن سماكة القطع ما بين 8-12 ميكرون.
   ملاحظة: عندما باجتزاء الأنسجة في ناظم البرد الطائفيالأجهزة، فإنه لا بد أن المواد منفصلة مثل شفرات، فرش، القضبان المضادة للدوران، وأصحاب استخدامها من أجل تجنب التلوث مع تضمين المركبات. كما ينبغي تنظيفها من الداخل ناظم البرد تماما مع الايثانول قبل الاستخدام.
5. باستخدام ناظم البرد المضادة للشريط القوائم، ببطء قسم بالارض أقسام الأنسجة. يمكن أن تحدث ثقوب أو علامات على الأنسجة إذا وضع شريط القوائم غير صحيحة أو شفرة هو ممل. نقل الأنسجة إلى مركز تشريح منصة باستخدام فرشاة التلوين نظيفة.
6. متزايد
   1. تجميد الشرائح الموصلة أو لوحات معدنية عن طريق وضعها في ناظم البرد أثناء تقطيع. عندما يتم تجميد الشريحة تماما، نقل بعناية الأنسجة مقطوع على سطح موصل من الشريحة باستخدام فرشاة التلوين نظيفة. مرة واحدة يتم وضع جميع أقسام الأنسجة بشكل صحيح على الشريحة، ووضع الإصبع تحت الشريحة، مقابل الأنسجة، والصحافة حتى يذوب هذا الباب.
      ملاحظة: أقسام قد أضعاف أو حليقة أثناء عملية الذوبان عندمااستخدام هذا الأسلوب في تصاعد مستمر. يمكن تخفيض هذا عن طريق الحفاظ على الشريحة في ناظم البرد عند ذوبان الأنسجة. إذا أصبحت هذه القضايا الإشكالية، كبديل لذلك، يتم سرد دافئ جبل الأسلوب أدناه.
   2. بدلا من ذلك، أخذ درجة حرارة الغرفة الإنديوم والقصدير أكسيد (ايتو) الشرائح (أو لوحة معدنية) واضغط برفق لأسفل على قسم الأنسجة المجمدة على سطح منصة تشريح، جنبا موصل أسفل. وسوف يؤدي ذلك إلى قسم الأنسجة ذوبان بالتساوي على سطح الشريحة مع القليل من الشباك أو قابلة للطي من الأنسجة.
      ملاحظة: قد تظهر التكثيف أسفل المقطع عند تركيب باستخدام هذه الطريقة التي قد تؤدي إلى فقدان بعض البروتينات والدهون.
7. وضع الشرائح مع الأنسجة في مجفف لل5-10 دقيقة.

2. Sublimator جهاز مجموعة المتابعة

ملاحظة: تنفيذ هذه الخطوات في غطاء الدخان.

