مقالة منهجية

بين الخلايا تلطيخ والتدفق الخلوي لتحديد الخلايا الليمفاوية مجموعات فرعية ضمن الفئران الأورطي، الكلى والغدد الليمفاوية في نموذج من ارتفاع ضغط الدم

DOI:

10.3791/55266

⸱

يناير 28, 2017

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt University Medical Center, 2Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University, 3Department of Pharmacology and Toxicology, Faculty of Pharmacy, Mansoura University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتنص هذه المادة منهجية مفصلة لتحديد وقياس وظيفية فرعية T اللمفاوية موجودة داخل الكلى الفئران، الشريان الأورطي والغدد الليمفاوية عن طريق تلطيخ الخلايا والتدفق الخلوي. وقد تم اختيار نموذج أنجيوتنسين الثاني وارتفاع ضغط الدم الناجم عن لشرح، خطوة بخطوة، والإجراءات والمبادئ الأساسية للالتدفق الخلوي وتلطيخ الخلايا.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = 'jove_content'>من المعروف الآن أن الخلايا الليمفاوية التائية تلعب دورا مهما في تطور العديد من أمراض القلب والأوعية الدموية1،2،3،4،5. على سبيل المثال ، أظهرت الدراسات التي أجريت من مجموعتنا أن ارتفاع ضغط الدم يرتبط بالتراكم المفرط للخلايا التائية في الأوعية الدموية والكلى أثناء تطور ارتفاع ضغط الدمالتجريبي 6. بمجرد دخولها إلى هذه الأنسجة ، تنتج الخلايا التائية العديد من السيتوكينات التي تؤثر على كل من وظيفة الأوعية الدموية والكلى مما يؤدي إلى تضيق الأوعية واحتباس الصوديوم والماء1،2. لفهم كيفية تسبب الخلايا التائية لأمراض القلب والأوعية الدموية والكلى بشكل كامل ، من المهم أن تكون قادرا على تحديد وتحديد مجموعات فرعية محددة من الخلايا التائية الموجودة في هذه الأنسجة. يتم تعريف المجموعات الفرعية للخلايا التائية من خلال مجموعة من علامات السطح ، والسيتوكينات التي تفرزها ، وعوامل النسخ التي تعبر عنها. يجعل تعقيد مجموعة الخلايا التائية قياس التدفق الخلوي والتلوين داخل الخلايا تقنية لا تقدر بثمن لتشريح الأنماط الظاهرية للخلايا الليمفاوية الموجودة في الأنسجة. هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لتحديد العلامات السطحية وداخل الخلايا (السيتوكينات وعوامل النسخ) في الخلايا التائية المعزولة من الكلى والشريان الأورطي والغدد الليمفاوية التي تستنزف الأبهر في نموذج لارتفاع ضغط الدم الناجم عن الأنجيوتنسين II. يتم وصف الخطوات التالية بالتفصيل: عزل الأنسجة ، وتوليد معلقات الخلية المفردة ، والتحفيز خارج الجسم الحي ، والتثبيت ، والنفاذية ، والتلوين. بالإضافة إلى ذلك ، تمت مناقشة العديد من المبادئ الأساسية لتحليلات قياس التدفق الخلوي بما في ذلك اختيار الضوابط المناسبة واستراتيجيات البوابات المناسبة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتفيد أحدث البيانات أن نظام المناعة على التكيف، وخاصة الخلايا الليمفاوية T، تلعب دورا حاسما في تطوير العديد من الأمراض القلبية الوعائية 1،2،3،4،5. على سبيل المثال، في نموذج أنجيوتنسين الثاني وارتفاع ضغط الدم الناجم، وقد وصفت تراكم خلايا T في الأوعية والكلى من الفئران 6. تراكم الأوعية الدموية في الغالب في البرانية والدهون ماحول الأوعية. في الكلى، وخلايا T تتراكم في كل من النخاع والقشرة الكلوية. اعتمادا على مجموعة فرعية تشارك هذه الخلايا T تثير السيتوكينات المختلفة التي يمكن أن تؤثر على وظيفة الأوعية الدموية والكلى ويؤدي إلى تطوير علم الأمراض (التي استعرضتها ماكماستر وآخرون. 6).

