يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التمايز كفاءة الخلايا الجذعية المحفزة لNKX6-1

7.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/55265

⸱

مارس 7, 2017

 , 
1Toronto General Research Institute, University Health Network, 2McEwen Centre for Regenerative Medicine, University Health Network, 3Department of Physiology, University of Toronto

في هذه المقالة

ملخص

نحن هنا وصف بروتوكول 4-مرحلة لتمييز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية لNKX6-1 + الأسلاف البنكرياس في المختبر. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول لمجموعة متنوعة من خطوط الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان.

الملخص

الخلايا الجذعية المحفزة لديها القدرة على الذات تجديد وتميز لأنساب متعددة، مما يجعلها مصدرا جذابا لتوليد الخلايا الاولية البنكرياس التي يمكن استخدامها لدراسة والعلاج في المستقبل من مرض السكري. توضح هذه المقالة بروتوكول التمايز أربع مراحل مصممة لتوليد الخلايا الاولية البنكرياس من خلايا جذعية جنينية بشرية (hESCs). ويمكن تطبيق هذا البروتوكول إلى عدد من خطوط الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSC). النهج المتبع لتوليد الخلايا الاولية البنكرياس هو التفريق hESCs لنموذج بدقة المراحل الأساسية للتنمية البنكرياس. هذا الأمر يبدأ تحريض الأديم الباطن نهائي، الذي يتحقق من خلال زراعة الخلايا في وجود Activin A، الخلايا الليفية عامل النمو الأساسي (bFGF) وCHIR990210. مزيد من التمايز والزخرفة مع عامل الخلايا الليفية النمو 10 (FGF10) وDorsomorphin يولد خلايا تشبه المعى الأمامي الخلفي. إضافة ريتينحمض منظمة المؤتمر الإسلامي، رأس، سان-1 وFGF10 يميز خلايا الخلفي المعى الأمامي إلى خلايا مميزة من الأديم البنكرياس. وأخيرا، فإن الجمع بين عامل نمو البشرة (EGF)، نيكوتيناميد ورأس يؤدي إلى توليد كفاءة PDX1 + / + NKX6-1 الخلايا. التدفق الخلوي يتم تنفيذه لتأكيد التعبير عن علامات معينة في مراحل رئيسية من تطوير البنكرياس. وPDX1 + / + NKX6-1 الأسلاف البنكرياس في نهاية المرحلة 4 هي قادرة على توليد خلايا β الناضجة على زرع في الفئران العوز المناعي ويمكن زيادة متباينة على توليد خلايا منتجة للأنسولين في المختبر. وبالتالي، فإن الجيل كفاءة PDX1 + / + NKX6-1 الأسلاف البنكرياس، كما هو موضح في هذا البروتوكول، أهمية كبيرة، حيث أنه يوفر منبرا لدراسة تطوير البنكرياس البشرية في المختبر، ويوفر مصدرا للخلايا مع إمكانية التفريق ل خلايا بيتا التي يمكن أن EVentually أن تستخدم لعلاج مرض السكري.

المقدمة

انتشار مرض السكري في تزايد وفقا للجمعية الكندية للسكري، تشير التقديرات إلى أن أكثر من 11 مليون شخص في كندا والسكري أو prediabetic، مع 5-10٪ من هؤلاء الأفراد جود مرض السكري نوع 1 (T1D) 1. T1D هو أحد أمراض المناعة الذاتية التي يسببها تدمير خلايا بيتا المنتجة للأنسولين التي تقع ضمن جزر لانجرهانز. حاليا، والأفراد الذين يعيشون مع T1D تتطلب مصادر خارجية للأنسولين 2. على الرغم من التقدم في العلاج بالأنسولين، يستمر المرضى T1D لديهم الوقت الصعب تنظيم مستويات الجلوكوز في الدم وما زالت تعاني على حد سواء تحت؛ دون وارتفاع السكر في الدم. نموذج واعد للعلاج لاستعادة سوائية سكر الدم في T1D هو استخدام الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs)، والتي يمكن استخدامها لتوليد امدادات غير محدودة من الانسولين إنتاج خلايا بيتا على حد سواء في المجراة في المختبر 3، 4، 5، 6، 7. التفريق hESCs إلى بيتا تشبه الخلايا يمكن أن يجعل من الممكن لدراسة مرض السكري في المختبر، والسماح لتحديد أهداف علاجية جديدة لمرض السكري من النوع 2، وتوفير الخلايا للزرع في المرضى T1D.