1. وضع حمام الرمل في وعاء الألومنيوم على طبق ساخن، مع طبق ساخن على رفع مقص المعادنمن مساحة مناسبة (أي أكبر من صفيحة ساخنة). بدوره على طبق ساخن وضبط درجة الحرارة إلى 140 درجة مئوية.
   ملاحظة: نقطة انصهار لDAN مصفوفة ما بين 187-190 درجة مئوية. لا تتجاوز درجة الحرارة هذه على موقد.
   1. إذا تم تجهيز طبق ساخن في درجة حرارة ردود الفعل التحقيق، واستخدامها لمراقبة درجة حرارة الرمال في كافة مراحل التجربة والتأكد من درجة حرارة الاتساق. هذه الميزة يمكن أن تساعد مع استنساخ التجربة في مختلف التجارب التسامي.
      ملاحظة: يجب أن ترد حمام الرمل في وعاء الألومنيوم كما وعاء زجاجي قد تتحطم عند درجات حرارة عالية.
2. وضع 300 ملغ من DAN مصفوفة على السطح السفلي للجهاز التسامي. وضع مصفوفة في وسط الجهاز وانتشرت حتى في طبقة في عرض تقريبي وطول الشريحة يجري مصعد.
   تنبيه: DAN مصفوفة سامة. ولذلك، من المهم ارتداء القفازات، والأقنعة، والسلامةنظارات واقية في جميع الأوقات عند التعامل مع المصفوفة المجفف. يجب أن يتم تخزين DAN في الظلام كما أنها خفيفة حساسة.
3. الشريط لوحة معدنية على السطح الداخلي للجهاز مع لوحة صنع اتصال مباشر مع الجزء السفلي من المكثف من أجل ضمان التوزيع المتساوي للحرارة التبريد عبر كامل سطح الشريحة خلال التسامي. بدلا من ذلك، الرمال أسفل المكثف لضمان سطح مستو.
   1. وضع الشريط على طول الحواف الخارجية للوحة والتمسك الجانبين من الأواني الزجاجية الداخلية. إذا تم وضع الشريط في إطار لوحة وتلتزم الجزء السفلي من سطح الزجاج الداخلي، قد لا يكون توزيع درجة الحرارة حتى ويمكن أن يؤدي إلى توزيع غير متكافئ مصفوفة على سطح الشريحة.
   2. الشريط فارغ (اختبار) ينزلق بشكل مائل على سطح لوحة معدنية مع الشريط وضعت مرة أخرى على الحواف الخارجية للشريحة.
4. ربط الأجزاء العلوية والسفلية من الجهاز، ثإيث المطاط يا الدائري في الوسط لضمان وجود ختم كاملة.
5. وضع معدن U-مفصل حول مركز الجهاز وتشديد الرذائل حتى يتم اغلاق النصف العلوي والسفلي من الجهاز بإحكام معا. ضع في المعدن يا الدائري فوق حمام الرمل.
6. تأخذ حفنة من الثلج المجروش ووضعه في المكثف. ملء مكثف ¼ إلى ½ كامل مع الماء البارد لخلق طين الجليد. سوف طين الجليد تبريد صفيحة معدنية في داخل الجهاز وبعد ذلك الشريحة نلتزم به. انتظر 5 دقائق على الأقل لدرجة الحرارة للوصول إلى حالة مستقرة.
7. صب 300 مل من الايثانول في حاوية فخ الباردة ووضع الأواني الزجاجية في وعاء. إسقاط 2-3 قطع صغيرة من الثلج الجاف في الإيثانول في قاع الإناء فخ الباردة. فخ المدخلات البارد لديه أنبوب زجاجي جارية إلى أسفل الاسطوانة، في حين أن الإنتاج لا.
8. توصيل مضخة فراغ لانتاج فخ البارد باستخدام أنابيب مطاطية. استخدام قطعة أخرى من المطاطأنابيب لربط مدخلات فخ بارد للجهاز التسامي. تأكد من أن الأنابيب يتم تأمين بإحكام باستخدام مشابك معدنية إذا كانت متوفرة.
9. استخدام مضخة فراغ لتقديم فراغ من 30 - 50 طن متري. السماح للمضخة لتشغيل لمدة 5 دقائق على الأقل للضغط موازنة. قد يكون من الرذائل في U-حلقة من جهاز التسامي إلى تشديد مرة أخرى يتم تشغيل المضخة فراغ على بسبب الضغط انخفض في الجهاز.
   ملاحظة: يوصى بشدة أن مقياس فراغ أن تعلق على مضخة لمراقبة ضغط الفراغ خلال التجربة واختبار للكشف عن التسربات في الضغط من أجل تحقيق أعلى استنساخ محتمل بين التجارب. ومع ذلك، فقد تم تصميم معظم مضخات للحفاظ على الضغط المستمر، وبالتالي فإن مقياس قد لا يكون من الضروري للمستخدمين ذوي الخبرة. بالإضافة إلى ذلك، ختم فراغ الشحوم يمكن استخدامها للمساعدة في الحفاظ على ضغط الفراغ.