ويمكن تقسيم CD4 + T الخلايا الليمفاوية المساعدة إلى عدة مجموعات فرعية: T المساعد 1 (TH1)، TH2، Th9، Th17، Th22، تي التنظيمية (Treg) الخلايا، وتي المساعد الجريبي (مرفأ تونس المالي) الخلايا استنادا مهامهم وخلوي توقيعkines 7. وبالمثل، خلايا CD8 + التائية السامة يمكن أن تصنف على أنها TC1، TC2، Tc17 أو Tc9 8. وهناك أيضا مزدوجة خلايا T السلبية (أي الخلايا التي لا تعبر عن CD4 أو علامات الخلية التائية CD8). مجموعة فرعية من هذه الخلايا تمتلك لجاما دلتا مستقبلات الخلايا التائية البديل (بدلا من الكلاسيكية ألفا ومستقبلات بيتا)، وبالتالي يشار اليها على أنها جاما دلتا خلايا تي. تحليل متعددة المعلمة بواسطة التدفق الخلوي من علامة السطح، خلوى وعامل النسخ يشكل أفضل نهج لتحديد هذه الخلايا. على الرغم من أن استخدام هذا الأسلوب على نطاق واسع في مجال علم المناعة، فإنه يوصف بشكل أقل في الأجهزة الصلبة وفي تحديد أمراض القلب والأوعية الدموية.

تاريخيا، وتحديد الخلايا الليمفاوية في الأنسجة اقتصر على المناعية أو النهج RT-PCR. على الرغم من أن المناعية والمناعي وطرق قوية لتحديد توزيع الأنسجة من مستضد من كثافة العملياتerest، فهي غير كافية لتحديد النمط الظاهري المجموعات الفرعية المعنية. وبالإضافة إلى ذلك، في حين أن تحليل RT-PCR هو مفيد للكشف عن التعبير مرنا من المستضدات، السيتوكينات أو عوامل النسخ، فإنه لا يسمح للكشف عن البروتينات متعددة في وقت واحد على مستوى الخلايا الفردية.

ظهور التدفق الخلوي، وخصوصا عندما يقترن تلطيخ الخلايا للكشف عن السيتوكينات وعوامل النسخ، ويقدم المحققون مع تقنية قوية تسمح بتحديد وتقدير على مستوى خلية واحدة من مجموعات فرعية الخلايا المناعية في الأعضاء الصلبة. لقد الأمثل مقايسة تلطيخ الخلايا لتحديد التدفق الخلوي مجموعات فرعية الخلايا التائية الكبرى موجودة داخل الكلى الفئران، الشريان الأورطي والشريان الأبهر تصريف الغدد الليمفاوية في نموذج للأنجيوتنسين الثاني وارتفاع ضغط الدم الناجم. الاستفادة المثلى من كل خطوة: الهضم الأنسجة، خارج الحي التنشيط، permeabilization، والسطحية والنتائج تلطيخ الخلايا في إعادة للغايةفحص producible التي يمكن تطبيقها على نماذج مرض القلب والأوعية الدموية والكلى أخرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وافقت لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي جامعة فاندربيلت الإجراءات الموضحة في هذه الوثيقة. ويعيش الفئران ويعتني به وفقا لدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (مطبعة الأكاديميات القومية. المنقحة 2010).

