مقالة منهجية

العزلة وإثراء الكبد السلف مجموعات فرعية تم تحديدها من قبل رواية السطح علامة الجمع

10.7K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/55284

⸱

فبراير 18, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine II, Saarland University Medical Center, 2Department of Physiology, Center for Integrative Physiology and Molecular Medicine (CIPMM), University of Saarland

في هذه المقالة

ملخص

ويرافق إصابات الكبد عن طريق التوسع خلية سلفية التي تمثل السكان الخلية غير المتجانسة. تصنيف رواية من هذا مقصورة الخلوية يسمح للالمميزة للمجموعات فرعية متعددة. الطريقة الموصوفة هنا يوضح تحليل التدفق الخلوي وعالية العزلة نقاء مختلف مجموعات فرعية والتي يمكن استخدامها لإجراء مزيد من الفحوص.

الملخص

خلال إصابات الكبد المزمنة، الخلايا الاصلية توسع في عملية تسمى رد فعل ductular، الذي ينطوي أيضا على ظهور ارتشاح الخلايا الالتهابية وتنشيط الخلايا الظهارية. ومعظمها تم التحقيق في عدد السكان خلية سلفية أثناء هذه التفاعلات الالتهابية باستخدام علامات سطح واحد، إما عن طريق التحليل النسيجي أو عن طريق تدفق التقنيات التي تعتمد الخلوي. ومع ذلك، علامات سطح رواية حددت مختلف مجموعات فرعية متميزة وظيفيا داخل السلف الكبد / وقف حجرة الخلية. الطريقة المعروضة هنا يصف العزلة وتدفق مفصل الخلوي تحليل مجموعات فرعية السلف باستخدام تركيبات علامة سطح الرواية. وعلاوة على ذلك، فإنه يوضح كيف يمكن أن تكون معزولة مختلف مجموعات فرعية خلية سلفية مع الأساليب القائمة على الفرز نقاء عالية باستخدام الآلي المغناطيسي ونظام مراقبة الأصول الميدانية. الأهم من ذلك، الرواية والأنزيمية مبسط تفكك الكبد يسمح لعزل هؤلاء السكان الخلية نادرة مع قابلية عاليةوهذا هو أعلى بالمقارنة مع الطرق الأخرى القائمة. هذا مهم بشكل خاص لمزيد من الدراسة الخلايا الاصلية في المختبر أو لعزل ذات جودة عالية الحمض النووي الريبي لتحليل الشخصية التعبير الجيني.

المقدمة

ويرتبط تجديد الكبد في الغالب مع القدرة الذاتي تجديد خلايا الكبد. ومع ذلك، تحدث إصابات الكبد المزمنة مع تفعيل خلية سلفية والتوسع، والتي ارتبطت مع قدرتها على التمايز إلى خلايا الكبد وcholangiocytes 1، 2، 3، 4. هذا مهم بشكل خاص لأنه، أثناء الإصابات المزمنة، وانتشار خلايا الكبد ليست فعالة. وعلى الرغم من الدراسات تتبع وراثية متعددة تستهدف الخلايا الاصلية، ودورها في تجديد الكبد لا تزال مثيرة للجدل 5، 6، 7، 8. وعلاوة على ذلك، وقد تم ربط تنشيط الخلايا الاصلية لزيادة استجابة التليف في الكبد، مما يثير التساؤلات حول دورها المحدد خلال الإصابات 9، 10.

منذ فترة طويلة واقترح الطبيعة غير المتجانسة للمقصورة خلية سلفية دراسات التعبير الجيني الذي عزل الخلايا الاولية تعبر عن علامة السطح واحدة باستخدام تسليخ مجهري أو خلية على أساس أساليب الفرز 1، 11. في الواقع، في الآونة الأخيرة، رواية الجمع بين علامة السطح باستخدام gp38 (podoplanin) مرتبطة بشكل لا لبس فيه علامات واحدة السابقة الخلايا الاصلية لمختلف مجموعات فرعية 12. الأهم من ذلك، هذه فرعية لا تختلف فقط في التعبير علامة السطح، بل أيضا عرضت التعديلات الوظيفية أثناء الإصابات 12.

وقد استخدمت نماذج حيوانية متعددة للتحقيق في تنشيط الخلايا الاصلية وتجديد الكبد. ويبدو أن أنواع الإصابات المختلفة تعزز تفعيل مجموعات فرعية من الخلايا الاصلية 12 اختلاف. هذا قد يفسر الرقم الهيدروجينيالاختلاف enotypic من رد فعل ductular لوحظ في البشر (4). وهكذا، فإن المظهرية والوظيفية التحليلات المعقدة من الخلايا الاصلية تقوم بدور محوري في فهم دورها في الإصابات والمغزى الحقيقي للتفاعل ductular في أمراض الكبد.

