بعد إعداد الأجسام المضادة وحيدة النسيلة 64 النحاس تعديل ملزم لالفئران المعدلة وراثيا مستقبلات الخلايا التائية والخلايا T هي رديولبلد في الجسم الحي، وتحليلها للبقاء، وظائف، والاستقرار ووضع العلامات وموت الخلايا المبرمج، ونقلت adoptively في الفئران مع مجرى الهواء من نوع تأخر فرط الحساسية رد فعل للتصوير غير الغازية التي كتبها التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني / التصوير المقطعي (PET / CT).
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يوضح هذا البروتوكول إنتاج 64 النحاس وخالب اقتران / radiolabeling من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (ماب) تليها زراعة الخلايا اللمفاوية الفئران ومستقبلات 64 النحاس والأجسام المضادة التي تستهدف الخلايا. في تقييم المختبر من موصوفة في radiolabel وغير الغازية في تعقب خلية الجسم الحي في نموذج حيواني لمجرى الهواء من نوع تأخر فرط الحساسية رد فعل (DTHR) من خلال PET / CT.
في التفاصيل، يظهر الاقتران من ماب مع خالب حمض 1،4،7،10-tetraazacyclododecane-1،4،7،10-tetraacetic (DOTA). بعد إنتاج المشع 64 النحاس، radiolabeling من ماب DOTA مترافق يوصف. التالي، والتوسع في ألبومين البيض الدجاج (كوفا) CD4 + محددة فيروسات (IFN) -γ المنتجة وصفت خلايا T المساعدة (كوفا-TH1) وradiolabeling اللاحقة من الخلايا كوفا-TH1. وتعرض مختلف في المختبر تقنيات لتقييم القوة التنفيذيةتأثيرات سلبية من 64 النحاس وradiolabeling على الخلايا، مثل تحديد بقاء الخلية التي الاستبعاد التريبان الأزرق، وتلطيخ لموت الخلايا المبرمج مع Annexin V لالتدفق الخلوي، وتقييم الأداء الوظيفي عن طريق الإنترفيرون جاما فحص انزيم مرتبط المناعي (ELISA) . علاوة على ذلك، وصف تقرير لامتصاص المشع في الخلايا والاستقرار وصفها بالتفصيل. يصف هذا البروتوكول كذلك كيفية تنفيذ دراسات تتبع خلية في نموذج حيواني لDTHR مجرى الهواء، وبالتالي، يتم تضمين تحريض الناجم عن كوفا-DHTR الهوائية الحاد في BALB / ج الفئران. وأخيرا، قدم قوي PET / CT سير العمل بما في ذلك الحصول على الصور، وإعادة الإعمار، والتحليل.
مستقبلات استهداف نهج 64 النحاس والأجسام المضادة مع استيعاب مستقبلات لاحق يوفر خصوصية عالية والاستقرار، وانخفاض السمية الخلوية، ومعدلات هروب رأس المال منخفضة مقارنة PET-استشفاف مشتركة لوضع العلامات الخلية، وعلى سبيل المثال 64 النحاسمكرر -pyruvaldehyde (N4-methylthiosemicarbazone) (64 النحاس وPTSM). وأخيرا، نهجنا تمكن غير الغازية في تعقب خلية الحي بواسطة PET / CT مع النسبة المثلى الإشارة إلى خلفية لمدة 48 ساعة. يمكن نقل هذا المنهج التجريبي لنماذج حيوانية وأنواع مختلفة من الخلايا مع مستقبلات محددة غشاء التي يتم استيعابها.
المقدمة
تتبع الخلية غير الغازية هو أداة مرنة لمراقبة وظيفة الخلية والهجرة وصاروخ موجه في الجسم الحي. وقد ركزت دراسات تتبع الخلية الأخيرة على الوسيطة 1 أو 2 أو نخاع العظم الخلايا الجذعية المستمدة 3 في سياق الطب التجديدي، ذاتي الطرفية خلايا الدم البيضاء في التهاب أو الخلايا الليمفاوية T في العلاج بالخلايا بالتبني ضد السرطان 3 و 4. توضيح من مواقع العمل والمبادئ البيولوجية الكامنة وراء العلاجات المستندة إلى الخلايا له أهمية هائلة. CD8 + T السامة للخلايا الليمفاوية، وراثيا خيالية م....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
احتياطات السلامة: عند التعامل مع النشاط الإشعاعي، وتخزين 64 النحاس وراء الطوب بنتيجة 2 بوصة سميكة واستخدام الدروع منها لجميع السفن التي تحمل النشاط. استخدام الأدوات المناسبة للتعامل بشكل غير مباشر المصادر دون رادع لتجنب الاتصال المباشر جهة والحد من التعرض للمواد المشعة. دائما ارتداء شارات الإشعاع مراقبة قياس الجرعات ومعدات الحماية الشخصية وتحقق الذات ومجال العمل للتلوث لمعالجة ذلك فورا. تجاهل معدات الحماية الشخصية التي قد تكون ملوثة قبل مغادرة المنطقة حيث يتم استخدام المواد المشعة. تخزين النفايات المشعة كلها وراء الرصاص التدريع حتى يتم التهاوي في المشع 64 النحاس (حوالي 10 نصف يفس-= 127 ساعة) قبل التخلص منه....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويلخص الشكل 1 وضع العلامات الخلايا كوفا-TH1 مع 64 النحاس وDOTA-KJ1-26-ماب والتصميم التجريبي للفي المختبر، والدراسات المجراة المشمولة في هذا البروتوكول.