1. عزل من الأورطي تصريف الغدد الليمفاوية، الكلى والشريان الأورطي من الفئران

  1. الموت ببطء الفئران عن طريق CO 2 الاستنشاق. رش الصدر مع 70٪ من الإيثانول وفتح بعناية الجلد وجدار الصدر مع مقص لفضح القلب.
  2. ليروي الأوعية الدموية، إجراء شق صغير في الأذين الأيمن وحقن بثبات لا يقل عن 10 مل من البرد PBS (حوالي 1 مل / ثانية) في قمة البطين الأيسر باستخدام 21 أو 23 G إبرة. يروي حتى المقشر جميع الأجهزة. قلب يبيض أولا. ابيضاض الكبد يدل على أن نضح تم أداء جيدا.
  3. باستخدام ملقط صغير ومقص غرامة، وقطع بلطف بعيدا وسحب الأمعاء،المعدة والطحال والبنكرياس والكبد لتصور أفضل الشريان الأورطي.
    ملاحظة: هذه الخطوة لابد من القيام به على وجه التحديد للغاية حيث الأضرار التي لحقت الجهاز الهضمي يمكن أن تحفز التلوث.
  4. قطع وإزالة كل الرئة مع مقص. شطف تجويف الصدر مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) باستخدام حقنة needleless. إزالة الدم الزائد والسوائل باستخدام شاش معقم.
  5. إزالة الأورطي الغدد الليمفاوية استنزاف البطن باستخدام ملقط تشريح غرامة. تأكد من عدم تمزق الكبسولة. إزالة الدهون المتبقية على سطح كل العقدة الليمفاوية مع ملقط تشريح. قطع الكليتين مع مقص غرامة.
  6. تشريح الشريان الأورطي بأكمله (الشريان الأورطي الصدري والبطن) مع غرامة مقص منحني. تبدأ على مستوى القلب وتشريح بعناية بعيدا عن المريء وفقرات وصولا الى مستوى التشعب الحرقفي والتأكد من الحفاظ على الدهون ماحول الأوعية المحيطة تعلق على الشريان الأورطي.
    ملاحظة: مزيد من تشريح الشريان الأورطي إلى ريمولقد الهياكل المحيطة بها ويمكن أن يتم تحت المجهر. على وجه التحديد، وإزالة الفروع الشريانية (الشرايين السباتية، الشرايين تحت الترقوة، الاضطرابات الهضمية، المساريقي، والشرايين الكلوية) والغدد الليمفاوية. لا تبقي طبقة ثابتة من الدهون ماحول الأوعية حول كل الشريان الأورطي لأن هذا هو موقع حيث توجد العديد من الخلايا الالتهابية في حالة ارتفاع ضغط الدم. ضع كل الأنسجة في أنابيب منفصلة تحتوي على برنامج تلفزيوني الباردة.

2. توليد تعليق خلية واحدة من كل الأنسجة

  1. الكلى
    ملاحظة: يمكن فصلها الكلى في تعليق خلية واحدة من خلال الجمع بين التفكك الميكانيكية بالإضافة إلى الهضم الأنزيمي.
    1. إعداد الحل الهضم الكلى عن طريق إضافة كولاجيناز D (2 ملغ / مل)، والدناز الأول (100 ميكروغرام / مل) إلى المتوسط ​​1640 RPMI (تستكمل مع 5٪ مصل بقري جنيني (FBS)). إعداد 10 مل لكل عينة الكلى.
    2. استخدام ملقط لنقل الكليتين في أنبوب تفارق تحتوي على 10 مل من الكلى الهضمحل أيون.
    3. أداء التفكك الميكانيكي باستخدام جهاز الآلي شبه dissociator وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    4. بعد تفكك الميكانيكية، وفصل أنبوب من الجهاز وتنفيذ عملية الهضم الأنزيمي. احتضان هذه العينات لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية تحت دوران مستمر. على الفور وقف عملية الهضم الأنزيمي بإضافة البارد المتوسط ​​1640 RPMI تستكمل مع 5٪ FBS.
    5. نقل الحل من قبل pipetting إلى 50 مل أنبوب مخروطي بعد تصفية من خلال مصفاة 40 ميكرون. ندف الأنسجة المتبقية بعيدا عن طريق الضغط مع المكبس من حقنة 1 مل. بيليه الخلايا (500 x ج، 8 دقائق، 4 درجة مئوية).
    6. resuspend الكرية إلى 3 مل من 36٪ كثافة التدرج وسائل الإعلام الطرد المركزي. نقل تعليق في أنبوب مخروطي 15 مل. إضافة بلطف 3 مل من 72٪ سائل الإعلام التدرج الكثافة الطرد المركزي تحت تعليق خلية 3 مل 36٪ من دون أي انقطاع. أجهزة الطرد المركزي (1000 x ج من دون فرامل، 20 دقيقة، 4 درجات مئوية).
    7. سوف يكون موجودا في الخلايا المناعية في واجهة. إزالة أعلى طبقة صفراء تحتوي على الحطام الخلوي وثم جعل حجم ما يصل الى 15 مل باستخدام برنامج تلفزيوني الباردة. يهز جيدا إلى انهيار التدرج. تدور الخلايا (300 x ج، 8 دقائق، 4 ° C) و resuspend بيليه في 3 مل من RPMI مع FBS 5٪. حساب عدد الخلايا الحية على عدادة الكريات باستخدام التريبان الأزرق الاستبعاد.
  2. الشريان الأبهر
    1. إعداد الحل الهضم الأبهر عن طريق إضافة كولاجيناز ألف (1 ملغ / مل)، كولاجيناز B (1 ملغ / مل)، والدناز الأول (100 ميكروغرام / مل) إلى المتوسط ​​1640 RPMI (تستكمل مع 5٪ FBS).
    2. باستخدام ملقط غرامة، ونقل الشريان الأورطي في أنبوب 2 مل تحتوي على 1 مل من محلول الشريان الأورطي الهضم. تخطر على الشريان الأورطي كله إلى قطع صغيرة جدا مع مقص الجميلة في حل الهضم 1 مل. الحفاظ على الجليد. احتضان هذه العينات لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية تحت دوران مستمر.
    3. نقل الحل على طبق زراعة الأنسجة ووقف enzymaالهضم عرة بإضافة 5 أضعاف حجم RPMI الباردة مع 5٪ FBS.
    4. نقل الحل من قبل pipetting إلى 50 مل أنبوب مخروطي بعد تصفية من خلال مصفاة 40 ميكرون. ندف الأنسجة المتبقية بعيدا في تعليق وحيد الخلية عن طريق الضغط مع المكبس من حقنة 1 مل. تدفق مصفاة وبيليه الخلايا (300 x ج، 8 دقائق، 4 درجة مئوية).
    5. يغسل بيليه بإضافة 10 مل من RPMI مع FBS 5٪. تدور الخلايا (300 x ج، 8 دقائق، 4 ° C) و resuspend بيليه في 3 مل من RPMI مع FBS 5٪. حساب عدد الخلايا الحية على عدادة الكريات باستخدام التريبان الأزرق الاستبعاد.
  3. والأبهر تصريف الغدد الليمفاوية
    1. وضع مصفاة 40 ميكرومتر في طبق زراعة الأنسجة (60 ملم × 15 ملم). وضع الغدد الليمفاوية على مصفاة وندف بينهما في تعليق وحيد الخلية عن طريق الضغط مع المكبس من حقنة 1 مل. تدفق مصفاة مع 2 مل من RPMI مع FBS 5٪. جمع الخلايا في الطبق.
    2. تحويلخلايا في أنبوب الصقر 15 مل وبيليه الخلايا (300 x ج، 8 دقائق، 4 درجة مئوية). Resuspend وبيليه في 500 ميكرولتر من RPMI مع FBS 5٪. حساب عدد الخلايا الحية على عدادة الكريات باستخدام التريبان الأزرق الاستبعاد.