إلى جانب مجموعات علامة السطح، والاختلافات الجوهرية في بروتوكولات العزل الخلية يزيد من تعقيد استنتاجات تستند إلى الدراسات السابقة 2. وهناك كمية كبيرة من الدراسات تناولت دور الخلايا الاولية التي تختلف كثيرا في بروتوكول عزلتهم (على سبيل المثال، التفكك الكبد (مزيج انزيم ومدة العملية)، متوسطة الكثافة، وسرعة الطرد المركزي) 2. تقنية العزل الأمثل، وتوفير قابلية أفضل للسكان الخلية نادرة وتعكس تركيبة فرعية، وقد تم تطوير ونشر مؤخرا 12. والهدف من هذه المقالة هو لتوفير المزيد من ديتبروتوكول ailed من هذا الإجراء عزل خلايا الكبد وتحليل فرعية للسماح لاستنساخ السليم لهذه التقنية. بالإضافة إلى ذلك، يتضمن بروتوكول مقارنة مع أسلوب العزلة السابق للتدليل على الاختلافات بالمقارنة مع البروتوكول الجديد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وقد جرت كافة الإجراءات التجريبية بموافقة من الأخلاق ولجان الرعاية الحيوانية من المركز الطبي لجامعة هومبورغ.

1. إعداد المواد والمخازن

  1. طازجة إعداد جميع المخازن اللازمة لهضم الكبد باستخدام مكونات معقمة وغطاء الصفحي لتجنب التلوث الجرثومي.
  2. إعداد المخزن المؤقت جمع (CB) عن طريق خلط 49.5 مل من RPMI المتوسطة و 0.5 مل من مصل بقري جنيني (FBS، منخفضة الذيفان الداخلي، حرارة المعطل) لتحقيق حل 1٪ (ت / ت). تخزين الحل على الجليد حتى مزيد من الاستخدام.
    ملاحظة: حوالي 25 مل من CB الضروري لهضم الكبد كله واحد.
  3. إعداد العازلة الهضم (DB) باستخدام المكونات التالية: RPMI المتوسطة، 1٪ (ت / ت) FBS (الذيفان الداخلي منخفضة، والمعطل الحرارة)، كولاجيناز P (0.2 ملغ / مل)، الدناز-I (0.1 ملغ / مل) وdispase (0.8 ملغ / مل).
    ملاحظة: حوالي 25 مل من DB من الضروري لهضم الكبد كله واحد. قبل تدفئة DB في تيكان 37 ° C حمام الماء قبل الاستخدام.
  4. إعادة تشكيل الأنزيمات لدى وصوله في محلول ملحي متوازن هانكس "(HBSS، collagense P وdispase) أو في الدناز-I العازلة (50٪ (ت / ت) الجلسرين، 1 ملم MgCl 2 و 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5) ، قسامة عليه، وتخزينه عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. تخزين الدناز-I العازلة عند 4 درجات مئوية واستخدامها في غضون شهرين.

2. إعداد الكبد وحيدة الخلية تعليق

  1. الموت ببطء غير المعالجة من النوع البري الفئران عن طريق التفكك عنق الرحم وفقا لأخلاقيات المحلية ولجان رعاية الحيوان.
  2. وضع الفئران على لوحة التشريح والرطب الفراء مع الايثانول 70٪. باستخدام مقص، فتح البطن مع شق خط الوسط من الجلد، تليها Y-شق نحو الأطراف. فتح الصفاق تصل إلى القص باستخدام المقص. من أجل الكشف عن الكبد وتهجير الأمعاء بلطف إلى الجانب الأيمن باستخدام قطعة من القطن.
  3. مع مساعدة من مقص وملقط، إزالة فصوص الكبد،ترك المرارة وراء، وتجنب التلوث مع النسيج الضام. وزن الكبد ووضعه على الجليد في طبق بتري تحتوي HBSS.
  4. وضع فصوص الكبد في طبق بتري الجاف وقطع أنسجة الكبد إلى مكعبات متجانسة حوالي 2 مم الجانب باستخدام مشرط. نقل قطع في أنبوب الطرد المركزي 15 مل المخروطية.
  5. إضافة 2.5 مل من DB إلى أنبوب مخروطي الطرد المركزي 15 مل تحتوي على قطع الكبد ووضعه في حمام الماء 37 درجة مئوية لبدء عملية الهضم (كبد صحي يأخذ 60-70 دقيقة والكبد تليف يأخذ 80-90 دقيقة ).
    ملاحظة: إذا كان يتم هضمها واحد الكبد كله، يجب فصل الكبد إلى أنبوبين 15 مل المخروطية أجهزة الطرد المركزي لضمان بقاء الخلية جيدة.
  6. إعداد 15 مل أنبوب مخروطي أجهزة الطرد المركزي الجديدة لجمع خلايا الكبد الافراج عنهم. وضع مادة البولي بروبيلين 100 ميكرون فلتر شبكة على رأس الأنبوب والرطب يتناغم مع 800 ميكرولتر من CB. وضع أنبوب الطرد المركزي مخروطي على الجليد.
  7. مزيج سامPLES في حمام الماء 37 درجة مئوية بعد 5 و 10 دقيقة من أجل دعم عملية الهضم عن طريق هز أنبوب مخروطي الطرد المركزي 15 مل تحتوي على قطع الكبد.
  8. 15 دقيقة بعد بدء عملية الهضم، وتخلط بلطف القطع الكبد باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر مع طرف قطع تمكن قطع الكبد لتمرير من خلال بسهولة. وضع أنابيب مرة أخرى في حمام مائي والسماح القطع ليستقر لمدة 2 دقيقة.
  9. إزالة طاف تحتوي على خلايا نشرها (عادة 2x أخرى 700 ميكرولتر) وإضافته إلى أنبوب أعدت في الخطوة 2.6. استبدال طاف إزالتها مع DB (2X 700 ميكرولتر) ووضعه مرة أخرى في حمام ماء C 37 درجة.
  10. كرر الإجراء هو موضح في الخطوة 2.8 (عادة في 30، 40، 50، 55، و 60 دقيقة) حتى مرت حوالي 60-70 دقيقة منذ بداية عملية الهضم. من 40 دقيقة فصاعدا، يجب أن يكون قطع الكبد المتبقية صغيرة بما يكفي لتمرير من خلال تقطيعه 1000 ميكرولتر ماصة.
    ملاحظة: الكبد الصحي هو DIGESTED بالكامل داخل 60-70 دقيقة، في حين كبد متليفة يحتاج عادة 80-90 دقيقة. من خلال هذه النقطة الوقت، ينبغي على أنسجة الكبد لا تكون مرئية في أنبوب الطرد المركزي 15 مل مخروطي يحتوي على قطع الكبد، ويجب أن يتم نقل جميع الخلايا التي تطلق في أنبوب أعدت في الخطوة 2.6.
  11. في نهاية عملية الهضم، وجمع الخلايا وأجهزة الطرد المركزي لهم لمدة 8 دقائق في 180 x ج و 4 درجات مئوية (باستخدام تخفيض تسارع / 4 والتباطؤ / 2).
  12. resuspend الكرية خلية في 1 مل من الأمونيوم كلوريد البوتاسيوم (ACK) تحلل العازلة واحتضان لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لليز خلايا الدم الحمراء. وقف رد الفعل بإضافة 5 مل من CB، ثم الطرد المركزي الخلايا لمدة 8 دقائق في 180 x ج و 4 درجات مئوية (باستخدام تخفيض تسارع / 4 والتباطؤ / 2). resuspend الخلايا في 4 مل من CB وتخزينها على الجليد. عد الخلايا، كما هو موضح في الخطوة 3.
    ملاحظة: بيليه الخلية واهية، وبالتالي فإن طاف هو pipetted بعيدا بدلا من أن يصب.