الشكل 1: 64 النحاس وDOTA-KJ1-26-ماب وسمها عملية وتصميم التجارب.<.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يعرض هذا البروتوكول طريقة موثوقة وسهلة لradiolabel مستقر الخلايا في الجسم الحي تتبع من قبل PET. باستخدام هذه الطريقة، وخلايا كوفا-TH1، معزولة وتوسعت في المختبر من الفئران المانحة، يمكن أن يكون رديولبلد مع 64 النحاس وDOTA-KJ1-26-ماب وصاروخ موجه من كانت تتبع لLNS الرئوية وperithymic كمواقع العرض كوفا في كوفا الناجم عن DTHR الهوائية الحادة.
تعديل على ماب مع خالب يتطلب العمل بسرعة وكفاءة .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
الكتاب أشكر الدكتورة جوليا مانهايم، ووالتر إهرليشمان، رامونا ستوم، فوندا كاي، دانيال بوكالا، مارين هارانت وكذلك ناتالي ألتمير للدعم خلال تحليل التجارب والبيانات. وأيد هذا العمل من قبل فيرنر سيمنس-مؤسسة، وDFG من خلال SFB685 (B6 المشروع) والثروة (2309-0-0).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| HCl ، Suprapur | Merck ، دارمشتات ، ألمانيا | 1.00318 | 64< / sup> إنتاج النحاس |
| الميثانول ، Suprapur | Merck ، دارمشتات ، ألمانيا | 1.06007 | 64< / sup> إنتاج النحاس |
| Isopropanol ، Suprapur | Merck ، دارمشتات ، ألمانيا | 1.0104 | 64 < / sup>Cu إنتاج |
| Pt / Ir (90/10) لوحة | & Ouml ؛ gussa | مخصص صنع | < sup> 64 < / sup> إنتاج النحاس |
| غرفة نظرة خاطفة | WKL | صنع حسب الطلب | < sup> 64 < / sup> إنتاج النحاس |
| < sup> 64 < / sup>Ni | Chemotrade | 64 < / sup> Cu إنتاج | |
| Polygram SIL G / UV 254 لوحة | Macherey-Nagel | 805021 | 64 < / sup> Cu الإنتاج |
| تبادل الأيون عمود | BioRad | AG1-X8 | 64< / sup>Cu |
| إنتاج نظام مستهدف الحالة الصلبة ل PETtrace | WKL | costum المصنوع | sup64< / sup>Cu الإنتاج |
| 64< / sup>Cu وحدة العمل | WKL | costum الصنع | sup< 64 / sup>Cu |
| إنتاج معاير الجرعة | Capintec | CRC-25R | |
| PETtrace سيكلوترون | جنرال إلكتريك للأنظمة | ||
| DOTA-NHS | Macrocyclics | B-280 | DOTA-conjugation |
| الأجسام المضادة ل cOVA-TCR (KJ1-26) | معزولة من ثقافة خلايا الورم الهجين | DOTA-conjugation | |
| Nasub2HPO4 | Sigma-Aldrich | 71633 | DOTA-conjugation |
| H+< / sup> Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | DOTA-conjugation |
| Amicon Ultra-15 وحدة تصفية | Merck Millipore | UFC910008 | DOTA-conjugation |
| Rotipuran المياه فائقة النقاء | Carl Roth | HN68.3 | DOTA-conjugation |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | 32301 | DOTA-conjugation |
| PBS | University Tuebingen | DOTA-conjugation | |
| Micro-Bio-spin P-6 العمود | Bio-Rad Laboratories | 7326221 | DOTA-conjugation |
| سترات الصوديوم | سيجما-ألدريتش | 71497 | DOTA-conjugation |
| Cyclone Plus PhosphorImager | Perkin-Elmer | L2250116 | DOTA-conjugation |
| DMEM | Merck Millipore | 102568 | مكون للخلية التائية المتوسطة |
| FCS | Merck Millipore | S0115 / 1004B | مكون للخلية التائية المتوسطة ؛ |
| بيروفات الصوديوم | ميرك ميليبور | L0473 | المكون للخلية التائية المتوسطة |
| الأحماض الأمينية MEM مكون | Merck Millipore | K0293 | لوسط الخلايا التائية ؛ |
| HEPES | ميرك ميليبور | L 1613 | مكون للخلية التائية متوسطة |
| البنسلين / الستربتومايسين | ميرك ميليبور | A2212 | المكون لوسط الخلايا التائية ؛ |
| 0.05 ملي مولار 2-&&بيتا;-ميركابتو إيثانول | سيجما-ألدريتش | M3148 | مكون للخلية التائية متوسط |
| DO11.10 الفئران | في المنزل تربية | خلايا TH1 ثقافة الخلايا | |
| DPBS | Gibco | 14190144 | TH1 |
| مصفاة الخلية 40 & m | Corning | 352340 | TH1 ثقافة الخلايا |