المحاولة الأكثر نجاحا في توليد خلايا منتجة للأنسولين من hESCs في المختبر هي تلخيص للأحداث الجنينية التي تحدث أثناء تطور البنكرياس 4، 5. وهذا ينطوي على تلاعب من مسارات إشارات واضحة لنموذج بدقة المراحل الأساسية من البنكرياس النامية. تبدأ تطوير البنكرياس مع تحريض من الأديم الباطن نهائي، الذي يتميز التعبير عن CXCR4 وCD117 (ج-KIT) 8، 9. التنظيم الدقيق للdefinitمطلوب منظمة الأديم إيف لتشكيل الأنبوب امعاء، والتي يخضع آنذاك الأمامي إلى الخلفي الزخرفة والبطنية الظهرية. ظهري وبطني براعم البنكرياس الخروج من منطقة المعى الأمامي الخلفي الذي يعبر عن البنكرياس والاثنى عشر علبة مثلية الجين (Pdx1)، وهو أمر ضروري لتطوير البنكرياس 10. ظهري وبطني براعم الصمامات لتشكيل البنكرياس، والذي يخضع لثم إعادة الظهارية واسعة النطاق والتوسع 11. ويرافق الالتزام الغدد الصماء وخارجية الإفراز النسب من قبل جيل من الخلايا الاصلية متعددة القدرات (البلدان المتوسطية الشريكة) أن أعرب، من بين أمور أخرى، والنسخ عوامل Pdx1، Nkx6.1 وPtf1a 12 و 13. البلدان المتوسطية الشريكة التي ستصبح الغدد الصماء والأقنية الخلايا تستمر في التعبير عن Nkx6-1 بينما تتناقص التعبير Ptf1a. وخلافا لذلك، فإن الخلايا الإفرازية النسب تفقد expressioن من Nkx6-1 والحفاظ على Ptf1a التعبير 12.

عامل النسخ Nkx6-1 دورا رئيسيا في تطوير البنكرياس، ولا سيما خلال تمايز الخلايا الاصلية الغدد الصماء لبيتا الخلايا. كما هو موضح سابقا، حذف النتائج Nkx6-1 في تشكيل ضعف الخلايا β خلال تطوير البنكرياس 14. لذلك، وتوليد خلايا بيتا المنتجة للأنسولين في كل من المختبر والمجراة يتطلب تحريض كفاءة Nkx6-1.

نحن وضعت مؤخرا على بروتوكول لتوليد بكفاءة PDX1 + / + NKX6-1 الأسلاف البنكرياس من hPSCs. هذه الأسلاف البنكرياس المستمدة hPSC-توليد خلايا β الناضجة على زرع في الفئران العوز المناعي 3. ويمكن تقسيم بروتوكول التمايز في 4 مراحل من سمات: 1) الاستقراء الأديم الباطن نهائي2) الزخرفة الخلفي المعى الأمامي، 3) مواصفات البنكرياس و4) الحث NKX6-1. هنا نقدم وصفا مفصلا لكل خطوة من التمايز الموجهة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد حلول والإعلام

ملاحظة: تحضير جميع وسائل الإعلام لزراعة الخلايا في بيئة معقمة. وسائل الاعلام يجب ان يتم واستخدامها على الفور. وتقدم تفاصيل الكاشف في جدول المواد.

  1. التمايز وسائل الإعلام
    1. إعداد يوم 0 التفاضل وسائل الإعلام: RPMI المتوسطة مع 1٪ الجلوتامين، 2 ميكرومتر CHIR 99021، 100 نانوغرام / مل Activin A، 10 4 M MTG.
    2. إعداد يوم 1-2 التمايز وسائل الإعلام: RPMI المتوسطة مع 1٪ الجلوتامين، 100 نانوغرام / مل Activin A، 10 4 M MTG، 5 نانوغرام / مل bFGF، حمض 50 ميكروغرام / مل الاسكوربيك.
    3. إعداد يوم 3-5 التمايز وسائل الإعلام: RPMI المتوسطة مع 1٪ الجلوتامين، 1٪ B27، 10 4 M MTG، 0.75 ميكرومتر Dorsomorphin، 50 نانوغرام / مل FGF10.
    4. إعداد يوم 6-7 التمايز وسائل الإعلام: DMEM مع 1٪ الجلوتامين، 1٪ B27 و 50 ميكروغرام / مل حمض الأسكوربيك، 50 نانوغرام / مل FGF10، 0.25 ميكرومتر SANT-1، 2 ميكرومتر الريتينويك حمض، 50 نانوغرام / مل رأس.
      ملاحظة: الريتينويكوينبغي أن يضاف حمض إلى وسائل الإعلام أخيرا، وينبغي أن تكون محمية وسائل الإعلام من ضوء لمنع تدهور التأكسدي 15.
    5. إعداد يوم 12/8 التمايز وسائل الإعلام: DMEM مع 1٪ الجلوتامين، 1٪ B27 و 50 ميكروغرام / مل حمض الأسكوربيك، 50 نانوغرام / مل رأس، و 100 نانوغرام / مل hEGF، 10 ملي نيكوتيناميد.
  2. إعداد نظام مراقبة الأصول الميدانية العازلة: 10٪ FBS في برنامج تلفزيوني، ناقص الكالسيوم والمغنيسيوم.