3. التسامي

1. تأكد من أن درجة حرارة حمام الرمل له STABILأوتوماتيكية في 140 درجة مئوية، وأن يتم تأمين الجهاز في المعدن يا الدائري فوق حمام الرمل مع جميع أنابيب اتصال والفراغ قيد التشغيل.
2. تعيين جهاز ضبط الوقت لمدة 7 دقائق ولكن لا تبدأ الموقت. ببطء رفع رفع مقص والرمل حمام تصل إلى جهاز التسامي حتى U-مفصل من sublimator هو أعلى بكثير من المعادن يا الدائري. هذه المساحة الإضافية يسمح لتعديل الجهاز على الرمال.
   1. اضغط بسرعة sublimator بلطف على سطح الرمال للتأكد من أن الجهاز هو الجلوس بالتساوي على الرمال، ومن ثم تبدأ على الفور الموقت.
3. عندما يبدو الموقت، إيقاف مضخة فراغ وخفض بعناية رفع مقص حتى sublimator لم يعد لمس حمام الرمل ويجلس بشكل آمن في المعدن يا الدائري.
   1. ببطء تخفيف صمام تنفيس الجزئي للافراج عن الضغط في الجهاز. قم بفك الشبك المعدني حول أنابيب مطاطية للجهاز التسامي وتبدأ ببطء لتخفيف الأنبوب. وبمجرد أن رووقد خففت أنبوب BBER قليلا، وثني الأنبوب إلى جانب واحد للسماح للضغط المتبقية من الفرار.
   2. عندما يعود الضغط المحيطة، وإزالة بعناية أنابيب المطاط من جهاز التسامي.
4. تخفيف الرذائل على U-مفصل من أجهزة وإزالتها. بعناية فصل شطري جهاز التسامي وسحب قبالة الشريحة من الجزء العلوي من الأواني الزجاجية الداخلية. فحص شريحة لتأكيد وتوزيع المصفوفة.
   ملاحظة: إذا مصفوفة متفاوتة، مصفوفة مسحوق في الجزء السفلي من sublimator يمكن تعديل أوضاعها أو جهاز sublimator يمكن تعديل أوضاعها في الرمال لالشريحة التالية. عملية التسامي يمكن أن يتكرر عدة مرات باستخدام نفس المصفوفة، ومع ذلك، فإن مصفوفة تصبح في نهاية المطاف أكثر قتامة من التعرض للحرارة المتكررة وكمية من مسحوق سيقلل مثل هذا الوقت التسامي سوف يتعين تعديلها قليلا لتعويض. لهذا السبب، من المهم رصد مبلغ باي مصفوفةمصعد نانوغرام بعد كل تجربة لضمان الاتساق في ترسب مصفوفة بين الشرائح
5. إذا كان التوزيع وكمية من مصفوفة مصعد كافية، الشريط شريحة جديدة مع الأنسجة على الداخل من sublimator وتكرار القسم 3.
   ملاحظة: لمراقبة الجودة (QC) الأغراض، وكمية من مصفوفة مصعد يمكن قياسها بعد كل تجربة وزنها عن طريق الشريحة قبل وبعد التسامي وقسمة الوزن من مصفوفة مصعد مع المساحة السطحية للشريحة ^2، تجدر الإشارة إلى أن ويرجع ذلك إلى عدم الدقة في معظم جداول وراء 4 نقاط عشرية والتباين بين المقاييس، ينبغي أن تستخدم هذه القياسات سوى دليل لترسب مصفوفة الأمثل بدلا من وسيلة قابلة للقياس الكمي تماما QC ما لم يتم استخدام توازن عالية الدقة (انظر الشكل 3).

