إنتاج القراد المختبرية صحية القراد هو ضروري للدراسات على البيولوجيا القراد، والتفاعلات الممرض القراد. هنا علينا أن نبرهن على بروتوكول بسيط لتغذية غير ناضجة القراد الذي هو فعالة من حيث التكلفة وأقل إرهاقا للفئران.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
إيكسوديس كتفي ، ناقلات مرض لايم، هي واحدة من ناقلات الأمراض الأكثر أهمية في شرق وغرب الولايات المتحدة الأمريكية. هذا النوع هو ثلاثة مضيف القراد الذي يتطلب وجبة الدم من المضيف الفقاريات لكل مرحلة التطوير، والإناث البالغات تتطلب وجبة الدم للاستنساخ. القراد اليرقات تعلق على مضيفهم لمدة 3-5 أيام للتغذية وإسقاط قبالة المضيف عندما إنكورجيد تماما. هذا الاعتماد على العديد من المضيفين مختلفة ووقت المرفقة طويلة لالتحام يعقد تعقيد القراد في إعداد المختبر. ومع ذلك، لفهم علم الأحياء القراد والتفاعلات الممرض القراد، وإنتاج القراد صحية، والمختبرات تربيته أمر ضروري. هنا، علينا أن نبرهن على بروتوكول بسيط وفعالة من حيث التكلفة للقراد غير ناضجة التغذية على الفئران. قمنا بتعديل البروتوكولات القائمة لانخفاض الضغط على الفئران وزيادة القراد نجاح التغذية والبقاء على قيد الحياة باستخدام أقفاص المتاح دون قيعان شبكة لتجنب الاتصال من القراد وايث المياه الملوثة مع الفئران البول والبراز.
المقدمة
القراد والطفيليات الخارجية لدم تلزم من الفقاريات وتوزع في جميع أنحاء العالم. في الولايات المتحدة، لا يقل عن 11 نوعا من القراد هي ناقلات الجراثيم ذات الأهمية للصحة العامة 1. اللبود الكتفي هو المسؤول عن نقل العديد من مسببات الأمراض مثل العوامل المسببة للمرض لايم (بوريليا برغدورفيرية) الحمى الراجعة (B. miyamotoi)، anaplasmosis المحببات البشري (Anaplasma phagocytophilum)، والبابيزيا (بابيزيا النيابة.). وعلى الرغم من أهمية I. الكتفي بمثابة ناقلات الأمراض، وجمع هذه العناكب في وفرة من البرية للدراسات في المختبر ليست دائما ممكنة. ولذلك، فإن إنتاج القراد تربى مختبر صحي ضروري لدراسات في علم الأحياء القراد، والتفاعلات الممرض القراد.
دورة حياة كل القراد الصلب (الأسرة اللبوديات)، بما في ذلك I. الكتفي، تتكون من البيض وثلاثة أكتيفe مراحل: اليرقة، الحورية، والكبار. تتغذى كل مرحلة نشطة على مضيف الفقاريات. التفاعلات المعقدة التي تحدث بين القراد ومضيفيهم على مدى عدة أيام من التعلق والتغذية يكاد يكون من المستحيل تكرار باستخدام المغذيات الاصطناعية، ومن غير المرجح أن توفر ما يكفي من الأرقام من القراد تغذية للتربية الجماعية 2 ، 3 ، 4 . لذلك، يتم استخدام الفئران الحية والأرانب في كثير من الأحيان كمضيفات لتربية غير ناضجة (اليرقات والحوريات)، ومراحل ناضجة (البالغين) من القراد، على التوالي. متطلبات مضاعفات متعددة لتغذية الدم خلال كل مرحلة تنموية تعقيد زراعة القراد، وهو الوقت والتكلفة مكثفة 5 ، 6 ، 7 . تتطلب معظم بروتوكولات تربية القراد حفظ الفئران في قفص الطابق شبكة الأسلاك المعلقة 7 ، 8 أو في كا أسطوانيغي من هذه الأبعاد أن الحيوان لا يمكن أن تتحرك بحرية والعريس نفسه 6 ، 9 ، 10 .