2. HESC التمايز

وإذابة HESC، passaged وتوسيعها على الماوس المشع الليفية الجنينية في وجود وسائل الإعلام على أساس KOSR تستكمل مع bFGF 16: ملاحظة. HESCs جاهزة للتمايز عندما تصل خلايا 80-95٪ confluency. في هذا الوقت ينبغي أن تكون مستعمرات كبيرة مع حدود محددة و"domelike 'هيكل (الشكل 1A). يتم تنفيذ جميع زراعة الخلايا في أسفل شقة، زراعة الأنسجة المعالجة لوحات مغلفة مع الجيلاتين 0.1٪. عادة، وتزرع الخلايا في 6 أولوحات 12-جيدا، في مجلدات وسائل الاعلام من 2 مل أو 1 مل على التوالي.

  1. في اليوم 0، يبدأ التمايز عن طريق استبدال وسائل الإعلام على أساس KOSR مع يوم 0 التفاضل وسائل الإعلام.
  2. في أيام 1 و 2، ويهز بلطف لوحة لإزالة أي خلايا ميتة من أحادي الطبقة قبل الشفط. استبدال يوم 1-2 التمايز وسائل الإعلام.
  3. في يوم 3، وخلايا الحصاد لالتدفق الخلوي. إذا كانت الخلايا تعبر عن أكثر من 90٪ CXCR4 + / + CD117، انتقل إلى الخطوة 2.4.
  4. في أيام 3 و 5، ويهز بلطف لوحة لإزالة أي خلايا ميتة من أحادي الطبقة قبل الشفط. استبدال يوم 3-5 التمايز وسائل الإعلام.
  5. في أيام 6 و 7، مع استبدال يوم 6-7 التمايز وسائل الإعلام.
  6. في أيام 8 و 10 و 12، مع استبدال يوم 12/8 التمايز وسائل الإعلام.
  7. في يوم 13، وخلايا الحصاد لالتدفق الخلوي لتحديد PDX1 والتعبير NKX6-1.

3. خلايا حصاد لتحليل التدفق الخلوي

  1. فصل الخلايا مع1X حل التربسين التجاري وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
  2. إزالة الحل التربسين التجاري و resuspend الخلايا وحيدة في 1000 ميكرولتر FACS العازلة مع 30 ميكرولتر الدناز أولا
  3. تصفية الخلايا باستخدام 35 ميكرومتر شبكة النايلون مصفاة خلية ونقلها إلى أنبوب microcentrifuge.
  4. خلايا الطرد المركزي في 455 x ج لمدة 5 دقائق. إعداد الخلايا إما تلطيخ حية أو الثابتة.

