مقالة منهجية

طرق لدراسة النقل طلائي وظيفة البروتين والتعبير في الأمعاء الأصلية وكاتشو-2 الخلايا المزروعة في 3D

DOI:

10.3791/55304

⸱

مارس 16, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Illinois at Chicago, 2Department of Research, Jesse Brown VA Medical Center

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

إشعار تصحيح

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وصفنا طرق بسيطة لدراسة تنظيم نقل السيروتونين في الأمعاء وظيفة (سرت) والتعبير عن الرأي في المختبر خلية نموذج ثقافة كاتشو-2 الخلايا المزروعة في 3D ونموذج المجراة سابقا من الأمعاء الماوس. هذه الأساليب قابلة للتطبيق لدراسة النقل الظهارية الأخرى.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ظهارة الأمعاء لها وظائف النقل وحاجز الهامة التي تلعب دورا رئيسيا في الوظائف الفسيولوجية الطبيعية للجسم في الوقت الذي توفر حاجزا أمام الجسيمات الأجنبية. ارتبط النقل الظهارية ضعف (أيون، والمواد الغذائية، أو المخدرات) مع العديد من الأمراض ويمكن أن يكون لها عواقب تتجاوز الوظائف الفسيولوجية الطبيعية للنقل، مثل من خلال التأثير على سلامة الظهارية وmicrobiome القناة الهضمية. فهم وظيفة وتنظيم البروتينات النقل هو أمر حاسم لتطوير التدخلات العلاجية تحسينها. التحدي الأكبر في دراسة النقل الظهارية بوضع نظام نموذج مناسب الذي يلخص الميزات الهامة للخلايا الظهارية في الأمعاء الأم. وتستخدم عدة نماذج زراعة الخلايا في المختبر، مثل كاتشو-2، T-84، والخلايا HT-29-Cl.19A عادة في البحوث النقل الظهارية. هذه خطوط الخلايا تمثل المقاربة الاختزالية لنمذجة هوقد استخدمت pithelium وفي العديد من الدراسات الميكانيكية، بما في ذلك فحصها من التفاعلات الظهارية الميكروبي. ومع ذلك، الطبقات الوحيدة الخلية لا تعكس بدقة التفاعلات خلية خلية والمكروية في الجسم الحي. وقد أظهرت الخلايا المزروعة في 3D لتكون واعدة نماذج لدراسات نفاذية المخدرات. وتبين لنا أن كاتشو-2 الخلايا في 3D يمكن استخدامها لدراسة النقل الظهارية. ومن المهم أيضا أن الدراسات في الخلايا كاتشو-2 وتستكمل مع نماذج أخرى لاستبعاد خلية آثار محددة وأن تأخذ في الاعتبار تعقيد الأمعاء الأصلي. وقد استخدمت عدة طرق في السابق لتقييم وظائف النقل، مثل كيس مقلوبة وامتصاص في الخلايا الظهارية المعزولة أو في عزلة حويصلات غشاء البلازما. مع الأخذ بعين الاعتبار التحديات في هذا المجال مع الاحترام لنماذج وقياس وظيفة النقل، وعلينا أن نظهر هنا بروتوكول لتنمو كاتشو-2 الخلايا في 3D ووصف استخدام لغرفة أوسينج باعتبارهانهج فعال لقياس نقل السيروتونين، كما هو الحال في الظهارة المعوية الاستقطاب سليمة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم تجهيز ظهارة الأمعاء مع بروتينات النقل المختلفة (القنوات، ATPases، وشارك في النقل والمبادلات) التي تؤدي وظائف عديدة بدءا من امتصاص المواد الغذائية، الشوارد، والأدوية لإفراز السوائل والأيونات في التجويف. بروتينات النقل توليد التدرجات الكهروكيميائية التي تسمح حركة الأيونات أو الجزيئات بطريقة اتجاهي. ويتحقق ذلك عن طريق توزيعات غير المتماثلة لنظم النقل في الأغشية القمية وbasolateral من الخلايا الظهارية الاستقطاب. وبالإضافة إلى ذلك، منعطفات ضيقة، الذي حبل الخلايا الظهارية المجاورة، وتلعب دورا هاما في هذه العملية بمثابة حاجز لنشر intramembrane من المكونات بين المجالات غشاء قمي وbasolateral. نظم نموذج محاكاة مناسبة هذه السمات المميزة للأمعاء الأصلي (أي القطبية، والتمايز، وسلامة تقاطع ضيقة) هي الحاسمة لدراسة functionality أنظمة النقل الظهارية.