3. فيفو السابقين تحفيز للكشف خلوى بواسطة التدفق الخلوي

  1. إعداد وسائل الإعلام ثقافة الخلية: RPMI مع FBS 5٪، 0.1 ملم من الأحماض الأمينية غير الأساسية، 50 ميكرومتر β-المركابتويثانول و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين.
  2. أجهزة الطرد المركزي كل تعليق خلية تم الحصول عليها من الكلى، الشريان الأورطي والغدد الليمفاوية (300 x ج، 8 دقائق، 4 درجة مئوية). resuspend كل بيليه مع وسائل الإعلام ثقافة الخلية بتركيز 1 × 10 6 خلايا لكل مل.
  3. تحفيز الخلايا عن طريق إضافة 2 ميكرولتر من الكوكتيل تنشيط الخلايا (التي تحتوي على Phorbol 12 ميريستيت 13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية)، وionomycin حامل الأيون الكالسيوم، والمانع جولجي Brefeldin أ) لكل 1 مل من ثقافة الخلية.
    ملاحظة: التركيز النهائيالصورة من كل مكون و: 81 نانومتر من سلطة النقد الفلسطينية، 1.33 ميكرومتر من ionomycin و 5 ميكروغرام / مل من Brefeldin A. المعاملة مع سلطة النقد الفلسطينية وionomycin ينشط الخلايا لإنتاج السيتوكينات. تفرز السيتوكينات البروتينات التي يجب أن المحاصرين في الخلايا ليتم الكشف. Brefeldin ويتسبب في تراكم البروتينات يفرز عادة في أجهزة شبكية وجولجي اندوبلازمية. وهكذا، فإن تقنية الموضحة هنا يعزز الكشف عن الخلايا الليمفاوية المنتجة للخلوى بواسطة التدفق الخلوي.
  4. لوحة 1-2000000 الخلايا في 12 كذلك (الشريان الأورطي أو الكلى) أو 24-جيدا (العقدة الليمفاوية) لوحات-الالتزام المنخفض. وضع لوحة في 37 درجة مئوية ترطيب CO 2 الحاضنة لمدة 3 ساعة.
    ملاحظة: قد يكون عدد الخلايا مطلي أقل في الغدد الليمفاوية من السيطرة على الفئران. أيضا، فإن الوقت من التحفيز لابد من تحديد تجريبيا لكل سكان الخلية وخلوى دراستها. في حالة الخلايا T معزولة من الشريان الأورطي، الكلى أو الغدد الليمفاوية، ونحن نوصي تحفيز لمدة 3 إلى 4 ساعات. أطول التحفيز ثسوء لا يزيد من إفراز السيتوكينات وسوف تحفز على downregulation مزيد من العديد من علامات سطح الخلية التائية مثل CD3، CD4 و CD8. (لاحظ أنه حتى التحفيز 3-4 ساعة من شأنها أن تحفز بعض downregulation من هذه العلامات.)