يتم نقل هذه الأقفاص أسطوانية في وقت لاحق إلى قفص الأحذية مع شبكة الأسلاك. إنغورجد، ثم يتم جمع القراد منفصلة من الماء تحتها. ومع ذلك، يؤدي هذا الأسلوب في تعريض القراد تغذية للمياه الملوثة بالبول والبراز التي يمكن أن تزيد من النمو الفطري والوفيات القراد 9 . وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يزيد من إمكانية القراد الهروب من الحوض المائي، فضلا عن التسبب في الإجهاد على الفئران. للتحايل على هذه المشاكل، ونحن هنا تظهر القراد اليرقات التغذية على الفئران داخل البلاستيك صندوق الأحذية من نوع أقفاص القابل للتصرف. هذه الطريقة تسمح للسلوك الطبيعي من الفئران، ويزيد الانتعاش القراد إنغورجد، ويقلل من الوفيات القراد بسبب التلوث.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
الموافقة على البروتوكول (رقم 00682) المبينة أدناه من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) في جامعة نيفادا رينو ويتبع المبادئ التوجيهية من جامعة نيفادا والحيوان جنة أخلاقيات البحث رينو. باختصار، كانت تخدير الفئران مع isoflurane وكانت تستخدم مخروط الأنف للحفاظ على مستويات الأيزوفلورين مستمرة لمدة 20 دقيقة. تم استخدام مرهم بيطري لمنع جفاف العيون تحت التخدير. وقد استخدم قرصة اصبع القدم للتأكد من مستوى التخدير وتم قياس معدل التنفس في جميع أنحاء الإجراء. تم الاحتفاظ بها الفئران في أقفاص الفردية ومراقبتها حتى استعاد وعيه. واستخدمت الفئران مرة واحدة فقط لتغذية القراد وكان الموت الرحيم آخر القراد الانتعاش. تم تنفيذ القتل الرحيم من قبل مختبر الموظفين العاملين الطب الحيواني. واستخدمت CO 2 والتفكك عنق الرحم عن القتل الرحيم للحيوانات.
ملاحظة: العمل على القراد يتطلب استخدام مكافئ الحماية الشخصية كاملةuipment. لعد القراد غير الناضجة، وارتداء معاطف المختبر الأبيض، وقفازات النتريل طويلة لتغطية فتح الأكمام من معطف المختبر توج مع العصابات المطاطية، وأحذية مغلقة اصبع القدم. لإصابة الفئران مع القراد، واستخدام شبكة الشعر، والمآزر المتاح، وقفازات طويلة الأكمام على الأكمام، ويغطي القدم. استخدام المآزر البيضاء أو الخفيفة الملونة للكشف عن القراد الضال. افحص القفازات والأكمام بشكل دوري للقراد.
1. إعداد غرفة للإسكان الحيوان
- تعيين غرفة منفصلة لإيواء الفئران المصابة بالقراد. وضع حصيرة لزجة أو على الوجهين الشريط السجاد خارج وداخل الباب لمنع عرضي الهروب القراد.
2. عد القراد للماوس الإصابة
- وضع الشريط على الوجهين في جميع أنحاء حواف أعلى من 7 "× 5" × 14 "حاوية بلاستيكية وملء بالماء إلى حوالي 2 سم.
- وضع مربع صغير آخر أو طبق بتري في وسط الحاوية وملء بالماء إلى 1 سم خلق &# 34؛ خندق "حول هذه الحاوية
- تخزين القارورة التي تحتوي على اليرقات أو الحوريات داخل طبق بتري.
