Method Article

متعدد القسيمات-PAGE، طريقة لالتقاط وحل البروتين المجمعات في العينات البيولوجية

DOI:

10.3791/55341

⸱

May 5th, 2017

 ,  ,  , 
1Physiology, Michigan State University, 2Center for Neurodegenerative Science Van Andel Institute, 3Pharmaceutical Sciences, Wayne State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتقدم (PAGE) نظام طريقة لتحقيق الاستقرار وفصل بروتين المجمعات الأم من المحللة أنسجة معدلة باستخدام بروتين عبر رابط-أمين رد الفعل مضافا إلى رواية اثنين من الأبعاد هلام بولي أكريلاميد الكهربائي.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هناك العديد من وسائل متطورة لتنقية ودراسة البروتينات واحدة والببتيدات. ومع ذلك، يتم تنفيذ معظم الوظائف الخلوية من قبل شبكات مجمعات البروتين التفاعل، والتي غالبا ما تكون صعبة للتحقيق بسبب تجليدها هو غير التساهمية ومضطرب بسهولة عن طريق تقنيات تنقية. يصف هذا العمل وسيلة لتحقيق الاستقرار وفصل بروتين المجمعات الأم من أنسجة معدلة باستخدام ثنائي الأبعاد بولكرلميد الكهربائي للهلام. يتم تحميل الأنسجة المحللة على غير تغيير طبيعة جل بولي أكريلاميد الأزرق الأصلي، ثم يتم تطبيق تيار كهربائي حتى يهاجر البروتين على بعد مسافة قصيرة في هلام. قطاع هلام يحتوي على بروتين ترحيلها ثم يتم رفعه وحضنت مع dithiobis-أمين رد الفعل عبر ربط الكاشف (succinimidyl بروبيونات)، والتي تستقر تساهميا مجمعات البروتين. قطاع هلام يحتوي على مجمعات عبر ربط ثم يتم صبها في دوديسيل الصوديوم هلام كبريتات بولي أكريلاميد، وريتم فصل انه المجمعات تماما. ويعتمد هذا الأسلوب على التقنيات والمواد مألوفة لمعظم علماء الأحياء الجزيئية، وهذا يعني أنها غير مكلفة وسهلة التعلم. بينما هي محدودة في قدرتها على فصل كاف مجمعات كبيرة للغاية، ولم تكن ناجحة عالميا، كانت الطريقة قادرة على التقاط مجموعة واسعة من المجمعات مدروسة، وينطبق المرجح أن العديد من الأنظمة المثيرة للاهتمام.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وظيفة الخلوية العادية تعتمد على تفاعلات البروتين البروتين 1 و 2. ونتيجة لذلك، وغالبا ما يتم وضع علامة الأمراض التي تصيب الإنسان من الاضطرابات في التجمع وسلوك مختلف المجمعات البروتين 3. القدرة على تميز هذه التفاعلات هي بالتالي حرجة. تتطلب الوسائل الحالية للكشف عن هذه التفاعلات تنقية البروتينات المستهدفة، وغالبا ما تليها المنسدلة من شركاء التفاعل بهم. ويتم إنجاز تنقية التقليدية عن طريق الطرد المركزي التفاضلي، وهطول الأمطار، و / أو اللوني 4. هذه الأساليب هي مضيعة للوقت، ويجب تغييرها لكل بروتين الهدف، وغالبا ما تؤدي إلى ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد الأنسجة