تلطيخ 4. السطح

  1. نقل الخلايا في أنبوب البوليسترين FACS وأجهزة الطرد المركزي (300 x ج، 8 دقائق، 4 درجة مئوية). غسل الخلايا مرتين مع العازلة FACS (الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ + مجانا برنامج تلفزيوني يحتوي على 4٪ FBS و2mm و EDTA) وتقسيم الخلية تعليق على قدم المساواة في أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية المختلفة استنادا إلى عدد من لوحات الأجسام المضادة المطلوبة وعدد من أنابيب السيطرة الحاجة ( انظر أدناه).
  2. لأداء التعويض عن كل لوحة، وإعداد أنابيب تحكم غير ملوثين وأنابيب الملون واحدة لكل نوع الأنسجة ولوحة الأجسام المضادة. وبالإضافة إلى ذلك، وإعداد أنابيب تحكم مضان ناقص واحد (FMO) لكل لوحة الضد بإضافة لكن كل واحد من الأجسام المضادة.
  3. ضبط مستوى الصوت من كل أنبوب إلى 2 مل مع نظام مراقبة الأصول الميدانيةمتعادل. الطرد المركزي تعليق خلية (300 x ج، 8 دقائق، 4 ° C)، وإزالة طاف وكتلة التيسير مستقبلات التي يحتضنها الخلايا مع 0.5 ميكروغرام من الأجسام المضادة لمكافحة CD16 / CD32 لكل مليون خلايا لمدة 10 دقيقة على الجليد.
    ملاحظة: CD16 منخفضة تقارب مفتش التيسير مستقبلات الثالث (FCR الثالث) وCD32 هو FCR الثاني. يتم التعبير عن CD16 / CD32 على المحببة، الخلايا البدينة، وحيدات / الضامة، الخلايا القاتلة الطبيعية، الخلايا البائية، والخلايا الجذعية وبعض خلايا ناضجة تي تفعيلها.
  4. أداء الجدوى تلطيخ: غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1X، الطرد المركزي (300 x ج، 8 دقائق، 4 ° C) و resuspend في 1000 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X. إضافة 1 ميكرولتر من-أمين رد الفعل صبغ (الملاءمة وصمة عار) خلايا impermeant. احتضان لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية محمية من الضوء.
  5. أثناء الحضانة، وإعداد مزيج من الأجسام المضادة (لتلطيخ السطح) في حجم مناسب من العازلة FACS. غسل الخلايا مرتين مع 1-2 مل من FACS العازلة، الطرد المركزي (300 x ج، 8 دقائق، 4 ° C) و resuspend كل بيليه مع 100 ميكرولترمن خليط الأضداد. احتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية محمية من الضوء.
    ملاحظة: للحصول على كل التدفق الخلوي الأجسام المضادة، فإنه من المفيد لتحديد المبلغ الأمثل من الأجسام المضادة اللازمة عن طريق إجراء منحنى الجرعة المعايرة.
  6. غسل الخلايا مرتين مع 2 مل من العازلة FACS وبيليه الخلايا (300 x ج، 8 دقائق، 4 درجة مئوية).