3. تحديد عدد الخلايا باستخدام التدفق الخلوي

ملاحظة: للحصول على تحديد عدد الخلايا، ومكافحة خلية الآلي أو، من الناحية المثالية، ويقترح تدفق الكمي خلية مقرها الخلوي وصفها أدناه بدلا من الأسلوب القائم على الغرفة الكلاسيكية نويباور. تعليق الكبد وحيدة الخلية هو موضح في الخطوة 2 يحتوي على متني وغير متني الخلايا (مجلس الشعب) مع اختلاف إلى حد كبير الأحجام والحبيبات. استبعاد السليم من الحطام الخلوي جنبا إلى جنب مع على النابضة مبعثر إلى الأمام، مبعثر الجانب (FSC-SSC) سمة من سمات الشخصيات عند استخدام التدفق الخلوي يضمن نجاح بروتوكول صفها 12.

  1. إعداد قسامة من تعليق خلايا الكبد (20 ميكرولتر) وإضافة 174 ميكرولتر من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) و 6 ميكرولتر من اليود propidium (PI، نهاية تركيز 0.375 ميكروغرام / مل). إضافة حبات عد التي تسمح لتقدير حجم الخلايا.
  2. على بوابة SSC-A-FSC-A لتجنب الحطام وزيادة استبعاد الحلل باستخدام FSC-H وFCS-A.
    ملاحظة: من المهم أن تتبع استراتيجية النابضة مبين في الشكل 2.
  3. بوابة خروج الخلايا الميتة-PI إيجابي، قياس 30 ميكرولتر من العينات الخاصة بك، وتسجيل الأحداث. اتبع إرشادات الشركة المصنعة لحساب عدد خلايا.
    ملاحظة: اتبع الخطوات من 4 لالتدفق الخلوي القياس، الخطوتين 5 و 6 لالمغناطيسي المعتمدة العزلة خلية سلفية، والخطوتين 7 لالتدفق الخلوي نوع من القطعان السلف.

4. تلون الكبد تعليق خلية واحدة لتحليل الخلوي FOW من السلف مجموعات فرعية

الجسم المضاد استنساخ المضيف / نمط إسوي الأسهم تركيز [مغ / مل] تخفيف
CD64 X54-5 / 7.1 ماوس IgG1، κ 0.5 1: 100
CD16 / 32 93 الفئران IgG2a، λ 0.5 1: 100
CD45 30-F11 الفئران IgG2b، κ 0.2 1: 200
CD31 MEC13.3 الفئران IgG2a، κ 0.5 1: 200
ASGPR1 بولكلونل الماعز مفتش 0.2 1: 100
Podoplanin 1/8/2001 الهامستر مفتش السوري 0.2 1: 1400
Podoplanin 1/8/2001 الهامستر مفتش السوري 0.5 1: 1400
CD133 Mb9-3G8 فأر IgG1 0.03 3 ميكرولتر
CD133 315-2C11 فأر الإيجG2A، λ 0.5 1: 100
CD34 RAM34 الفئران IgG2a، κ 0.5 1: 100
CD90.2 53-2،1 الفئران IgG2، κ 0.5 1: 800
CD157 BP-3 الماوس IgG2b، κ 0.2 1: 600
EpCAM G8.8 الفئران IgG2a، κ 0.2 1: 100
هيئة السلع التموينية-1 D7 الفئران IgG2a، κ 0.03 10 ميكرولتر
الماوس IgG2b، κ MPC-11 0.2
فأر IgG1 RTK2071 0.2
الفئران IgG2b، κ RTK4530 0.2
الفئران IgG2a، κ RTK2758 0.5
الفئران IgG2a، κ RTK2758 0.2
الهامستر مفتش السوري مجموعات المساعدة الذاتية-1 0.2
الهامستر مفتش السوري مجموعات المساعدة الذاتية-1 0.5
عادي تحكم الماعز مفتش بولكلونل الماعز مفتش 1
حمار مكافحة الماعز مفتش حمار مفتش 2 1: 800
Streptavidin 1 1: 400