4. الأنسجة التخزين / الإماهة

1. بعد التسامي، وتخزين الشرائح في حاوية مغلقة أو كاس صغيرETTE في كيس من البلاستيك مختوم.
2. احتضان الشرائح في الثلاجة -20 درجة مئوية لمدة 2 ساعة أو بين عشية وضحاها.
   ملاحظة: إن الهدف من عملية التجميد هو بمثابة خطوة الإماهة عن الامتزاز من المواد الأنسجة في المصفوفة. وقد تبين أيضا عملية التجميد لمنع تدهور إشارات الدهون لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع عند تخزينها في -80 ° C ^12. لهذا السبب، فإن مقدار الوقت يتم تخزين العينات في الثلاجة يمكن أن تختلف إلى درجة معينة لتتناسب مع احتياجات مجرب دون تغيير ملحوظ الكشف عن إشارة (كما لوحظ في مختبرنا). ومع ذلك، لاحظنا بعض تلون المصفوفة عندما يتم تجميد العينات لمدة أطول من 24 ساعة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. وبالتالي، فإننا نوصي تصوير الأنسجة مصعد قبل ذلك الوقت أو تخزين الأنسجة عند -80 درجة مئوية لفترات حضانة أطول.
3. إزالة الشرائح من الفريزر (وعاء) ومكان في مجفف لل5-10 دقيقة.

5. التصوير و Analysis

1. إزالة الشرائح من مجفف وتطبيق معايير أداة لضمان دقة الجماعية لأداة MALDI أثناء التصوير. ونوع من المعايير تختلف تبعا الأجهزة. وتطبق المعايير عموما بالتساوي عبر الشريحة بأكملها، الأنسجة المحيطة للتصوير (الشكل 3D).
2. إدراج شريحة إلى أداة MALDI واتبع تعليمات الشركة الصانعة للتجارب التصوير (يجب أن يكون الأمثل طرق أداة ل1000 - مجموعة الشامل 2000). وقد حصلت الممثلة نتيجة (الشكل 4) في وضع سلبي reflectron مع النقطية 70 ميكرون و 20 طلقات / الطيف (اكتساب الوقت ~ 2 ساعة).

عند الانتهاء من التجربة التسامي، ويفصل شطري جهاز الزجاج في غطاء الدخان والشرائح، مسجلة إلى المكثف، ويمكن إزالتها (الشكل 3A). عند هذه النقطة، ينبغي دراسة شريحة لالتوزيع غير المتكافئ مصفوفة والوقت ودرجة الحرارة، أو وضع الجهاز في الحمام الرمال قد يكون من الضروري تعديل لالشريحة التالية. وهناك الناجحة DAN التسامي التجربة يؤدي حتى طلاء رمادي / مصفوفة البني على طول سطح الشريحة حيث الخصائص التشريحية للأنسجة يمكن تصور واضح وكمية من مصفوفة على شريحة زجاجية تشبه لكمية على النسيج (الشكل 3B). على سبيل المثال، إذا تم مصعد الكثير من مصفوفة على الأنسجة، وسمك مصفوفة تغطي ملامح النسيج وفقط الشكل العام سيكون ملحوظ. ومع ذلك، إذا كان مصعد مصفوفة صغيرة جدا، فإن الأنسجة هالقد مظهر أغمق من بقية الشرائح (الشكل 3C). كلا كثيرا وسوف مصفوفة قليلة جدا يؤدي إلى ضعف الإشارة في الصك MALDI. لأغراض مراقبة الجودة، وتوماس وآخرون. وزن كمية من مصفوفة المودعة على الشريحة وتقسيم الوزن عن طريق المساحة السطحية للشريحة. وذكرت أنها مبلغ الأمثل للترسب مصفوفة لعدة مصفوفات بما في ذلك DAN (110 ميكروغرام / سم ²) 2. على الرغم من أن معظم أرصدة تفتقر إلى الدقة اللازمة لتكرار مثل هذه النتائج، حاولنا هذه الطريقة في مراقبة الجودة؛ ولكن نظرا لدرجة عالية من التباين، يمكننا تقديم المشورة فقط مجموعة مناسبة من ترسب مصفوفة وجدت لتكون مرتبطة ناجحة مقابل تجارب فاشلة التسامي مع DAN المصفوفة كما هو محدد من خلال الكشف عن إشارة في الصك. ارتبطت قياس مصفوفة من أقل من 100 ميكروغرام / سم ² مع "القليل جدا" شروط مصفوفة بينما كان قياس فوق 140 ميكروغرام / سم ²يرتبط مع "بدرجة كبيرة". تم العثور على ترسب مصفوفة ما بين 100 و 140 ميكروغرام / سم ² أن تكون الكمية المثلى للتصوير مع DAN المصفوفة. ينبغي تطبيق معايير معايرة على شريحة زجاجية حول عينات الأنسجة لضمان دقة الجماعية لإشارات IMS الكشف عن (الشكل 3D)