5. التثبيت، Permeabilization وبين الخلايا تلطيخ

  1. أداء تلطيخ الخلايا مع مجموعة التثبيت وpermeabilization تحتوي على مخازن مناسبة باتباع إرشادات الشركة المصنعة. إصلاح وpermeabilize الخلايا عن طريق إعادة التعليق عليها في العازلة المناسبة. احتضان العينات لمدة 40 دقيقة في 4 درجات مئوية محمية من الضوء.
  2. إضافة 1 مل من 1X permeabilization وغسل العازلة مباشرة إلى الخلايا الثابتة وpermeabilized. أجهزة الطرد المركزي (500 x ج، 8 دقائق، 4 ° C) وإزالة طاف. Resuspend وبيليه مع 2 مل من 1X العازلة يغسل.
  3. إعداد خليط من antibodies (لتلطيخ الخلايا فقط) في حجم مناسب من غسل العازلة 1X (عادة 100 ميكرولتر في الأنبوب).
    ملاحظة: كما هو موضح أعلاه، يجب أن يتم تحديدها لكل الأجسام المضادة في لوحة تركيز الأجسام المضادة الأمثل. على سبيل المثال، عن الأجسام المضادة لIL-17A أو IL-17F، ونحن نستخدم عامل التخفيف من 01:30، ولكن لأجسام مضادة لIFNγ وتي الرهان، ونحن نستخدم عامل التخفيف من 1: 100.
  4. الطرد المركزي الخلايا (500 x ج، 8 دقائق، 4 ° C) و resuspend كل بيليه مع 100 ميكرولتر من خليط الأضداد. احتضان لمدة 40 دقيقة في 4 درجات مئوية محمية من الضوء.
  5. غسل الخلايا مرتين مع 2 مل من غسل العازلة 1X و بيليه الخلايا (500 x ج، 8 دقائق، 4 درجة مئوية). resuspend الكرية مع 300 ميكرولتر من غسل العازلة 1X وتحليل على تدفق عداد الكريات مع الفلاتر المناسبة.
  6. لالكمي من العدد الكلي للخلايا لكل عينة الأنسجة، واستخدام الخرز العد. قبل الشراء، إضافة أوصى حجم / عدد من عد حبات لكل أنبوب.

6. التعويض، المحاصرة، التطبيع، ونصائح

  1. التعويض والمحاصرة
    1. تشغيل أنابيب التحكم الملون غير ملوثين واحدة للحصول على تعويضات لضبط التداخل الطيفي.
      ملاحظة: إن استخدام حبات التعويض بدلا من ضوابط التعويض على أساس خلية ضروري في الحالات التي يكون فيها مستضد من الفائدة أو السكان الخلية في عينة موجود في مثل هذه المستويات المنخفضة التي التعويض باستخدام خلايا سيكون صعبا. ومن الجدير ذكره أنه عند استخدام الأصباغ جنبا إلى جنب، فإنه من المستحسن لإعداد التعويضات لكل تجربة منذ الأصباغ جنبا إلى جنب تختلف في الكثير إلى الكثير ومع كل يوم.
    2. تشغيل مضان ناقص واحد الضوابط (FMOs) لجميع fluorophores في لوحة عند بدء التجربة متعدد الألوان الجديدة.
      ملاحظة: ضوابط FMO هي العينات التي تحتوي على جميع الأجسام المضادة في لوحة باستثناء واحد. تسمح هذه الضوابط التمييز الدقيق للإيجابية مقابل إشارات سلبية على الضد أغفل موقف قابل للتعديل بشكل صحيحر البوابات. هذه الضوابط هي ذات أهمية خاصة عند مستويات التعبير منخفضة أو عند فصل السكان المستهدفين من الفقراء (على سبيل المثال، عندما يكون الهدف هو خلوى أو عامل النسخ). وإن لم يكن ذلك ضروريا دائما، في بعض الحالات، والضوابط نمط إسوي قد يكون من المفضل في مكان تسيطر FMO لأنها توفر التعويض المناسب لنمط إسوي الأجسام المضادة والمترافقة fluorophore دون خصوصية للمستضد.
    3. إعداد البوابة الرئيسية: ضبط الأمام مبعثر المنطقة (FSC-A) والجانب مبعثر منطقة (SSC-A) الجهد من أجل الكشف عن السكان الكريات البيض.
    4. استبعاد الخلايا الميتة.
      ملاحظة: وصمة عار الجدوى يتفاعل مع الأمينات الحرة الموجودة على كل سطح وداخل الخلايا. وعلى النقيض من العيش الخلايا والخلايا الميتة (مع الأغشية خطر) تسمح للصبغ للدخول في السيتوبلازم، وزيادة كمية من وضع العلامات البروتين. وهكذا، فإن الخلايا الميتة يكون أكثر إشراقا من الخلايا الحية مما يتيح التمييز سهلا. بوابة على الهواء مباشرةالخلايا.
      ملاحظة: صلاحية تعليق خلية من الشريان الأورطي والكلى قد يكون أقل من صلاحية تعليق خلية من الغدد الليمفاوية ويرجع ذلك إلى خطوة عملية الهضم إضافية.
    5. مؤامرة الأمام مبعثر المنطقة (FSC-A) [ص المحور] وإلى الأمام مبعثر الطول (FSC-H) [محور س]. تظهر SINGLETS كما قطري على هذه مؤامرة نقطة. البوابة على هذا قطري لاستبعاد الحلل. ثم رسم SSC-A [العمودي] وCD45 [محور س].
    6. وCD45 + الكريات البيض السكان يمكن التعرف عليها بسهولة. البوابة على هذه الفئة من السكان. يمكن التعرف على السكان لاحق من هذه الفئة من السكان.
  2. تطبيع عدد الخلايا
    1. عد حبات لها خصائص التي تؤدي إلى انخفاض SSC FSC وعالية. على سبيل المثال، إذا تم إضافة 50،000 الخرز في 300 ميكرولتر من تعليق خلية واحدة، المعادلة لحساب عدد المطلق لأي تعطي نوع من الخلايا في الأنبوب هو على النحو التالي:
      عدد الخلايا صأنبوب إيه = (50000 / عدد حبات تحسب من قياس التدفق الخلوي) × عدد الخلايا فرزها.
      باستخدام هذا الحساب، يمكن تحديد العدد المطلق من أي نوع خلية معينة في أنبوب. واستنادا إلى كم من الانابيب تم إنشاؤها من كل جهاز، ويمكن حساب عدد الخلايا في الجهاز.
      ملاحظة: احفظ جميع الخلايا والكواشف في 4 درجات مئوية خلال البروتوكول. تجنب vortexing لقوي لأنها يمكن أن تتلف الخلايا. استخدام الحد الأدنى من القوات لخلايا بيليه. تجنب الوقوع في فقاعات في أنبوب FACS لأنها يمكن أن تتسبب في موت الخلايا. لا تدع الكريات تجف في أي وقت.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وصف بروتوكول تصاريح تحديد سطح وداخل الخلايا علامات في الخلايا التائية معزولة عن الكلى الفئران، الشريان الأورطي والشريان الأبهر تصريف الغدد الليمفاوية في نموذج للأنجيوتنسين الثاني وارتفاع ضغط الدم الناجم. يتم عرض نتائج ممثل أدناه.