الجدول 1.

الجسم المضاد 1 2 3 4 5
CD45 APC / Cy7 الفئران IgG2b، κ
0.5 ميكرولتر 		+ + + +
CD31 البيوتين + الفئران IgG2a، κ
0.5 ميكرولتر 		+ + +
ASGPR1 تنقيته + + عادي تحكم الماعز مفتش
0.2 ميكرولتر 		+ +
Podoplanin APC + + + الهامستر مفتش السوري
1 ميكرولتر من التخفيف 01:14 		+
CD133 PE + + + + فأر IgG1
0.45 ميكرولتر
حمار مكافحة الماعز
فلور اليكسا 488 		+ + + + +
Streptavidin
فلور اليكسا 405 		+ + + + +

الجدول 2.

  1. وضع قسامة لتعليق الخلية من الخطوة 2.11 في أنبوب التفاعل (1.5 مل) تحتوي على 2.5 × 10 5 خلايا، والعزم كما هو موضح في الخطوة 3.
  2. الطرد المركزي الخلايا لمدة 3 دقائق في 300 x ج و 4 درجات مئوية باستخدام microcentrifuge ل.
    ملاحظة: عند هذه النقطة، يمكن استخدام مضخة فراغ لإزالة بعناية طاف.
  3. resuspend الكرية خلية في مزيج FC-كتلة واحتضان لمدة 5 دقائق على الجليد. تحضير مزيج FC-كتلة مع حجم ما مجموعه 50 ميكرولتر في وصمة عار. إضافة 10 ميكرولتر من حجب FCR الكاشف، 1 ميكرولتر من تنقية مكافحة CD64 (1: 100؛ 0.5 ميكروغرام / وصمة عار)، و 40 ميكرولتر من العازلة تلطيخ (ST المخزن المؤقت: HBSS، 1٪ (ت / ت) FBS، و 0.01٪ أزيد الصوديوم) في وصمة عار.
    ملاحظة: أزيد الصوديوم عالية السمية. استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة، مثل القفازات النتريل، معطف المختبر، وقناع الوجه.
  4. إضافة 50 ميكرولتر من تلطيخ مزيج من الخلايا (الحجم الكلي للخلايا هو الآن 100 ميكرولتر) واحتضان الخلايا مع مزيج الأجسام المضادة، محمية من الضوء ولمدة 20 دقيقة على الجليد.
  5. تحضير مزيج الأجسام المضادة مع حجم ما مجموعه 50 ميكرولتر في وصمة عار. 50 ميكرولتر من ST العازلة، إضافة الأجسام المضادة التالية مترافق لتلطيخ الأساسي: CD45 (0.5 ميكرولتر، 1: 200؛ 0.1 ميكروغرام / وصمة عار)، CD31 (0.5 ميكرولتر، 1: 200، 0.25 ميكروغرام / وصمة عار)، ASGPR1 (1 ميكرولتر ، 1: 100؛ 0.2 ميكروغرام / وصمة عار)، podoplanin (1 ميكرولتر من تخفيف 01:14، 1: 1400 نهاية التخفيف؛ 0.014 ميكروغرام / وصمة عار)، وCD133 (3 ميكرولتر، 0.09 ميكروغرام / وصمة عار).
    ملاحظة: الجدول1 يلخص استنساخ الضد والتخفيفات المستخدمة للبقع الأساسية وعلامات سطح إضافية من مختلف مجموعات فرعية. إعداد تعليق خلية إضافية لمزيج الأجسام المضادة التي تحتوي على الضوابط نمط إسوي المقابلة و / أو مضان ناقص واحد الضوابط (FMOs)، كما هو مبين في الجدول رقم (2).
  6. إضافة 400 ميكرولتر من العازلة ST لكل عينة وأجهزة الطرد المركزي الخلايا لمدة 4 دقائق في 300 x ج و 4 درجات C.Discard وطاف resuspend الخلايا في 100 ميليلتر من مزيج الأجسام المضادة الثانوية التي تحتوي على 0.125 ميكرولتر من حمار المضادة للماعز مفتش (1: 800؛ 0.25 ميكروغرام / وصمة عار) و 0.25 ميكرولتر من streptavidin الفلورسنت، مترافق (1: 400، 0.25 ميكروغرام / وصمة عار) في 100 ميكرولتر من العازلة ST.
  7. احتضان الخلايا في حين محمية من الضوء ومع مزيج الأجسام المضادة لمدة 20 دقيقة على الجليد. إضافة 400 ميكرولتر من ST العازلة لكل عينة وأجهزة الطرد المركزي الخلايا لمدة 4 دقائق في 300 x ج و 4 درجات مئوية. تجاهل وطاف resuspend الخلايا في 300 ميكرولتر من ST برتقاليإيه تحتوي على 0.25 ميكروغرام / مل PI.
    ملاحظة: إن بقاء الخلية من الخلايا الاصلية تتناقص مع الوقت. لذا، يقترح لقياس عينات جديدة في أقرب وقت ممكن.