وفيما يتعلق النماذج، وخطوط الخلايا التقليدية المستخدمة حاليا في مجال البحوث النقل الظهارية في الأمعاء هي كاتشو-2، وهذا نموذج من متباينة تماما، الاستيعابية الخلايا الظهارية في الأمعاء الصغيرة؛ والخلايا T84 أو HT-29 subclones، ونماذج من المشتقة من سرداب كبيرة الخلايا الظهارية في الأمعاء 1. تقليديا، وتزرع هذه خطوط الخلايا كما الطبقات الوحيدة في الأسطح البلاستيكية أو في إدراج transwell المغلفة. عبر أيضا إدراج ثقافة خلية إلى حد ما تشبه البيئة في الجسم الحي من خلال السماح للخلايا الاستقطاب لإطعام basolaterally. ومع ذلك، وجود قيود في نظم الاستزراع 2D التقليدية هو أن يضطر الخلايا على التكيف مع سطح الاصطناعي، شقة، وجامدة. وبالتالي، لا ينعكس تعقيد الفسيولوجية للظهائر الأم بدقة في نظام 2D. وقد تم التغلب على هذا التحديد عن طريق وسائل لزراعة خلايا في 3D في المكروية محددة، مثل mixtur البروتين هلاميةالإلكترونية، التي تحتوي على مجموعة متنوعة من المكونات المصفوفة خارج الخلية 2 و 3. ومع ذلك، يمكن للفي المختبر الثقافات ليس محاكاة تعقيد ظهارة الأمعاء، والتي لديها أنواع خلايا متعددة والهندسة المعمارية الخاصة بكل منطقة في الأمعاء. وهكذا، فإن الدراسات باستخدام نماذج ثقافة الخلية تحتاج إلى مزيد من التحقق من الصحة في الأمعاء الأصلي. باستخدام 3D الثقافة في المختبر الخلايا والأغشية المخاطية المعوية الماوس، وصفنا هنا طرق بسيطة لدراسة تنظيم نقل الأمعاء السيروتونين (SLC6A4، سرت).

ونقل سرت ينظم توافر خارج الخلية من هورمون مهم والعصبي، 5-هيدروكسي (5-HT)، قبل نقله بسرعة من خلال نا + / كلور - عملية معتمد على. سرت هو الهدف معروف عقاقير مضادة للاكتئاب وبرز مؤخرا باعتباره هدفا علاجيا جديدا لاضطرابات الجهاز الهضمي مثل الإسهال والتهاب الأمعاء.طرق للتحقيق امتصاص 5-HT في الخلايا الظهارية في الأمعاء وقد وصفت سابقا. على سبيل المثال، وقد ثبت كاتشو-2 الخلايا المزروعة على دعامات بلاستيكية أو إدراج نفاذية لعرض فلوكستين تراعي 3 H-5-HT امتصاص في كل قمي وbasolateral المجالات 4. كما تم وصف قياس وظيفة سرت في عزل فرشاة الحدود غشاء الحويصلات (BBMVs) التي أعدت من الأمعاء بالأعضاء البشرية المانحة صغيرة من قبلنا 5. تم إنذار 3 امتصاص H-5-HT في BBVMs الإنسان أن يكون فلوكستين حساسة والصوديوم + / كلور - معتمد على، وعرضت حركية التشبع مع ك م من 300 نانومتر 5. استخدام وسائل مماثلة، ونحن أيضا قياس سابقا وظيفة سرت إلى 3 امتصاص H-5-HT في الماوس BBMVs المعوية 6. ومع ذلك، فإن إعداد نقية حويصلات غشاء البلازما يتطلب كمية كبيرة من الغشاء المخاطي الأنسجة. أساليب أخرى، مثل radiogالتصور raphic من 3 مواقع امتصاص H-5-HT، وأيضا ثبت سابقا في خنزير غينيا والفئران الأمعاء الدقيقة 7.