4. تلطيخ لالتدفق الخلوي

  1. تدفق استعدادا لتلطيخ العيش في اليوم 3
    1. Resuspend الخلايا في 1000 ميكرولتر FACS العازلة. نقل 200 ميكرولتر (حوالي 1-3 × 10 5 خلايا) في بئرين من لوحة 96-جيدا (للعينات غير ملوثين والملون).
    2. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 931 x ج لمدة 2 دقيقة. إزالة طاف بواسطة قلب اللوحة.
    3. وصمة عار مع الأجسام المضادة الأولية مترافق، CXCR4: APC وCD117: PE (انظر M المقيدين الجدول) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بعيدا عن الضوء.
    4. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 931 x ج لمدة 2 دقيقة. إزالة طاف بواسطة قلب اللوحة.
    5. عينات resuspend في 100 ميكرولتر FACS العازلة.
    6. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 931 x ج لمدة 2 دقيقة. إزالة طاف بواسطة قلب اللوحة.
    7. resuspend كل عينة ونقل في إجمالي حجم 300-500 ميكرولتر FACS العازلة إلى 1 مل أنابيب اختبار صغيرة أو 5 مل أنابيب جولة القاع.
    8. عينات تعمل على قياس التدفق الخلوي 17. إذا لا يمكن تشغيل عينات على الفور، وتخزين عند 4 درجات مئوية محمية من الضوء.
  2. تدفق استعدادا لتلطيخ الثابتة في يوم 13
    1. resuspend الكرية خلية في التجاري الحل تثبيت / permeabilization لمدة 24 ساعة في 4 درجات مئوية.
    2. الطرد المركزي العينة في 455 x ج لمدة 5 دقائق. resuspend في 400 ميكرولتر بيرم / غسيل حل.
    3. نقل 200 ميكرولتر من العينة (حوالي 0.5-1 × 10 6 خلايا) إلى TWس آبار لوحة 96-جيدا (من أجل السيطرة مفتش وPDX1 / NKX6-1 تلطيخ). أجهزة الطرد المركزي في 931 x ج لمدة 2 دقيقة.
    4. Resuspend والكريات الخلايا في 100 ميكرولتر بيرم / غسيل محلول يحتوي على مضاد للPDX1 وNKX6-1 أضداد السيطرة الأولية أو نمط إسوي (انظر المواد الجدول). احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    5. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 931 x ج لمدة 2 دقيقة. إزالة طاف بواسطة قلب اللوحة. عينات resuspend في 100 ميكرولتر بيرم / غسيل حل.
    6. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 931 x ج لمدة 2 دقيقة. إزالة طاف بواسطة قلب اللوحة.
    7. Resuspend والعينات في 100 ميكرولتر بيرم / غسيل تحتوي على الأجسام المضادة الثانوية في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة محمية من الضوء.
    8. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 931 x ج لمدة 2 دقيقة. إزالة طاف بواسطة قلب اللوحة.
    9. عينات resuspend في 100 ميكرولتر بيرم / محلول الغسيل.
    10. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 931 x ج لمدة 2 دقيقة. إزالة طاف بواسطة قلب اللوحة.
    11. ممثلأكل خطوة 4.2.9 و4.2.10.
    12. resuspend كل عينة ونقل في إجمالي حجم 300-500 ميكرولتر FACS العازلة إلى 1 مل أنابيب اختبار صغيرة أو 5 مل أنابيب جولة القاع.
    13. عينات تعمل على قياس التدفق الخلوي 17. إذا لا يمكن تشغيل عينات على الفور، وتخزين عند 4 درجات مئوية محمية من الضوء.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

جيل فعال من الأسلاف البنكرياس يعتمد على النمو السليم والحفاظ على خلايا غير متمايزة تليها إضافة دقيقة من الجزيئات يشير محددة خلال بروتوكول التمايز، كما هو موضح في التخطيطي في الشكل 1A. في اليوم 0، وينبغي أن تكون خلايا غير متمايزة 80-95٪ متكدسة ويجب أن يكون المستعمرات حواف محددة (الشكل 1A). خلال المرحلة 1، فإن وسائل الإعلام من المرجح أن تظهر غائم منذ موت الخلايا هو أمر شائع جدا في هذه المرحلة. وبحلول نهاية المرحلة 1،...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

توليد بنجاح NKX6-1 + الأسلاف البنكرياس من hPSCs في المختبر يعتمد على استخدام الثقافات جودة عالية من hPSCs والتمايز الموجهة على التنظيم الدقيق لمسارات الإشارات المحددة التي تحكم مراحل النمو الرئيسية خلال تطوير البنكرياس. على الرغم من أن هذا البروتوكول يمكن أن تستخدم للحث على التعبير القوي من NKX6-1 عبر مجموعة متنوعة من خطوط hPSC كما هو موضح سابقا 3، لضمان جيل NKX6-1 كفاءة وينبغي بذل الاعتبارات التالية. من المهم أن يتم تنفيذ كل خلية ثقافة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