| ACK Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | TH1 ثقافة الخلايا |
| CD4 MicroBeads ، الماوس | Miltenyi Biotech | 130-097-145 | TH1 ثقافة الخلايا |
| QuadroMACS فاصل | Miltenyi Biotech | 130-090-976 | TH1 ثقافة الخلايا |
| LS عمود | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | TH1 ثقافة الخلايا |
| الجسم المضاد المضاد ل CD4 (Gk1.5) | معزول من ثقافة خلايا الورم الهجين | TH1 ثقافة الخلايا | |
| المضاد ل CD8 (5367.2) | معزول عن ثقافة خلايا الورم الهجين | ثقافة خلايا TH1 | |
| المضاد للفئران (MAR18.5) | معزول من ثقافة خلايا الورم الهجين | TH1 زراعة الخلايا | |
| الأرانب مكملة MA | tebu-Bio | CL3221 | TH1 ثقافة الخلايا |
| المضادة ل IL-4 الجسم المضاد (11B11) | معزول من ثقافة خلايا الورم الهجين | TH1 ثقافة الخلية | |
| cOVA 323-339-peptide ؛ | مجموعات EMC-micro طلب | مخصص | لثقافة الخلايا TH1 |
| CPG1668-oligonucleotides | Eurofins MWG Operon | طلب مخصص | TH1 ثقافة الخلايا |
| IL-2 | Novartis | 65483-116-07 | TH1 زراعة الخلايا |
| 96 بئر | لوحات Greiner & nbsp ؛ | 655180 | TH1 زراعة الخلايا |
| 24 بئر ألواح | Greiner | 662160 | قارورة ثقافة الخلايا TH1 لثقافة |
| الخلايا | Greiner | 660175 | TH1 زراعة الخلايا |
| 48 بئر لوحات | Greiner | 677 180 | وضع العلامات على |
| الخلايا Gammacell 1000 | Best Theratronics | عبر< em> استفسار | |
| Gulmay RT225 | Gulmay | عبر استفسار | |
| تريبان الأزرق | ميرك ميليبور | L6323 | في المختبر تقييم |
| الماوس IFN-& غاما; ELISA | BD Biosciences | 558258 | in vitro< / em> تقييم |
| PE Annexin V Detection Optosis Kit | تقييم BD Biosciences | 559763 | in vitro< / em> |
| Tube 5 mL | Sarstedt | 55.476 | in vitro< / em> تقييم |
| أنابيب مستديرة القاع | BD Biosciences | 352008 | in vitro< / em> تقييم |
| معالج γ-counter | Perkin-Elmer | 2480-0010 | in vitro تقييم |
| ELISA Reader MultiscanEX | Thermo Fisher Scientific | 51118177 | in vitro< em> تقييم |
| مجهر | Leica | عبر استفسار | تقييم in vitro< / em> |
| BD LSRII | BD Biosciences | عبر استفسار | تقييم in vitro |
| BALB / c الفئران | تشارلز | ريفر 028 | in vivo< em> الاتجار بالخلايا |
| هلام الألومنيوم | سيرفا الكهربائي | 12261.01 | in vivo< em> الاتجار بالخلايا |
| Xylazine | Bayer HealthCare | تم طلبها عبر< em> مستشفى الجامعة | in vivo< / em> الاتجار بالخلايا |
| نسبة الكيتامين | طلبت <م > عن طريق < م > مستشفى الجامعة | < م > في الجسم الحي < / م > الاتجار بالخلايا | |
| Isoflurane | CP-Pharma | تم طلبها <م > عن طريق < / م > مستشفى الجامعة | < م > في الجسم الحي < م > الاتجار بالخلايا |
| 30 جم إبرة | BD Biosciences | 304000 | in vivo < / em > الاتجار بالخلايا |
| حقنة | BD Biosciences | 11612491 | in vivo< / em> الاتجار بالخلايا |
| الشعيرات الدموية 10 & micro; L | VWR | 612-2439 | |
| Inveon PET scanner | Siemens Healthineers | لم تعد متوفرة | in vivo< / em> الاتجار بالخلايا, الشركات البديلة: Bruker, Mediso |
| الماسح الضوئي Inveon SPECT / CT | لم يعد Siemens Healthineers | متاحا | in vivo < / em > الاتجار بالخلايا |
| Inveon Research Workplace | Siemens Healthineers | تحليل الصور ، البرامج البديلة: Pmod |
المراجع
- Cerri, S., et al. Intracarotid Infusion of Mesenchymal Stem Cells in an Animal Model of Parkinson's Disease, Focusing on Cell Distribution and Neuroprotective and Behavioral Effects. Stem Cells Trans Med. 4 (9), 1073-1085 (2015).
- Hasenbach, K., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