توفر غرفة أوسينج نظام أكثر الفسيولوجية لقياس نقل الأيونات، المواد الغذائية، والمخدرات عبر مختلف الأنسجة الظهارية. والميزة الرئيسية لهذه التقنية غرفة أوسينج هو أنه تمكن من قياس دقيق للالمعلمات الكهربائية ونقل سليمة، ظهارة الأمعاء الاستقطاب. وعلاوة على ذلك، للحد من تأثير الجهاز العصبي العضلي جوهري، تجريد الطبقتين المصلية و العضلية من الغشاء المخاطي في الأمعاء يمكن القيام بها لتحقيق تنظيم النقل في الظهارة 8.

علينا أن نبرهن على كاتشو-2 الخلايا المزروعة في 3D على البروتين هلامي تشكل التجويف جوفاء تعبر عن علامات قمي وbasolateral متميزة. تظهر هذه الخلايا تعبير أعلى من سرت من 2D خلايا كاتشو-2. طرق لتنمو خلايا 3D والمؤسسة العامة لووصف rform المناعية أو RNA والبروتين الاستخراج. وبالإضافة إلى ذلك، نحن تصف أساليب لدراسة وظيفة سرت والتنظيم من قبل TGF-β1، خلوى عديد المظاهر، في الغشاء المخاطي في الأمعاء الصغيرة من خلال الاستفادة من تقنية غرفة أوسينج.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. دراسة المعوية نواقل في نظام الثقافة 3D من كاتشو-2: تزايد 3D كاتشو-2 خلية الثقافة على خليط من البروتين هلامي

  1. عامل النمو ذوبان تخفيض هلامي خليط من البروتين على الجليد لمدة 8 ساعات (أو O / N) في 4 درجات مئوية. إذابة مرة واحدة، وجعل 1 مل أو 500 مكل للاستخدام أو تخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.
  2. يوم الثقافة، precool لوحات ثقافة (لRNA والبروتين الاستخراج) أو الشرائح غرف (لالمناعية) على الجليد. إضافة 30 ميكرولتر من خليط من البروتين هلامي إلى كل بئر من شريحة ثمانية جيدا غرف من الزجاج الملون (أو 120 ميكرولتر لكل بئر من لوحة 6 جيدا) وموزعة بالتساوي. الحرص على عدم توليد فقاعات الهواء أثناء العملية.
  3. ضع الشرائح / لوحات داخل حاضنة الثقافة خلية عند 37 درجة مئوية لمدة 15-30 دقيقة، والسماح للخليط من البروتين هلامي ليصلب.
  4. في حين أن خليط من البروتين هلامي وبدمج، يعرض للتريبسين قارورة متكدسة من خلايا كاتشو-2.
  5. حساب عددمن الخلايا وتدور لهم في 500 x ج في جهاز للطرد المركزي الطاولة لمدة 5 دقائق. إعادة تعليق بيليه خلية في 3D كاتشو-2 متوسطة حسب الحاجة.
  6. البذور الشرائح غرفة زجاجية في 4000 خلية لكل جيدا (لوحات، 20000 لكل بئر). السماح للخلايا أن تنمو في 5٪ CO 2 حاضنة مرطب عند 37 درجة مئوية. تغيير المتوسطة كل 3-4 د.