وأيد هذا المخطوط من خلال تمويل من تورونتو العام ومؤسسة الغربية وجائزة الدراسات العليا شبكة الصحة بانتينغ وأفضل للسكري مركز الجامعي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي > الوسائط والسيتوكينات < / قوي >
1-ثيوجلسرين (MTG)سيجماM6145
أكتيفين أآر آند د338-AC / CF   ؛
حمض الأسكوربيكSigmaA4544
B-27 SupplementLife Technologies12587-010   ؛
BD Cytofix / Cytoperm BufferBD Bioscience554722
BD Perm / Wash buffer ، 1xBD Bioscience554723
bFGFR & D233-FB
CHIR990210Tocris4423a
Dulbecco ' s Modified Eagle Medium (DMEM)Life Technologies11995
DNase IVWR80510-412 
DorsomorphinSigmaP5499
EGFR & D236-EG
مصل الأبقار الجنينية (FBS)Wisent88150
FGF10R & D345-FG
الجيلاتين من جلد الخنازيرSigmaG1890
GlutamineLife Technologies25030
NicotinamideSigmaNO636
NOGGINR & D3344-NG
البنسلين / الستربتومايسينلايف تكنولوجيز15070-063
حمض الريتينويكسيجماR2625
RPMI متوسط 1640لايف تكنولوجيز11875
SANT-1Tocris1974
TrypLE Express Enzyme (1x) ، الفينول الأحمرLife Technologies12605-010
<قوي>الاسم<قوي>الشركة Catalogue NumberComments
antibodies لقياس التدفق الخلوي (التخفيفات العاملة)
CD117 PE (1:100)TechnologiesCD11705
CXCR4 APC (1:50)BD  Bioscience551966
الحمار المضاد للفأر IgG (H + L) ، Alexa Fluor 647 Conrupgate (1: 400)Life TechnologiesA-31571
الحمار المضاد للماعز IgG (H + L) ، Alexa Fluor 488 (1: 400)  جاكسون لمختبرات الأبحاث المناعية705-546-147
ماوس التحكم في النمط المتماثل IgG & nbsp ؛ImmunoResearch Laboratories Inc. 015-000-003
التحكم في الماعز IgGR & D   AB-108-C
NKX6-1 (1: 2,000)DSHBF55A10
PDX1 (1: 100)R & دAF2419
Life شركة Jackson

المراجع

  1. Canadian Diabetes Association. , Available from: http://www.diabetes.ca/about-diabetes/types-of-diabetes (2016).
  2. Cogger, K., Nostro, M. C. Recent advances in cell replacement therapies for the treatment of type 1 diabetes. Endocrinology. 156 (1), 8-15 (2015).
  3. Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
  4. Pagliuca, F. W., et al. Generation of Functional Human Pancreatic beta Cells In Vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  5. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. , (2014).
  6. Kroon, E., et al. Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nat Biotechnol. 26 (4), 443-452 (2008).
  7. Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
  8. D'Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nat Biotechnol. 23 (12), 1534-1541 (2005).
  9. Gouon-Evans, V., et al. BMP-4 is required for hepatic specification of mouse embryonic stem cell-derived definitive endoderm. Nat Biotechnol. 24 (11), 1402-1411 (2006).
  10. Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).
  11. Pan, F. C., Wright, C. Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland. Dev Dyn. 240 (3), 530-565 (2011).
  12. Schaffer, A. E., Freude, K. K., Nelson, S. B., Sander, M. Nkx6 transcription factors and Ptf1a function as antagonistic lineage determinants in multipotent pancreatic progenitors. Dev Cell. 18 (6), 1022-1029 (2010).
  13. Zhou, Q., et al. A multipotent progenitor domain guides pancreatic organogenesis. Dev Cell. 13 (1), 103-114 (2007).
  14. Sander, M., et al. Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas. Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).
  15. Sharow, K. A., Temkin, B., Asson-Batres, M. A. Retinoic acid stability in stem cell cultures. Int J Dev Biol. 56 (4), 273-278 (2012).
  16. Korytnikov, R., Nostro, M. C. Generation of polyhormonal and multipotent pancreatic progenitor lineages from human pluripotent stem cells. Methods. , 56-64 (2016).
  17. Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
  18. Nostro, M. C., et al. Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells. Development. 138 (5), 861-871 (2011).
  19. Schulz, T. C., et al. A scalable system for production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells. PLoS One. 7 (5), e37004(2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تعبير NKX6-1قياس التدفق الخلويالأديم الباطن النهائيبروتوكول التمايزعلامات PDX1الخلايا الجذعية الجنينية البشريةزراعة الخلاياالفئران ناقصة المناعة
التمايز كفاءة الخلايا الجذعية المحفزة لNKX6-1
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.