5. المغناطيسي إثراء القائم على ميكروبيدات من خلايا السلف

  1. نقل قسامة لتعليق الكبد وحيدة الخلية التي تحتوي على 1.5-2 × 10 6 خلايا، استنادا إلى عدد خلايا تحديد كما هو موضح في الخطوة 3، إلى 15 مل أنبوب مخروطي أجهزة الطرد المركزي الجديدة.
  2. الطرد المركزي الخلايا لمدة 8 دقائق في 180 x ج و 4 درجات مئوية (باستخدام تخفيض تسارع / 4 والتباطؤ / 2).
    ملاحظة: عادة، واحد صحي C57BL / 6 الماوس الكبد (أو 1 غرام من أنسجة الكبد) سوف تحتاج إلى أن تكون مفصولة إلى ثلاثة 15 مل أنبوب الطرد المركزي المخروطية.
  3. Resuspend الخلايا في 400 ميليلتر من HBSS 0.5٪ (ت / ت) زلال المصل البقري (BSA) وإضافة 40 ميكرولتر من ميكروبيدات مكافحة CD31 و 30 ميكرولتر من ميكروبيدات مكافحة CD45. احتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: لا تتجاوز رانه حضانة الوقت، ونقاء الفصل ستنخفض بشكل كبير.
  4. إضافة 5 مل من HBSS 0.5٪ (ت / ت) BSA للخلايا وأجهزة الطرد المركزي لهم لمدة 8 دقائق في 180 x ج و 4 درجات مئوية (باستخدام تخفيض تسارع / 4 والتباطؤ / 2).
  5. Resuspend وبيليه الخلية في 100 ميكرولتر من القتلى الخرز إزالة الخلايا واحتضان لهم في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. في غضون ذلك، وإعداد عمود الفصل LS ومعايرة مع 3 مل من HBSS 0.5٪ (ت / ت) BSA.
    ملاحظة: لا تتجاوز فترة حضانة، ونقاء الفصل ستنخفض بشكل كبير.
  6. إضافة 900 ميكرولتر من HBSS 0.5٪ (ت / ت) BSA إلى الخلايا، وتصفية لهم باستخدام 100 ميكرون تصفية مادة البولي أميد شبكة، وتحميلها على العمود فصل ليرة سورية.
    ملاحظة: تحميل واحد الكبد كامل على عمود الفصل LS واحد.
  7. غسل العمود ثلاث مرات مع 3 مل من HBSS 0.5٪ (ت / ت) BSA وجمع من خلال تدفق.
  8. أجهزة الطرد المركزي من خلال تدفق لمدة 8 دقائق في 180 x ج و 4 درجات مئوية (باستخدام انخفاض الملحقات وleration / 4 والتباطؤ / 2).
  9. Resuspend وبيليه الخلية إما في الشطف عازلة (RB) (PBS و 2 ملم ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA)) تحتوي على 0.5٪ (ت / ت) BSA أو عازلة ST، وهذا يتوقف على إجراء مزيد من التجارب.

الآلي تنقية خلية مقرها ميكروبيدات-6. المغناطيسي للمجموعات فرعية خلية سلفية الجامع من الأكباد متعددة

ملاحظة: منذ فرعية خلية سلفية تمثل السكان الخلية نادرة، وغالبا ما يحتاج الجمع بين الخلايا من الكبد متعددة لتحقيق أرقام خلية كافية لمزيد من التجارب. وكمثال على ذلك، CD133 + وgp38 + فصل الخلية هو موضح أدناه.