2. المناعي تلطيخ لطلائي نواقل في 3D كاتشو-2 الخلايا: 1 يوم

  1. نضح المتوسطة وإصلاح الخلايا مع 400 ميكرولتر من 2٪ امتصاص العرق (PFA) (في برنامج تلفزيوني مع تعديل درجة الحموضة إلى 8.5 مع هيدروكسيد الصوديوم) لمدة 30 دقيقة في RT.
    يجب عدم تخزين PFA حل لأكثر من 1 في الاسبوع في 4 درجات مئوية، والحل تقدم طازجة يمكن استخدام: ملاحظة. تنبيه: PFA شديدة السمية ومسرطنة محتملة. التعامل دائما مع الحذر في غطاء الكيميائية واستخدام معدات الوقاية الشخصية.
  2. شطف الآبار مرتين مع 1X برنامج تلفزيوني وتخزين الشرائح في 4 درجات مئوية في برنامج تلفزيوني (400 ميكرولتر /حسنا). مرة واحدة ثابتة، وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى واحد.
  3. تدفئة الشرائح غرفة لRT (وهذا سوف تتصلب هلامي السرير بروتين خليط وتجعل من السهل على نضح خلال خطوات الغسيل).
  4. Permeabilize الخلايا مع 0.5٪ تريتون في برنامج تلفزيوني لمدة لا تزيد عن 15 دقيقة.
  5. إعداد العازلة في برنامج تلفزيوني-جليكاين (130 ملي مول كلوريد الصوديوم، 7 ملي نا 2 هبو 4، 3.5 مم ناه 2 ص 4، و 100 ملي جليكاين). شطف 3X مع برنامج تلفزيوني 1X-الجلايسين لمدة 10 دقيقة لكل منهما في RT.
  6. إعداد عازلة المناعي (IF): 130 مم كلوريد الصوديوم، 7 ملي نا 2 هبو 4، 3.5 مم ناه 2 ص 4، 100 ملي جليكاين، 7.7 ملي نان 3، 0.1٪ BSA، 0.2٪ TritonX-100، و 0.05٪ توين-20 .
  7. غسل 3X في IF العازلة لمدة 10 دقيقة لكل منهما في RT. كتلة في 5٪ مصل الماعز العادي (خ ع) في المخزن IF. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية مخففة في IF + 1٪ مصل الماعز، و 200 ميكرولتر / جيد، ل1 - 2 ساعة عند RT. يغسل مع IF عازلة 3X لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
  8. احتضان مع المضادة الثانويةالجسم (1: 200) المخفف في IF + 1٪ خ ع، 200 ميكرولتر / جيد، لمدة 1 ساعة على RT.
  9. يغسل مع العازلة IF ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة لكل منهما. الحفاظ على الشرائح في الظلام من هذه الخطوة على. رفع غرف البلاستيك من الشرائح الزجاجية عن طريق وضع شريحة غرفة في حامل الأسود وانزلاق رافع البيضاء من خلال حامل حتى الاتصالات حافته حافة الآبار. سحب بلطف صعودا غرف (حامل ورافع ينبغي أن يأتي مع الشرائح الثقافة).
  10. جبل مع بطء المتوسطة مكافحة تتلاشى، واتركه حتى يجف لمدة 10 دقيقة في RT.
  11. مرة واحدة جفت تماما، وختم الشرائح مع طلاء الأظافر وصورة لهم مع المجهر متحد البؤر. تخزين الشرائح في 4 درجة مئوية لمدة أسبوعين أو عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة عدة أشهر.

3. RNA واستخراج البروتين من 3D كاتشو-2 خلايا

  1. علاج الخلايا مثقف على خليط من البروتين هلامي ل12-14 د مع وكيل الاختبار، مثل β1 TGF- (10 نانوغرام / مل، 1 ساعة).
  2. بعد العلاج، وغسل الخلايا مع 1برنامج تلفزيوني ×. تبقي الخلايا على الجليد لمدة 30 دقيقة لتسييل خليط من البروتين هلامي.
  3. غسل الآبار مع المبردة برنامج تلفزيوني وجمع الخلايا في أنابيب الطرد المركزي الفردية. جمع الخلايا باستخدام منخفضة السرعة الطرد المركزي في 500 x ج و 4 درجات مئوية لمدة 10 دقيقة. استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام الإجراءات القياسية واستخدام الوقت الحقيقي RT-PCR.
  4. لاستخراج البروتين، ليز الخلايا باستخدام 1X عازلة خلية تحلل تستكمل مع 1X البروتيني كوكتيل المانع. بعد إضافة عازلة خلية تحلل لبيليه، ليز خلايا صوتنة وإزالة الحطام الخلية بواسطة الطرد المركزي في 7500 x ج و 4 درجات مئوية لمدة 10 دقيقة.