في تجربة MALDI IMS، وصورة الجزيئية تسمح التصور للتوزيع المكاني لتحليلها من الفائدة جنبا إلى جنب مع أي نوع من الأنواع غير المعروفة التي قد تكون موجودة في مجموعة والشامل معينة. تم مضافين الصور الجزيئية للgangliosides في هذه التجربة باستخدام برنامج ImageJ لإظهار التوزيع التشريحي للعديد من الأنواع غانغليوزيد عبر المناطق القشرية وتحت القشرية من الدماغ الفئران (الشكل 4A). وgangliosides الأكثر وفرة في الدماغ هي الأنواع A-سلسلة GD1a وGM1 ولكن أيضا تحتوي على gangliosides GM2 وGM3 التي يمكن أن تكون جميع وجدت بين1،000-2،000 م / مجموعة ض الشامل، مجموعة الشامل أعلى من معظم الدهون الدماغ المشتركة، مما يجعل هذه gangliosides السهل التعرف على طول الطيف (الشكل 4B). وفرة الأيونية من كل الأنواع غانغليوزيد يمكن استخدامها لشبه تحديد الاختلافات أو التغيرات في الأنواع غانغليوزيد داخل الصورة نفسها. لأن كمية معينة من التباين في العينة الإعدادية لا يمكن تجنبها في IMS، بين تعتبر مقارنات المسح الضوئي لتكون شبه كمي.

الرقم 3. DAN التسامي. نتائج ممثلة من التسامي من DAN مصفوفة على أنسجة دماغ الفئران. (A) وعند الانتهاء من التسامي، ويفصل شطري الجهاز وتتم إزالة الشريحة من المكثف. (ب) DAN مصفوفة ينتشر بالتساوي عبر عدة أقسام الأنسجة دماغ الفئران على سطح الشريحة للسماح repr للغايةالنتائج oducible (بين 100-150 ميكروغرام / سم ²). (ج) أمثلة من تجارب التسامي فشلت حيث مصفوفة القليل جدا (يسار - <90 ميكروغرام / سم ²) (اليمين أو الكثير من مصفوفة -> أودع 150 ميكروغرام / سم ²). أيضا مصفوفة قليلا وسوف يؤدي في الامتزاز كاف من التحاليل، في حين أن الكثير من مصفوفة لن تسمح ليزر لاختراق إلى الأنسجة خلال الاستحواذ، مما أدى إلى الكشف عن أيون منخفض. (D) الشريحة التي تحتوي على أقسام الأنسجة دماغ الفئران مصعد مع معايير مصفوفة ومعايرة DAN تطبيق مستعدة لإدراجها في الصك MALDI للتصوير. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4. MALDI IMS من Gangliosides في دماغ الفئران. Representativالبريد MALDI IMS صورة الجزيئية والطيف الشامل من gangliosides في الدماغ الفئران بعد التسامي مع DAN المصفوفة. الصورة الجزيئية هي مزيج مركب من الأنواع غانغليوزيد متعددة في الطيف مضافين وpseudocolored باستخدام برنامج J صورة لإظهار التوزيع التشريحي فريدة من الأنواع غانغليوزيد في جميع أنحاء الدماغ. الأنواع GM1d18: 1 (أحمر، كتلة ~ 1547 دا)، GM1d20: 1 (الأخضر وكتلة ~ 1573 دا)، GM3d18: 1 (الأزرق وكتلة ~ 1178 دا)، وGM3d20: 1 (البط البري والكتلة ~ 1207 دا) هي ممثلة. يعرض الطيف الكتلي وفرة الأيونية في التحاليل في غضون 1000 - مجموعة كتلة 2000. وصفت gangliosides A-سلسلة كبير على طول الطيف. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.