  1. عزل CD133 + الأسلاف
    1. بعد الخطوة 5.9، عد الخلايا، كما هو موضح في الخطوة 3، و resuspend ما يصل الى 10 6 خلايا (عادة تجميع 4-6 عينات الكبد السليمة) في 100 ميليلتر من RB.
    2. إضافة مكافحة CD64 1: 100 ومعاداة CD16 / 32 1: 100 إلى الخلايا وincubيأكلونها على الجليد لمدة 5 دقائق. إضافة 1: 100 المضادة CD133 الضد البيروكسيديز إلى الخلايا واحتضان لهم على الجليد لمدة 10 دقيقة أخرى.
    3. إضافة 5 مل من RB وأجهزة الطرد المركزي لمدة 8 دقائق في 180 x ج و 4 درجات مئوية (باستخدام تخفيض تسارع / 4 والتباطؤ / 2).
    4. Resuspend الخلايا في 400 ميكرولتر من RB وإضافة 10 ميكرولتر من ميكروبيدات مكافحة البيوتين. احتضان العينة لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. لا تتجاوز فترة حضانة، لأن هذا يقلل من نقاء العينات.
    5. إضافة 5 مل من RB وأجهزة الطرد المركزي لمدة 8 دقائق في 180 x ج و 4 درجات مئوية (باستخدام تخفيض تسارع / 4 والتباطؤ / 2). resuspend الكرية في 1 مل من RB.
  2. عزل gp38 + الأسلاف
    1. بعد الخطوة 5.9، عد الخلايا، كما هو موضح في الخطوة 3، و resuspend ما يصل الى 10 6 خلايا (عادة تجميع 4-6 عينات الكبد السليمة) في 100 ميليلتر من RB.
    2. إضافة مكافحة CD64 1: 100 ومعاداة CD16 / 32 1: 100 إلى الخلايا واحتضان لهم على الجليد لمدة 5 دقائق. التالي، إضافة 1:100 المضادة للgp38 البيروكسيديز الأجسام المضادة للخلايا واحتضان لهم على الجليد لمدة 10 دقيقة أخرى.
    3. إضافة 5 مل من RB وأجهزة الطرد المركزي لمدة 8 دقائق في 180 x ج و 4 درجات مئوية (باستخدام تخفيض تسارع / 4 والتباطؤ / 2).
    4. Resuspend الخلايا في 400 ميكرولتر من RB وإضافة 5 ميكرولتر من ميكروبيدات مكافحة البيوتين. احتضان العينة لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. لا تتجاوز فترة حضانة، لأن هذا يقلل من نقاء العينات.
    5. إضافة 5 مل من RB وأجهزة الطرد المركزي لمدة 8 دقائق في 180 x ج و 4 درجات مئوية (باستخدام تخفيض تسارع / 4 والتباطؤ / 2).
    6. resuspend الكرية خلية في 1 مل من RB.
  3. الخطوات المشتركة بعد خطوة 6.1 أو 6.2
    1. وضع أنبوب الطرد المركزي مخروطي 15 مل تحتوي على تعليق خلية وصفت مغناطيسيا على البرد 5 رف مع اثنين من أنابيب فارغة إضافية لجمع الكسور الإيجابية والسلبية. وضع رف البرد على منصة فصل الفاصل.
    2. استخدام برنامج اختيار إيجابي(Possel_d2) مع خطوة الغسيل واسعة بين كل (الخيار شطف) عينة.
      ملاحظة: استخدام القائمة على أعمدة يدوي فصل الخلايا بدلا من الفاصل التلقائي سوف يقلل من نقاء العينة.
    3. جمع جزء إيجابي وأجهزة الطرد المركزي لمدة 8 دقائق في 180 x ج و 4 درجات مئوية (باستخدام تخفيض تسارع / 4 والتباطؤ / 2).
    4. Resuspend وبيليه الخلية إما في RB أو عازلة ST، وهذا يتوقف على إجراء مزيد من التجارب.
    5. لفحص نقاء، واتخاذ قسامة من الخلايا وصمة عار لهم كما هو موضح في الخطوة 4.

7. التدفق الخلوي الفرز الخلية

ملاحظة: هناك نوع عالية النقاء من أي خلية فرعية السلف يمكن أن يتحقق مع البروتوكول هو موضح أدناه. العائد الكلي للخلايا هو أقل بكثير من تلك التي وصفها في الخطوة 6 و هو أفضل لتحليل التعبير الجيني.

معامل ضبط
فوهة الحجم 85 ميكرون
تكرر 46،00-46،20
سعة 38،30-55،20
مرحلة 0
انخفاض تأخير 28،68-28،84
تخفيف إيقاف
قطرة الأول 284-297
الهدف الفجوة 9. 14
الضغط 45 رطل

الجدول 3.