4. قياس 5-HT امتصاص في ماوس الدقاق الاستفادة من غرفة أوسينج: إعداد المعوية والطبقتين المصلية و العضلية تجريد

  1. بعد القتل الرحيم، تشريح الفئران وإزالة الأمعاء الدقيقة (بعد المعدة وقبل الأعور). تقسيم الأمعاء الدقيقة إلى ثلاثة أجزاء. تجاهل ثلث الوسط استخدام ثلث القريبةكما الصائم، واستخدام ثلث البعيدة كما الدقاق. تجنب سحب الأمعاء من تمسكه المساريقي لمنع الأضرار التي لحقت ظهارة. حافظ على قسم الأنسجة البرد بتغطيته مع العازلة الجليد الباردة كريبس الرنين بيكربونات (KBR).
  2. فتح الأمعاء طوليا باستخدام المقص. احتضان أقسام المعوية رفعه حديثا في الجليد الباردة، والغاز، KBR التي تحتوي على 1 ميكرومتر الاندوميتاسين لمدة 10 دقيقة قبل الطبقتين المصلية و العضلية تجريد.
  3. دبوس قسم الأمعاء (~ 1 سم في الطول) الجانب المخاطية وصولا الى لوحة تحتوي على 7٪ الاغاروز أو علاجها المطاط الصناعي سيليكون (0.5 سم سميكة).
  4. تجريد الطبقات الطبقتين المصلية و العضلية تحت مجهر تشريحي تشريح مع الإضاءة السفلية. قطع طبقة الطبقتين المصلية و العضلية باستخدام شفرة ريشة مشرط. استخدام ملقط غرامة للحصول على حافة طبقة على طول المحور الطولي للأمعاء.
    ملاحظة: أثناء إجراء تجريد، والإضاءة السفلية للمجهر تشريحي يساعد على تحديد وتجنب المناطق مع التصحيح باير لوفاق.
  5. بعد الانتهاء من تجريد الطبقتين المصلية و العضلية، تركيب الغشاء المخاطي بعناية على دبابيس من نصف غرفة-Ussing. خلال العملية برمتها، ورعاية لعقد الأنسجة المخاطية تجريده من الحواف لتجنب تمزق.

5. موازنة ومعالجة الأنسجة

  1. يعد حل كريب: 115 مم كلوريد الصوديوم، و 25 ملي NaHCO 3، 2.4 ملي K 2 هبو 4، 1.2 ملي CaCl 2، 1.2 ملي MgCl 2، و 0.4 ملي KH 2 PO 4 في 7.4 درجة الحموضة، ابيدوا 95٪ O 2/5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية. إضافة 10 ملي الجلوكوز إلى الحمام المصلي لتكون بمثابة الركيزة الطاقة و 10 ملي مانيتول إلى الحمام المخاطية للحفاظ على التوازن الاسموزي.
    ملاحظة: يتم استكمال حل كريب مع حمض L-الاسكوربيك (100 ميكرون) وبارغيلين (100 ميكرومتر، أوكسيديز المانع) لمنع تدهور داخل الخلايا 5-HT.
  2. إدراج شريط التمرير الى غرفة لفضح كل من القمي (اللمعية) سيدي و(المصلي) الجانب basolateral من الأنسجة إلى حل كريب.
  3. بعد فترة موازنة من 10 دقيقة، يمهد للمعالجة الأنسجة اللفائفية مع فلوكستين (10 ميكرومتر) لمدة 30 دقيقة على الجانب قمية للمللي J (الغشاء المخاطي إلى المصلي تدفق).
  4. علاج الأنسجة مع TGF-β1 (10 نانوغرام / مل) لمدة 1 ساعة على الجانب basolateral ثم احتضان مع 3 [H] -5-HT (20 نانومتر) لمدة 30 دقيقة على الجانب قمي.