  1. إعداد 10 مل من 4X عينة العازلة BN-PAGE (200 ملي مكرر (2-هيدروكسي) الأمينية تريس (hydroxymethyl) الميثان (مكرر تريس)، 200 مم كلوريد الصوديوم، و 40٪ ث / ت الجلسرين، 0.004٪ الشقائقية S، ودرجة الحموضة 7.2 ).
    ملاحظة: قد يتم هذا الحل الأسهم في وقت مبكر وتخزينها في 4 ° C.
  2. تمييع 250 ميكرولتر من عينة العازلة 4x وفي 750 ميكرولتر درهم 2 O تحتوي على 1X التجاري الكوكتيل مثبط البروتياز. دوامة والبرد على الجليد.
  3. التجانس ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه التجربة مظاهرة، تم تنفيذ مولتيمر-بادج على المحللة الفئران الدماغ كله. تم مسح البروتينات المنفصلة الناتجة على غشاء بولي فينيلين ديفلوريد (بفدف)، ثم بحث مع الأجسام المضادة ضد البروتينات التي من المعروف أنها تشكل المجمعات. ويبين الشكل 1 التحقق من صحة البروتوكول بواسطة وسيلتين. أولا، ونحن نبرهن على أن البروتينات عبر ربط قابلة للانشقاق عن طريق إضافة عامل الحد، وهذا يعني لوحظت أعلى ارتفاع الوزن الجزيئي الأنواع التي كتبها كاشف عبر .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تفاعلات البروتين البروتين مهم لكل مهمة الكائنات الحية تنفذ. وبسبب هذا، فهي موضوع تدقيق مكثف والبحوث. متعدد القسيمات-PAGE هي طريقة جديدة لالتقاط وفصل، وتحليل مجموعة واسعة من المجمعات البروتين. لقد أثبتنا سابقا تطبيقه لدراسة oligimerization من الأمراض المرتبطة البروتين α-synuclein 11. ومع ذلك، فإنه للمد إلى العديد من المجمعات البروتين، كما هو موضح في الشكل (2). بالمقارنة مع غيرها من أساليب دراسة المجمعات البروتين، متعدد القسيمات-PAGE هو مفيد .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بدعم من DA034783 NIH / النداء. نشكر بريان A. كيلينجر للحصول على المساعدة الفنية مع متعدد القسيمات-PAGE.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<قوي > مواد كيميائية < / قوي >
& إبسيلون ؛ حمض أمينوكابرويكسيجماA2504
أكريلاميدأكروس عضوي164855000سامة.
أكريلاميد / بيساكريلاميد 37.5: 1 (محلول مخزون 40٪ طن)BioRad161-0148سام.
بيرسلفات الأمونيومSigmaA3678
مكافحة الأرانب IgG-HRP من الماعزسانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-2004
مجموعة فحص حمض البيسينجونينيكThermofisher23225
Bis-trisSigmaB9754
ألبومين مصل الأبقارSigmaA9647
بوتانولفيشر ScientificA399-1
طقم الركيزة التلألؤ الكيميائيThermoFisher24078
Coomassie blue G-250Sigma-AldrichB0770
DigitoninSigmaD141Toxic.
ثنائي ميثيل سلفوكسيدفيشر ScientificD128-1
ديثيوبيس (سكسينيميديل بروبيونات)Thermo Scientific22585
مختبر الحليب الجاف الخالي من الدسمScientificM0841
GlycerolSigmaG9012
GlycineFisher ScientificBP381-5
كوكتيلمثبط البروتيازثيرموفيشر78430
حمض الهيدروكلوريكفيشر ScientificA144SI-212للمعايرة بالتحليل الحجمي. الكاويه.
الميثانولفيشر العلميA412-4لتنشيط غشاء PVDF. سام.
أحادي النسيلة المضاد لألفا ؛ سينوكلين IgG من الأرنبسانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-7011-R
N ، N ، N '، N '، N'-tetramethylethylenediamineSigmaT9281
N ، N '-methylenebisacrylamideAcros Organics16479سامة.
NP40بوسطن بيوبروكتسP-872
بولي سوربات 20 (توين -20)فيشر ساينتفيكBP337-500
أغشية نقل فلوريد البولي فينيلدينالحرارية العلمية88518
بونسو إسسيجماP3504
كلوريد البوتاسيومفيشر العلميP217-3
فوسفات البوتاسيوم كوكتيلسيجماP9791
محلول Thermo Scientific88265
SDS (10٪ وزن / حجم)BioRad161-0416
كلوريد الصوديومفيشر ScientificBP358-212
كبريتات دوديسيل الصوديومSigmaL37771
فوسفات الصوديوم أحادي القاعدةفيشر ScientificBP329-1
TricineSigmaT0377
Tris baseFisher ScientificBP152-500
Tris-HCl (عازلة 0.5 متر ، درجة الحموضة 6.8)BioRad161-0799
Tris-HCl (1.5 م عازلة ، درجة الحموضة 8.8)BioRad161-0798
Name< / strong>Company< / strong> رقم الكتالوجComments
Instruments
GE Imagequant LAS 4000GE Healthcare28-9558-10
برنامج ImageJالدقيقة NIH
Synergy H1BioTek
Gel السابق + StandBiorad
طرد مركزي Microfuge 22RBeckman Coulter
2 مل خالط
Vortex خلاطفيشر العلمي
بالموجات فوق الصوتية الأنسجة الخالطفيشر FB120220
مثبط أحادي القاعدة قارئ الصفيحة جهاز

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alberts, B. The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
  2. Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes Dev

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein Complex AnalysisNative PAGEIn gel Cross linkingSDS PAGE SeparationBlue Native GelGel Re castingDSP Cross linkerTissue Lysate PreparationImmunoblot DetectionMolecular Weight Ladder

Related Articles