  1. الحصول على الخلايا من تخصيب مقرها المغناطيسي (كما هو موضح في الخطوة 5)؛ الاعتماد عليها، كما هو موضح في الخطوة 3؛ وصمة عار لهم لعلامات السلف (CD133، gp38)، CD31، CD45 ASGPR1 و، كما هو موضح في الخطوة 4.
  2. إعداد فرز المتوسطة (SM): الفينول الأحمر مجانا Dulbecشارك في التعديل المتوسطة النسر (DMEM) تحتوي على 0.5٪ (ت / ت) BSA و 0.01٪ (ت / ت) أزيد الصوديوم. resuspend الخلايا الملون في SM، نقلها إلى البولي بروبلين أنبوب جولة القاع، ووضعها على الجليد.
    ملاحظة: أزيد الصوديوم عالية السمية. استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة، مثل القفازات النتريل، معطف المختبر، وقناع الوجه. لا تستخدم أزيد الصوديوم في حالة استخدام الخلايا مرتبة لفحوصات وظيفية.
  3. استخدام البرنامج المناسب لنوع فارز تستخدم لعزل الخلايا. فتح البرنامج واتبع إرشادات الشركة المصنعة لإعداد المعلمات الفرز ومواصفات الجهاز.
    ملاحظة: يتم تلخيص مواصفات الجهاز في الجدول 3. في حين مواصفات الجهاز يمكن أن تكون مختلفة في المؤسسات المختلفة، فمن المهم الإشارة إلى أن الحد من الضغط الفرز وحجم أكبر فوهة ضروري (45 رطل وفوهة 85 ميكرون) لزيادة قابلية الخلية السلف populatأيون ونوعية الحمض النووي الريبي أعدت من الخلايا فرزها. من المهم أن استخدام الخلايا الاولية الكبد المخصب لتحديد التعويض. الكبد أو الكريات البيض الشعوب الأخرى ومختلفة لصناعة السيارات في مضان ونتيجة في قرار دون المستوى الأمثل من السكان انسجة وفي استراتيجية النابضة كاذبة.
  4. معايرة الجهاز ووضع 5 مل البولي بروبلين أنبوب جولة القاع التي تحتوي على 350 ميكرولتر من SM في الجهاز جمع القبيل. بدء اكتساب العينة والنوع. جمع 1000 أحداث حيوانية ووقف تدفق العينة.
  5. أن الأنبوب من جهاز فرز وقياس الخلايا التي تم فرزها على قياس التدفق الخلوي. تحديد النسبة المئوية من السكان خلية فرزها الحالي بين الخلايا الحية. هذه النسبة تعطي نقاء للخلايا فرزها.
  6. إذا تجاوز نوع نقاء 95٪، وضع 5 مل البولي بروبلين أنبوب جولة القاع التي تحتوي على 350 ميكرولتر من تحلل العازلة RLT في الجهاز جمع القبيل.
  7. بدء فرز وجمع 7،000-10000 الأحداث في حيوانية اللحمية.
  8. نقل العازلة تحلل RLT تحتوي على خلايا مرتبة في أنبوب رد فعل DNase- وريبونوكلياز خالية وتخزين العينات في -80 درجة مئوية حتى مزيد من التحليل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

الإجراء المقدمة هنا لهضم الكبد باستخدام مزيج رواية النتائج الانزيمات في تعليق وحيد الخلية التي تحتوي على متني وخلايا الكبد غير متني (الشكلان 1 و 2A). بعد ACK-الناشر خلايا الدم الحمراء، والتدفق المباشر الخلوي تحليل تعليق وحيد الخلية هو ممكن (الشكلان 1 و 2). تتضمن الاستراتيجية النابضة استبعاد الحلل والخلايا الميتة (الشكل 2A). هي بوابات الخلايا التي هي سلبية للCD45، C...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

التهاب الكبد والإصابة من أصول مختلفة تؤدي عمليات التجدد في الكبد التي تصاحبها التوسع خلية سلفية وتفعيل 2 و 3. هذه الخلايا الاصلية الكبد تمتلك وقف خصائص الخلية، ومن المرجح تلعب دورا هاما في ميكانيكية حدوث أمراض الكبد المختلفة.

منذ فترة طويلة واقترح عدم تجانس الخلايا الاولية الكبد. إعادة تقييم من مجموعات فرعية السلف الكبد باستخدام مزيج علامة السطح رواية CD1...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل من قبل جائزة Kovalevskaja مؤسسة Sofja الكسندر فون همبولت إلى فلك.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
RPMILife Technologies21875-034
الفينول الأحمر الخالي من الفينولDMEM Life Technologies31053-028
FBSLife Technologies10270-106
Collagenase PSigma-Aldrich11249002001
DNAse-ISigma-Aldrich10104159001
DispaseLife Technologies17105041
ACK Lysing BufferLife TechnologiesA10492-01
HBSSLife Technologies14025-050
PBSSigma-AldrichD8537
Sodium AzideSigma-AldrichS2002تحضير محلول مخزون
1٪ 10٪ BSAMiltenyi Biotec130-091-376
autoMACS محلول الشطفMiltenyi Biotec130-091-222إضافة 0.5٪ (حجم حجم / حجم) BSA وتخزينها على الثلج
خالية من الفينول الأحمر DMEMSigma-AldrichD1145
عد الخرز BrightLife TechnologiesC36950
PIMiltenyi Biotec130-093-233
كاشف حجب FCRMiltenyi Biotec130-092-575
المضادة ل CD31 MicroBeadsMiltenyi Biotec130-097-418
المضادة ل CD45 MicroBeadsMiltenyi Biotec130-052-301
طقم إزالة الخلايا الميتةMiltenyi Biotec130-090-101
MicroBeads المضادة للبيوتينMiltenyi Biotec130-090-485
CD64 تنقيةBioLegend139302التخفيف: 1:100
CD16 / 32 تخفيفBioLegend101302المنقى: 1:100
CD45 APC / Cy7BioLegend103116التخفيف: 1: 200 ، يشير إلى خلايا الدم
CD31 BiotinBioLegend102504التخفيف: 1: 200 ، علامات الخلايا البطانية
ASGPR1 تنقيةBio-TechneAF2755-SPالتخفيف: 1:100 ، علامات خلايا الكبد
Podoplanin APCBioLegend127410التخفيف: 1: 1،400 ، علامات الخلايا السلفية
Podoplanin BiotinBioLegend127404التخفيف: 1: 1،400
CD133 PEMiltenyi Biotec130-102-210استخدام 3 & micro ؛ L ، علامات الخلايا السلفية
CD133 BiotinBioLegend141206التخفيف: 1:100
CD34 BiotineBioScience13-0341-81التخفيف: 1:100
CD90.2 Pacific BlueBioLegend140306التخفيف: 1:800
CD157 PEBioLegend140203التخفيف: 1:600
EpCAM Brilliant Violet 421BioLegend118225التخفيف: 1:100
Sca-1 BiotinMiltenyi Biotec130-101-885استخدام 10 & micro; L
ماوس IgG2b ، & PEBioLegend400311
Rat IgG1 PEBioLegend400407
Rat IgG2b ، & kappa ؛ APC / Cy7BioLegend400624
الفئران IgG2a ، & kappa ؛ البيوتينBioLegend400504
الفئران IgG2a, & كابا; بريليانت البنفسجي 421BioLegend400535
الهامستر السوري IgG APCBioLegend402012
الهامستر السوري IgG BioLegendBioLegend402004
Normal Goat IgG Control منقىBio-TechneAB-108-C
حمار مضاد للماعز IgG Alexa Fluor 488Life TechnologiesA11055التخفيف: 1:800
ستربتافيدين أليكسا فلور 405لايف تكنولوجيزS32351التخفيف: 1: 400
100 & م شبكة مرشحA. HartensteinPAS3
LS العمودMiltenyi Biotec130-042-401
QuadroMACSMiltenyi Biotec130-090-976
محلل MACuant 10Miltenyi Biotec130-096-343
فاصل AutoMACS ProMiltenyi Biotec130-092-545
FACS AriaTMIIIBD Biosciences
FACSDiva sofwareBD Biosciences
البولي بروبيلين أنبوب دائري القاعFalcon352063
Rneasy plus mini kitQiagen74134RLT يتم تضمين عازلة التحلل
فاصل