6. الكمي لالأغشية المخاطية للالمصلي الجريان (J مللي ثانية) و 3 [H] تراكم -5-HT في الأنسجة

  1. جمع 0.75 مليلتر مأخوذة من الخزان المصلي (ما مجموعه 5 مل) لقياس النشاط الإشعاعي في عداد التلألؤ السائلة ولحساب-الغشاء المخاطي للالمصلي (J مللي ثانية) معدلات التدفق. ، فلوكستين الحساسة تدفق تمثل سرت بوساطة 3 امتصاص [H] -5-HT.
  2. لتجنب الخلافات الضغط الهيدروستاتيكي عبر الغشاء المخاطي خلال فترة التدفق، أخذ عينات من الجانب المصلي وإعادةوضعها مع وحدات التخزين متطابقة المتوسطة حمام.
    ملاحظة: حساب تدفق بتصحيح للتخفيف من العينة نهاية (4.25 مل / 5 مل = 0.85).
  3. لتقدير حجم 3 [H] -5-HT المتراكمة في الأنسجة، وترجل الغشاء المخاطي من شريط التمرير، ويغسل مرة واحدة مع العازلة KRB الجليد الباردة، ووضعه في أنابيب ثقافة الزجاج.
  4. احتضان الغشاء المخاطي في 0.5 مل من 10٪ KOH بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. قياس النشاط الإشعاعي في 150 مكل من لست] (في يثلث) باستخدام عداد التلألؤ السائل.
  5. استخدام قسامات (3-5 ميكرولتر) من لست] لقياس تركيز البروتين باستخدام طريقة برادفورد.
    ملاحظة: يتم استخدام 10 مل من المتوسط ​​الحضانة التي تحتوي على مادة السيروتونين المشع كمعيار. الاحتفاظ 5-HT في الأنسجة يتم التعبير عن بمول / ملغ من البروتين / دقيقة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويرد المناعية في 3D كاتشو-2 الخراجات في الشكل 1. ويصور صورة تمثيلية من XY-الطائرة تظهر التجويف ترسيمها جيدا في كيس 3D ملطخة الأكتين phalloidin في الشكل 1A. الجانب التي تواجه التجويف يدل على الجانب قمي. خلايا ظهارية في نتيجة بيئة 3D في النمط الظاهري الظهارية قوية. مختلفة كاتشو-2 الخراجات في يوم 12، عندما كانت الأكتين وسرت شارك الملطخة، في الشكل 1B. في هذا التمثيل من XY-طائرة (مختلفة من الطائرة هو مب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد استخدمت متباينة تماما الطبقات الوحيدة كاتشو-2 خلية على نطاق واسع كما الاستقطاب الطبقات الوحيدة الظهارية لدراسة النقل المعوي 10، 11، 12، 13، 14، 15. ومع ذلك، لمحاكاة منظمة الفسيولوجية للخلايا الظهارية في الأمعاء، وكان هناك اهتمام كبير في تطوير ثقافة كاتشو-2 في 3D. وقد وضعت عددا من ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر السيد كريستوفر مانزيلا ، طالب دكتوراه في الطب / دكتوراه في مختبر RKG ، للمساعدة في تحرير مخطوطتنا وتدقيقها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
10x PBSATCCATCC ® ؛ HTB&ss; 37 & التجارة ؛خلايا
10x PBSCarl ZeissMicrosope للتصوير متحد البؤر
3< / sup> [H] -5-HT & nbsp ؛LabtekII152453زراعة الخلايا للفحص المجهري
5-HT & nbsp ؛Gibco70013-032ليست مادة خطرة
95٪ O 2< / sub>- 5٪ CO2< / sub> cylinderKPL71-00-27ليست مادة خطرة
Agar (لألواح أجار)FischerBP151-100سمية حادة ، أورا
أجار (للقطب)SigmaG7126-1KGليست مادة خطرة
Alexa Fluor PhalloidinSigmaC3867-1VLليست مادة خطرة
ألبومين مصل الأبقار (BSA)SigmaP6148-500Gضارة في حالة ابتلاع أو استنشاق
CaCl2< / sub>LifeTechnologiesA12380ليست مادة خطرة
خلايا Caco-2SigmaA8806-5Gليست مادة خطرة
عازلة تحلل الخلاياFischerBP337-100ليس مادة خطرة
الشرائح ChaberedSigmaS5886-1KGليست مادة خطرة
محلول الكولاجين من النوع 1SigmaS8045-500G
أقطابكهربائية SigmaS-0876
EMEMGibco من Life Technologies25200-056
مصل الأبقار الجنيني (FBS)356234 Corningتستخدم كمصفوفة خارج الخلية
فلوكستينكياجين74104
جنتاميسينATCC30-2003وسائط ثقافة الخلية
إشارات خلية الجليسين، دانفرز ، MA
Hepes & nbsp ؛روش11836145001
إندوميتاسينجيبكو من لايف تكنولوجيز15070-063
K2HPO4Gibco by Life Technologies15710-064
KOHGibco by Life Technologies15630-080
L-ascorbic acid Gibco by Life Technologies10082147
عداد التلألؤ السائل  Gibco by Life Technologies70013--032
LSM710 MetaPhysiologic Instruments, San Diego, CA EM-CSYS-8
مانيتولللأدوات الفسيولوجية ، سان دييغو ، كاليفورنيا & nbsp ؛P2304
MatrigelPhysiological Instruments ، سان دييغو ، كاليفورنيا   ؛VCC MC8
MgCl2Physiologic Instruments, San Diego, CA DM MC6
متعدد القنوات الجهد / التيار المشبكالأدوات الفسيولوجية ، سان دييغو ، كاليفورنيا & nbsp ؛P2300
كلوريد الصوديومللأدوات الفسيولوجية ، سان دييغو ، كاليفورنيا   ؛P2023-100
NaClFisher Scientific ، هامبتون ، نيو هامبشنBP1423
NaHCO3< / sub>Sigma-Aldrich ، سانت لويس ، MOS5886
مصل الماعز العادي (NGS ، 10٪) فيشرScientific ، هامبتون ، NHS233
بارافورمالدهيد (PFA)سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوريP288
Pen-StrpSigma-Aldrich ، سانت لويس ، ميزوريC3881
كاشف فحص البروتينسيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري10420
كوكتيل مثبط البروتينازMEDOX ، شيكاغو ، إلينوي & nbsp ؛نمط G- 12300
RNA سهل مجموعة صغيرةSigma-Aldrich ، سانت لويس ، MOM4125
وحدة إدخال القطب الكهربائي أحادية القناة   ؛سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوريA92902
منزلقات لسنبويل تشامبرزسيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوريH9523
فوسفات الصوديوم (Na 2< / sub>HPO4< / sub>)سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، MOF132
هيدروكسيد الصوديوم (NaOH)سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، MOT7039
TGF- & بيتا ؛ 1بيركين إلمر ، والثام ، ماساتشوستسNFT1167250UC
تريتون X-100باكارد إنسترومنتس ، داونر جروف ، إلينويB1600
تريبسين EDTAسيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري221473
توين -20مختبرات بيو راد ، هرقل ، كاليفورنيا5000006
غرفة أوسينج (الغرفة فقط)سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوريI7378
أنظمة غرفة أوسينغسيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوريA1296

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Simon-Assmann, P., Turck, N., Sidhoum-Jenny, M., Gradwohl, G., Kedinger, M. In vitro models of intestinal epithelial cell differentiation. Cell Biol Toxicol. 23 (4), 241-256 (2007).
  2. Shen, C., Meng, Q., Zhang, G. Design of 3D printed insert for hanging culture of Caco-2 cells. Biofabrication. 7 (1), 015003(2014).
  3. Jaffe, A. B., Kaji, N., Durgan, J., Hall, A. Cdc42 controls spindle orientation to position the apical surface during epithelial morphogenesis. J Cell Biol. 183 (4), 625-633 (2008).
  4. Martel, F., Monteiro, R., Lemos, C. Uptake of serotonin at the apical and basolateral membranes of human intestinal epithelial (Caco-2) cells occurs through the neuronal serotonin transporter (SERT). J Pharmacol Exp Ther. 306 (1), 355-362 (2003).
  5. Gill, R. K., et al. Function, expression, and characterization of the serotonin transporter in the native human intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G254-G262 (2008).
  6. Esmaili, A., et al. Enteropathogenic Escherichia coli infection inhibits intestinal serotonin transporter function and expression. Gastroenterology. 137 (6), 2074-2083 (2009).
  7. Wade, P. R., et al. Localization and function of a 5-HT transporter in crypt epithelia of the gastrointestinal tract. J Neurosci. 16 (7), 2352-2364 (1996).
  8. Clarke, L. L. A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (6), G1151-G1166 (2009).
  9. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
  10. Vedeler, A., Pryme, I. F., Hesketh, J. E. Insulin induces changes in the subcellular distribution of actin and 5'-nucleotidase. Mol Cell Biochem. 108 (1), 67-74 (1991).
  11. Botvinkin, A. D., Selimov, M. A., Zgurskaia, G. N., Kulikov, L. G., Aksenova, T. A. [Detection of rabies virus antibodies in human blood serum by an immunoenzyme method]. Vopr Virusol. 31 (3), 333-334 (1986).
  12. Woods, G. L., Mills, R. D. Effect of dexamethasone on detection of herpes simplex virus in clinical specimens by conventional cell culture and rapid 24-well plate centrifugation. J Clin Microbiol. 26 (6), 1233-1235 (1988).
  13. Chase, A. O. Acyclovir for shingles. Br Med J (Clin Res Ed. 295 (6603), 926-927 (1987).
  14. Churchill, P. F., Churchill, S. A., Martin, M. V., Guengerich, F. P. Characterization of a rat liver cytochrome P-450UT-H cDNA clone and comparison of mRNA levels with catalytic activity. Mol Pharmacol. 31 (2), 152-158 (1987).
  15. Steiner, M., Tateishi, T. Distribution and transport of calcium in human platelets. Biochim Biophys Acta. 367 (2), 232-246 (1974).
  16. McClelland, M., Nelson, M., Cantor, C. R. Purification of Mbo II methylase (GAAGmA) from Moraxella bovis: site specific cleavage of DNA at nine and ten base pair sequences. Nucleic Acids Res. 13 (20), 7171-7182 (1985).
  17. Chatterjee, I. shita, K, A., Gill, R. avinder K., Alrefai, W. addah A., Dudeja, P. radeep K. 3D Cell Culture of CaCo2: A Better Model to Study the Functionality and Regulation of Intestinal Ion Transporters. Gastroenterology. 146 (5, Supplement 1), S-654(2014).
  18. Fagg, R. H., Hyslop, N. S. Isolation of a variant strain of foot-and-mouth disease virus (type O) during passage in partly immunized cattle. J Hyg (Lond). 64 (4), 397-404 (1966).
  19. Shilkina, N. P. [The aspects of the problem of systemic vasculitis open to discussion]). Ter Arkh. 61 (12), 102-106 (1989).
  20. Derichs, N., et al. Intestinal current measurement for diagnostic classification of patients with questionable cystic fibrosis: validation and reference data. Thorax. 65 (7), 594-599 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

تصحيح

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

A correction was made to the Authors section in: Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D.

One of the authors' names was corrected from:

Arivarasu N. Anabazhagan

to:

Arivarasu N. Anbazhagan

الوسوم

Caco 2 Cells3D CultureUssing ChamberSerotonin TransportEpithelial TransportIntestinal EpitheliumSERT ProteinWestern BlotImmunofluorescenceCell Culture

مقالات ذات صلة