يوضح الشكل (1) استراتيجية النابضة تستخدم لتحديد السكان الخلايا التائية في تعليق خلية واحدة أعدت من الشر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تحسين البروتوكول الموضح هنا لتحديد المجموعات الفرعية للخلايا التائية الموجودة داخل كلى الفئران والشريان الأورطي والغدد الليمفاوية. يمكن تكييف هذا البروتوكول بسهولة لفحص مجموعات فرعية أخرى من الخلايا المناعية مثل الخلايا الليمفاوية البائية والخلايا المناعية الفطرية ويمكن تعديله ليشمل أنواعا أخرى من الأنسجة. تعد خطوة الهضم أمرا بالغ الأهمية ويجب تعديلها وتحسينها لكل نسيج9. يمكن أن تؤثر خطوة الهضم المطولة أو استخدام إنزيم غير مناسب على استقرار تعبير المستضد. وبالمثل ، يمكن أن يؤثر الهضم غير المكتمل على النتائج...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويدعم MSM عن طريق منحة من علوم القلب والأوعية الدموية جلعاد.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من قبل على جائزة القلب الأمريكية جمعية زمالة (16POST29950007) إلى فلوريدا، منحة التدريب من المعاهد الوطنية للصحة (NIH T32 HL069765) إلى بناية، وهي جائزة جمعية زمالة القلب الأمريكية (14POST20420025) لMA صالح، والمعاهد الوطنية للصحة جائزة K08 (HL121671) لسوق مسقط. ويدعم MSM أيضا منحة بحثية من العلوم جلعاد، وشركة