المراجع

  1. Dolle, L., et al. Successful isolation of liver progenitor cells by aldehyde dehydrogenase activity in naive mice. Hepatology. 55 (2), 540-552 (2012).
  2. Dolle, L., et al. The quest for liver progenitor cells: a practical point of view. J Hepatol. 52 (1), 117-129 (2010).
  3. Dorrell, C., et al. Surface markers for the murine oval cell response. Hepatology. 48 (4), 1282-1291 (2008).
  4. Gouw, A. S., Clouston, A. D., Theise, N. D. Ductular reactions in human liver: diversity at the interface. Hepatology. 54 (5), 1853-1863 (2011).
  5. Tarlow, B. D., Finegold, M. J., Grompe, M. Clonal tracing of Sox9+ liver progenitors in mouse oval cell injury. Hepatology. 60 (1), 278-289 (2014).
  6. Shin, S., et al. Foxl1-Cre-marked adult hepatic progenitors have clonogenic and bilineage differentiation potential. Genes Dev. 25 (11), 1185-1192 (2011).
  7. Furuyama, K., et al. Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine. Nat Genet. 43 (1), 34-41 (2011).
  8. Font-Burgada, J., et al. Hybrid Periportal Hepatocytes Regenerate the Injured Liver without Giving Rise to Cancer. Cell. 162 (4), 766-779 (2015).
  9. Kuramitsu, K., et al. Failure of fibrotic liver regeneration in mice is linked to a severe fibrogenic response driven by hepatic progenitor cell activation. Am J Pathol. 183 (1), 182-194 (2013).
  10. Pritchard, M. T., Nagy, L. E. Hepatic fibrosis is enhanced and accompanied by robust oval cell activation after chronic carbon tetrachloride administration to Egr-1-deficient mice. Am J Pathol. 176 (6), 2743-2752 (2010).
  11. Spee, B., et al. Characterisation of the liver progenitor cell niche in liver diseases: potential involvement of Wnt and Notch signalling. Gut. 59 (2), 247-257 (2010).
  12. Eckert, C., et al. Podoplanin discriminates distinct stromal cell populations and a novel progenitor subset in the liver. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310 (1), G1-G12 (2016).
  13. Epting, C. L., et al. Stem cell antigen-1 is necessary for cell-cycle withdrawal and myoblast differentiation in C2C12 cells. J Cell Sci. 117 (Pt 25), 6185-6195 (2004).
  14. Tirnitz-Parker, J. E., Tonkin, J. N., Knight, B., Olynyk, J. K., Yeoh, G. C. Isolation, culture and immortalisation of hepatic oval cells from adult mice fed a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Int J Biochem Cell Biol. 39 (12), 2226-2239 (2007).
  15. Rountree, C. B., et al. A CD133-expressing murine liver oval cell population with bilineage potential. Stem Cells. 25 (10), 2419-2429 (2007).
  16. Rountree, C. B., Ding, W., Dang, H., Vankirk, C., Crooks, G. M. Isolation of CD133+ liver stem cells for clonal expansion. J Vis Exp. (56), (2011).
  17. Sidney, L. E., McIntosh, O. D., Hopkinson, A. Phenotypic Change and Induction of Cytokeratin Expression During In Vitro Culture of Corneal Stromal Cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7225-7235 (2015).
  18. Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Commun Signal. 9, 12(2011).
  19. Schmelzer, E., et al. Human hepatic stem cells from fetal and postnatal donors. J Exp Med. 204 (8), 1973-1987 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CD45 CD31 ASGPR1 GP38 CD133

مقالات ذات صلة