- استخدام فرشاة الطلاء غرامة لإزالة اليرقات أو الحوريات من قارورة والعد تحت المجهر. عد 50 اليرقات أو 25 الحوريات في قوارير التلألؤ منفصلة. تغطية قارورة على الفور مع شبكة النايلون أو شاشة قماش الأورجانزا وإغلاق مع العصابات المطاطية.
3. إصابة الفئران مع القراد غير ناضجة
- استخدم مقعد عمل أبيض أو خفيف اللون وقم بإحكام الشريط على الوجهين حول محيط منطقة العمل.
- تخدير الماوس مع إيسوفلوران. التحقق من مستوى التخدير من قبل أخمص القدمين قرصة. مرة واحدة تخدير، ونقل الماوس إلى وسادة التدفئة مغطاة المناشف الورقية ونعلق على مخروط الأنف لاستمرار إيسوفلوران العرض.
- تطبيق مرهم النفط القائمة على هلام العين لتجنب جفاف. لاحظ نمط التنفس من الماوس لضبط مستويات الأيزوفلورين (80 - 230 الأنفاس في الدقيقة أمر طبيعي.، خفض مستوى الأيزوفلورين إذا برإيثينغ معدل أقل من 80 نفسا في الدقيقة لتجنب قتل الحيوان).
- تأخذ قارورة واحدة من 50 اليرقات أو 25 الحوريات ووضع القراد تحت الفراء على الرأس بين الأذنين مع فرشاة الطلاء ( الشكل 1 ). الحفاظ على الماوس تحت التخدير لمدة 20 دقيقة بعد التنسيب لإعطاء ما يكفي من الوقت للقراد نعلق.
- حرك الماوس إلى معيار، حذاء من البلاستيك مربع من نوع قفص الماوس القابل للتصرف مع الأغطية الساكنة والفراش الأبيض. توفير اللعب والماء، والغذاء ليبيتوم الإعلانية وفقا للرعاية الماوس العادية.
- تخزين قفص الماوس داخل الفئران أكبر أو قفص جيربيل اصطف مع شريط لاصق على الوجهين حول حواف أعلى. ملء القفص الخارجي مع 3 سم من الماء ( الشكل 2 ).
4. جمع القراد من الفئران
- القراد غير الناضجة فصل بين أيام 3 و 6 من التغذية. تحقق من الأقفاص وخندق المياه للقراد إنغورجد كل يوم بعد يوم 3.
- جمع القراد منفصلة من القفص بين أيام 4 و 6. استخدام الألمر فرشاة أو ملقط لينة لالتقاط القراد إنغورجد وتخزينها في قوارير التلألؤ نظيفة توج مع شبكة قماش النايلون المضمون مع العصابات المطاطية.
- تخدير وفحص الماوس في يوم 7 عن أي القراد المتبقية المرفقة.
- تحقق من الفراش، الحوض الغذائي، وزجاجة المياه للقراد إنكورجيد في يوم 7. الموت ببطء الفئران بعد الإجراء كما هو موضح أعلاه. الأوتوكلاف أقفاص القابل للتصرف، والفراش، وزجاجة المياه، وحوض الغذاء لتجنب أي الهروب القراد أونفيد.
5. تخزين الاحتياطي الفيدرالي القراد
- الحفاظ على القراد إنكورجد في 90٪ الرطوبة، 20 ° C، و 12:12 ضوء: دورة مظلمة في الرطوبة ودرجة الحرارة حاضنة تسيطر حتى يحدث مولتينغ. قد يستغرق ذلك ما بين 12 و 18 أسبوعا تقريبا.