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
كولاجيناز ديروش11088882001
كولاجيناز أروش10103586001
كولاجيناز بروش11088815001
دناسيروش10104159001
1x عازلة تحلل خلايا الدم الحمراءeBioscience00-4333-57
RPMI متوسط 1614 1xجيبكو11835-030
DPBS بدون الكالسيوم والمغنيسيومGibco14190-144
PercollGE Healthcare17-5445-02للطرد المركزي المتدرج للكثافة
GentleMACS & trade ؛ أنبوب CMiltenyi Biotec130-096-334
جهاز فصل GentleMACSMiltenyi Biotec130-093-235استخدم البرنامج SPLEEN_04
كوكتيل تنشيط الخلية (مع Brefeldin A)Biolegend423303
anti-CD16 / 32eBioscience14-0161-81تخفيف 1:100
LIVE / DEAD طقم بقع الخلايا الميتة البنفسجي القابل للإصلاحLife TechnologiesL34955
مجموعة المخزن المؤقت لعامل النسخBD Pharmingen562725
OneComp eBeads eBioscience01-1111-42
123 عدد eBeadseBioscience01-1234-42
CD45 AmCyan (استنساخ 30-F11) BioLegend103138
CD3 PerCP-Cy5.5 (استنساخ 17A2)BioLegend100218
IL-17A FITC (استنساخ TC11-18H10.1) BioLegend506910
IL-17F APC (استنساخ 9D3.1C8)BioLegend517004
CD4 APC-Cy7 (استنساخ GK1.5) BDBiosciences560181
CD8 APC (استنساخ 53-67)eBioscience17-0081-82
T-bet PE-Cy7 (استنساخ 4B10)BioLegend644823
IFN & gamma ؛ FITC (استنساخ XMG1.2) BDBiosciences557724

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Saleh, M. A., McMaster, W. G., Wu, J., et al. Lymphocyte adaptor protein LNK deficiency exacerbates hypertension and end-organ inflammation. J Clin Invest. 125 (3), 1189-1202 (2015).
  2. Madhur, M. S., Lob, H. E., McCann, L. A., et al. Interleukin 17 promotes angiotensin II-induced hypertension and vascular dysfunction. Hypertension. 55 (2), 500-507 (2010).
  3. Laroumanie, F., Douin-Echinard, V., Pozzo, J., et al. CD4+ T Cells Promote the Transition From Hypertrophy to Heart Failure During Chronic Pressure Overload. Circulation. 129 (21), 2111-2124 (2014).
  4. Guzik, T. J., Hoch, N. E., Brown, K. A., et al. Role of the T cell in the genesis of angiotensin II induced hypertension and vascular dysfunction. J Exp Med. 204 (10), 2449-2460 (2007).
  5. Ketelhuth, D. F. J., Hansson, G. K. Adaptive Response of T and B Cells in Atherosclerosis. Circ Res. 118 (4), 668-678 (2016).
  6. McMaster, W. G., Kirabo, A., Madhur, M. S., Harrison, D. G. Inflammation, Immunity, and Hypertensive End-Organ Damage. Circ Res. (6), 1022-1033 (2015).
  7. Luckheeram, R. V., Zhou, R., Verma, A. D., et al. CD4+T Cells: Differentiation and Functions. Clin Dev Immunol. 2012, 1-12 (2012).
  8. Mittrücker, H. -W., Visekruna, A., Huber, M. Heterogeneity in the differentiation and function of CD8+ T cells. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 62 (6), 449-458 (2014).
  9. Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2 (2), 112-120 (2012).
  10. Finak, G., Langweiler, M., Jaimes, M., et al. Standardizing Flow Cytometry Immunophenotyping Analysis from the Human ImmunoPhenotyping Consortium. Sci Rep. 6, 20686(2016).
  11. Herzenberg, L. A., Parks, D., Sahaf, B., Perez, O., Roederer, M., Herzenberg, L. A. The history and future of the fluorescence activated cell sorter and flow cytometry: a view from Stanford. Clin Chem. 48 (10), 1819-1827 (2002).
  12. Hrvatin, S., Deng, F., O'Donnell, C. W., Gifford, D. K., Melton, D. A. MARIS: method for analyzing RNA following intracellular sorting. PLoS One. 9 (3), 89459(2014).
  13. Kalisky, T., Quake, S. R. Single-cell genomics. Nat Methods. 8 (4), 311-314 (2011).
  14. Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Cytometry: Today's technology and tomorrow's horizons. Methods. 57 (3), 251-258 (2012).
  15. Jiang, L., Tixeira, R., Caruso, S., et al. Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry. Nat Protoc. 11 (4), 655-663 (2016).
  16. Lemoine, S., Jaron, B., Tabka, S., et al. Dectin-1 activation unlocks IL12A expression and reveals the TH1 potency of neonatal dendritic cells. J Allergy Clin Immunol. 136 (5), 1355-1368 (2015).
  17. Gaublomme, J. T., Yosef, N., Lee, Y., et al. Single-Cell Genomics Unveils Critical Regulators of Th17 Cell Pathogenicity. Cell. 163 (6), 1400-1412 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة