Method Article

طرق لدراسة النقل طلائي وظيفة البروتين والتعبير في الأمعاء الأصلية وكاتشو-2 الخلايا المزروعة في 3D

DOI:

10.3791/55304

⸱

March 16th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Illinois at Chicago, 2Department of Research, Jesse Brown VA Medical Center

In This Article

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

A correction was made to the Authors section in: Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D.

One of the authors' names was corrected from:

Arivarasu N. Anabazhagan

to:

Arivarasu N. Anbazhagan

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وصفنا طرق بسيطة لدراسة تنظيم نقل السيروتونين في الأمعاء وظيفة (سرت) والتعبير عن الرأي في المختبر خلية نموذج ثقافة كاتشو-2 الخلايا المزروعة في 3D ونموذج المجراة سابقا من الأمعاء الماوس. هذه الأساليب قابلة للتطبيق لدراسة النقل الظهارية الأخرى.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ظهارة الأمعاء لها وظائف النقل وحاجز الهامة التي تلعب دورا رئيسيا في الوظائف الفسيولوجية الطبيعية للجسم في الوقت الذي توفر حاجزا أمام الجسيمات الأجنبية. ارتبط النقل الظهارية ضعف (أيون، والمواد الغذائية، أو المخدرات) مع العديد من الأمراض ويمكن أن يكون لها عواقب تتجاوز الوظائف الفسيولوجية الطبيعية للنقل، مثل من خلال التأثير على سلامة الظهارية وmicrobiome القناة الهضمية. فهم وظيفة وتنظيم البروتينات النقل هو أمر حاسم لتطوير التدخلات العلاجية تحسينها. التحدي الأكبر في دراسة النقل الظهارية بوضع نظام نموذج مناسب الذي يلخص الميزات الهامة للخلايا الظهارية في الأمعاء الأم. وتستخدم عدة نماذج زراعة الخلايا في المختبر، مثل كاتشو-2، T-84، والخلايا HT-29-Cl.19A عادة في البحوث النقل الظهارية. هذه خطوط الخلايا تمثل المقاربة الاختزالية لنمذجة هوقد استخدمت pithelium وفي العديد من الدراسات الميكانيكية، بما في ذلك فحصها من التفاعلات الظهارية الميكروبي. ومع ذلك، الطبقات الوحيدة الخلية لا تعكس بدقة التفاعلات خلية خلية والمكروية في الجسم الحي. وقد أظهرت الخلايا المزروعة في 3D لتكون واعدة نماذج لدراسات نفاذية المخدرات. وتبين لنا أن كاتشو-2 الخلايا في 3D يمكن استخدامها لدراسة النقل الظهارية. ومن المهم أيضا أن الدراسات في الخلايا كاتشو-2 وتستكمل مع نماذج أخرى لاستبعاد خلية آثار محددة وأن تأخذ في الاعتبار تعقيد الأمعاء الأصلي. وقد استخدمت عدة طرق في السابق لتقييم وظائف النقل، مثل كيس مقلوبة وامتصاص في الخلايا الظهارية المعزولة أو في عزلة حويصلات غشاء البلازما. مع الأخذ بعين الاعتبار التحديات في هذا المجال مع الاحترام لنماذج وقياس وظيفة النقل، وعلينا أن نظهر هنا بروتوكول لتنمو كاتشو-2 الخلايا في 3D ووصف استخدام لغرفة أوسينج باعتبارهانهج فعال لقياس نقل السيروتونين، كما هو الحال في الظهارة المعوية الاستقطاب سليمة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم تجهيز ظهارة الأمعاء مع بروتينات النقل المختلفة (القنوات، ATPases، وشارك في النقل والمبادلات) التي تؤدي وظائف عديدة بدءا من امتصاص المواد الغذائية، الشوارد، والأدوية لإفراز السوائل والأيونات في التجويف. بروتينات النقل توليد التدرجات الكهروكيميائية التي تسمح حركة الأيونات أو الجزيئات بطريقة اتجاهي. ويتحقق ذلك عن طريق توزيعات غير المتماثلة لنظم النقل في الأغشية القمية وbasolateral من الخلايا الظهارية الاستقطاب. وبالإضافة إلى ذلك، منعطفات ضيقة، الذي حبل الخلايا الظهارية المجاورة، وتلعب دورا هاما في هذه العملية بمثابة حاجز لنشر intramembrane من المكونات بين المجالات غشاء قمي وbasolateral. نظم نموذج محاكاة مناسبة هذه السمات ال....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. دراسة المعوية نواقل في نظام الثقافة 3D من كاتشو-2: تزايد 3D كاتشو-2 خلية الثقافة على خليط من البروتين هلامي

  1. عامل النمو ذوبان تخفيض هلامي خليط من البروتين على الجليد لمدة 8 ساعات (أو O / N) في 4 درجات مئوية. إذابة مرة واحدة، وجعل 1 مل أو 500 مكل للاستخدام أو تخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.
  2. يوم الثقافة، precool لوحات ثقافة (لRNA والبروتين الاستخراج) أو الشرائح غرف (لالمناعية) على الجليد. إضافة 30 ميكرولتر من خليط من البروتين هلامي إلى كل بئر من شريحة ثمانية جيدا غرف من الزجاج ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويرد المناعية في 3D كاتشو-2 الخراجات في الشكل 1. ويصور صورة تمثيلية من XY-الطائرة تظهر التجويف ترسيمها جيدا في كيس 3D ملطخة الأكتين phalloidin في الشكل 1A. الجانب التي تواجه التجويف يدل على الجانب قمي. خلايا ظهارية في نتيجة بيئة 3D في النمط الظاهري الظهارية قوية. مختلفة كاتشو-2 الخراجات في يوم 12، عندما كانت الأكتين وسرت شارك الملطخة، في الشكل 1B. في هذا التمثيل من XY-طائرة (مختلفة من الطائرة هو مب.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد استخدمت متباينة تماما الطبقات الوحيدة كاتشو-2 خلية على نطاق واسع كما الاستقطاب الطبقات الوحيدة الظهارية لدراسة النقل المعوي 10، 11، 12، 13، 14، 15. ومع ذلك، لمحاكاة منظمة الفسيولوجية للخلايا الظهارية في الأمعاء، وكان هناك اهتمام كبير في تطوير ثقافة كاتشو-2 في 3D. وقد وضعت عددا من ا.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر السيد كريستوفر مانزيلا ، طالب دكتوراه في الطب / دكتوراه في مختبر RKG ، للمساعدة في تحرير مخطوطتنا وتدقيقها.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10x PBSATCCATCC ® ؛ HTB&ss; 37 & التجارة ؛خلايا
10x PBSCarl ZeissMicrosope للتصوير متحد البؤر
3< / sup> [H] -5-HT & nbsp ؛LabtekII152453زراعة الخلايا للفحص المجهري
5-HT & nbsp ؛Gibco70013-032ليست مادة خطرة
95٪ O 2< / sub>- 5٪ CO2< / sub> cylinderKPL71-00-27ليست مادة خطرة
Agar (لألواح أجار)FischerBP151-100سمية حادة ، أورا
أجار (للقطب)SigmaG7126-1KGليست مادة خطرة
Alexa Fluor PhalloidinSigmaC3867-1VLليست مادة خطرة
ألبومين مصل الأبقار (BSA)SigmaP6148-500Gضارة في حالة ابتلاع أو استنشاق
CaCl2< / sub>LifeTechnologiesA12380ليست مادة خطرة
خلايا Caco-2SigmaA8806-5Gليست مادة خطرة
عازلة تحلل الخلاياFischerBP337-100ليس مادة خطرة
الشرائح ChaberedSigmaS5886-1KGليست مادة خطرة
محلول الكولاجين من النوع 1SigmaS8045-500G
أقطابكهربائية SigmaS-0876
EMEMGibco من Life Technologies25200-056
مصل الأبقار الجنيني (FBS)356234 Corningتستخدم كمصفوفة خارج الخلية
فلوكستينكياجين74104
جنتاميسينATCC30-2003وسائط ثقافة الخلية
إشارات خلية الجليسين، دانفرز ، MA
Hepes & nbsp ؛روش11836145001
إندوميتاسينجيبكو من لايف تكنولوجيز15070-063
K2HPO4Gibco by Life Technologies15710-064
KOHGibco by Life Technologies15630-080
L-ascorbic acid Gibco by Life Technologies10082147
عداد التلألؤ السائل  Gibco by Life Technologies70013--032
LSM710 MetaPhysiologic Instruments, San Diego, CA EM-CSYS-8
مانيتولللأدوات الفسيولوجية ، سان دييغو ، كاليفورنيا & nbsp ؛P2304
MatrigelPhysiological Instruments ، سان دييغو ، كاليفورنيا   ؛VCC MC8
MgCl2Physiologic Instruments, San Diego, CA DM MC6
متعدد القنوات الجهد / التيار المشبكالأدوات الفسيولوجية ، سان دييغو ، كاليفورنيا & nbsp ؛P2300
كلوريد الصوديومللأدوات الفسيولوجية ، سان دييغو ، كاليفورنيا   ؛P2023-100
NaClFisher Scientific ، هامبتون ، نيو هامبشنBP1423
NaHCO3< / sub>Sigma-Aldrich ، سانت لويس ، MOS5886
مصل الماعز العادي (NGS ، 10٪) فيشرScientific ، هامبتون ، NHS233
بارافورمالدهيد (PFA)سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوريP288
Pen-StrpSigma-Aldrich ، سانت لويس ، ميزوريC3881
كاشف فحص البروتينسيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري10420
كوكتيل مثبط البروتينازMEDOX ، شيكاغو ، إلينوي & nbsp ؛نمط G- 12300
RNA سهل مجموعة صغيرةSigma-Aldrich ، سانت لويس ، MOM4125
وحدة إدخال القطب الكهربائي أحادية القناة   ؛سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوريA92902
منزلقات لسنبويل تشامبرزسيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوريH9523
فوسفات الصوديوم (Na 2< / sub>HPO4< / sub>)سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، MOF132
هيدروكسيد الصوديوم (NaOH)سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، MOT7039
TGF- & بيتا ؛ 1بيركين إلمر ، والثام ، ماساتشوستسNFT1167250UC
تريتون X-100باكارد إنسترومنتس ، داونر جروف ، إلينويB1600
تريبسين EDTAسيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري221473
توين -20مختبرات بيو راد ، هرقل ، كاليفورنيا5000006
غرفة أوسينج (الغرفة فقط)سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوريI7378
أنظمة غرفة أوسينغسيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوريA1296

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Simon-Assmann, P., Turck, N., Sidhoum-Jenny, M., Gradwohl, G., Kedinger, M. In vitro models of intestinal epithelial cell differentiation. Cell Biol Toxicol. 23 (4), 241-256 (2007).
  2. Shen, C., Meng, Q., Zhang, G. Design of 3D printed insert for hanging culture of Caco-2 cells. B....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Caco 2 Cells3D CultureUssing ChamberSerotonin TransportEpithelial TransportIntestinal EpitheliumSERT ProteinWestern BlotImmunofluorescenceCell Culture

Related Articles