- في حين أن الرطوبة العالية تعزز البقاء على قيد الحياة القراد، كما أنه يجعل القراد عرضة للفرط الفطري. تحقق القراد تغذية تحت المجهر مرة واحدة على الأقل في الأسبوع للعفن. إذا تم الكشف عنها، وغسل الناجين في الايثانول 70٪ لمدة 5دقيقة، شطف في الماء، ونقل إلى ورقة مرشح لتجف، وينقل إلى قارورة نظيفة جديدة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
قمنا بتعديل بروتوكولات تربية القراد الحالية 6 ، 10 لتحسين كفاءة التغذية وخفض الضغط على المضيف الماوس. وأظهرت النتائج أن أقفال الماوس نمط صندوق الأحذية القياسية هي مناسبة تماما لتربية القراد. وفرت الفراش الأبيض تباين جيد لسهولة جمع القراد تغذية. صعدت معظم القراد جدران الحاويات بعد التغذية وكان من السهل جمعها. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الغطاء المجهز الضيق من الصناديق البلاستيكية التي يمكن التخلص...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
خطوات حاسمة في إطار بروتوكول
من المهم أن يكون لديك عدة مستويات من تدابير السلامة عند تربية القراد لتجنب هروب عرضي. استخدام شريط لاصق وخندق المياه حاسمة لضمان السلامة. فمن المهم للحفاظ على الماوس تخدير على وسادة التدفئة للحفاظ على ثبات درجة حرارة الجسم. كما وجدنا أن حلق الماوس لا تقدم أي فائدة إضافية لمرفق القراد. يمكن الاحتفاظ الماوس الفردي في نفس القفص لمدة أسبوع واحد في المعينة "غرفة القراد" الذي فرض الم...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
يقر المؤلفون بالمساعدة من طاقم طب المختبر ، جامعة نيفادا ، رينو. تلقت MM تمويلا من Nevada INBRE.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مرهم Puralube البيطري | أمازون | متوفر من أي متجر للحيوانات الأليفة أو متجر عبر الإنترنت | |
| قفص فأر يمكن التخلص منه | ؛ مبتكر ، سان دييغو ، كاليفورنيا ؛ | MV 2 | مجموعة من القاع والغطاء |
| ألفا دري الفراش | توريد المختبر ، فورت وورث ، تكساس | & nbsp ؛ ألفا دري & تجارة; |
المراجع
- Gleim, E. R., et al. Factors associated with tick bites and pathogen prevalence in ticks parasitizing humans in Georgia, USA. Parasites & Vectors. 9 (125), Available from: http://doi.org/10.1186/s13071-016-1408-6 1-13 (2016).
- Krober, T., Guerin, P. M. In vitro feeding assays for hard ticks. Trends Parasitol. 23 (9), 445-449 (2007).
- Kuhnert, F. Feeding of Hard Ticks In Vitro: New Perspectives for Rearing and for the Identification of Systemic Acaricides. ALTEX. 13 (2), 76-87 (1996).
- Voigt, W. P., et al. In vitro feeding of instars of the ixodid tick Amblyomma variegaturn on skin membranes and its application to the transmission of Theileria mutans and Cowdria ruminantium. Parasitol. 107, 257-263 (1993).
- Gregson, J. D. Ticks. Insect Colonization and Mass Production. Smith, C. N. , Academic Press. New York. 49-72 (1966).
- Sonenshine, D. E. Biology of Ticks. 2, Oxford University Press. New York. (1993).
- Bouchard, K. R., Wikel, S. K. Care, maintenance, and experimental infestation of ticks in the laboratory setting. Biology of Disease Vectors. Marquaedt, W. C. , Elsevier. New York. 705-711 (2005).
- Schumaker, T. S., Barros, D. M. Life cycle of Ornithodoros (Alectorobius) talaje. (Acari:Argasidae) in laboratory. J Med Entomol. 32, 249-254 (1995).
- Banks, C. W., Oliver, J. H., Hopla, C. E., Dotson, E. M. Laboratory life cycle of Ixodes woodi (Acari:Ixodidae). J. Med. Entomol. 35, 177-179 (1998).
- James, A. M., Oliver, J. H. Jr Feeding and host preference of immature Ixodes dammini,I.scapularis,and I.pacificus.(Acari:Ixodidae). J. Med. Entomol. 27, 324-330 (1990).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
