مقالة منهجية

الخلايا العصبية التصوير داخل أقسام الدماغ سميكة باستخدام أسلوب جولجي كوكس

DOI:

10.3791/55358

⸱

أبريل 18, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Ontario Veterinary College, University of Guelph

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم بروتوكول باستخدام طريقة تلوين جولجي كوكس في أقسام الدماغ سميكة، من أجل رؤية الخلايا العصبية مع أشجار شجيري طويلة الواردة في عينات الأنسجة واحدة. يتم عرض نوعين مختلفين من هذا البروتوكول أيضا التي تنطوي على الكريزيل البنفسجي counterstaining، وتجميد العقول غير المجهزة لتخزين على المدى الطويل.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد استخدمت طريقة جولجي كوكس من تلطيخ الخلايا العصبية لأكثر من مائتي عام لتعزيز فهمنا للمورفولوجيا الخلايا العصبية داخل الدماغ العينات النسيجية. في حين أنه من الأفضل من الناحية العملية لإعداد أقسام الدماغ في أكبر سمك ممكن، من أجل زيادة احتمال تحديد الخلايا العصبية الملون التي ترد بشكل كامل داخل الأقسام واحدة، وهذا النهج هو محدود من منظور تقني من العمل لمسافات عالية ، تكبير أهداف المجهر. ونحن هنا التقرير بروتوكول لصبغ الخلايا العصبية باستخدام طريقة جولجي كوكس في أقسام مخ الفأر أن يتم قطع في 500 سمك ميكرون، وتصور الخلايا العصبية في جميع أنحاء عمق هذه المقاطع باستخدام المجهر تستقيم مزودة عالية الدقة 30X 1.05 NA سيليكون هدف النفط الغمر يحتوي على مسافة العمل 800 ميكرون. نحن أيضا الإبلاغ عن الخيارين مفيدة من هذا البروتوكول التي يمكن استخدامها لمباين سطحشنت أقسام الدماغ مع نيسل وصمة عار الكريزيل البنفسجي، أو لتجميد العقول كلها للتخزين طويل الأجل قبل باجتزاء والتجهيز النهائي. بروتوكول الرئيسي ومشتقاته اثنين تنتج أقسام الدماغ سميكة الملون، في جميع أنحاء الذي الكاملة أشجار الخلايا العصبية شجيري والعمود الفقري تغصناته يمكن تصور موثوق وكميا.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التصور من الخلايا العصبية الفردية داخل عينات الأنسجة يسمح للفي الموقع تحليل الخصائص المورفولوجية الخلايا العصبية، التي تقدمت بشكل كبير من فهمنا للدماغ وكيف يمكن أن يتأثر بها المرض الذاتية أو العوامل البيئية الخارجية. طريقة تلوين جولجي كوكس هو، وسيلة فعالة من حيث التكلفة بسيطة نسبيا من تلطيخ عينة عشوائية من الخلايا العصبية في الدماغ. أول من وضعه جولجي 1 وتعديلها من قبل كوكس 2 في 1800s، ومزيد من الصقل الباحثون هذه التقنية على مر السنين لإنتاج واضحة، والخلايا العصبية الملون بشكل جيد والتي يمكن استخدامها لتصور وتحديد كلا مورفولوجيا الشجرة شجيري وكثافة العمود الفقري 3، 4، 5، 6، 7، 8، 9.

وهناك اعتبار تقني رئيسي لتصور الخلايا العصبية الملون داخل أقسام الدماغ هو الحد الأقصى للسمك شريحة، والذي يحد من مسافة العمل من الأهداف المتاحة عالية التكبير / عالية الدقة المجهر. الأهداف النفط الغمر المشتركة في 60 - 100X مجموعة توفر قرار ممتاز، ولكن تقتصر مسافات عملهم التي عادة ما لا يزيد عن 200 ميكرون. أقسام الدماغ قطع في ميكرون مجموعة 200 قد تكون كافية لتصور أنواع الخلايا العصبية معينة التي يمكن الواردة في هذا شريحة سمك، على سبيل المثال العصبونات الهرمية في طبقات عميقة من القشرة المخية 10، 11، 12، الخلايا العصبية الهرمية في المنطقة CA1 من الحصين 13 و 14، والخلايا الحبيبية في التلفيف المسنن من الحصين (15). الخلايا العصبية مع أطول نسبياأشجار الجذعية، مثل الخلايا العصبية الهرمية داخل الطبقات العميقة من القشرة الدماغية التي فأرة الحاسوب يمكن أن تمتد أكثر من 800 ميكرون من خلايا الجسم 16، وتوفير تحديا أكبر لأنه لن تحتاج إلى مقطوع في زاوية مثالية العقول لاحتواء شجرة تغصناته كامل في حدود 200 ميكرون شرائح. قد لا يكون هذا ممكنا إذا كان التغصنات أو أي من فروعها تمتد في اتجاه منقاري أو الذيلية. في حين أنه من الممكن معالجة هذا القيد عن طريق تتبع الخلايا العصبية عبر عدة أقسام الدماغ المجاورة، ويدخل هذا النهج تحديا تقنيا كبيرا في التوفيق بين الأقسام بدقة للبحث عن المفقودين (17). ومن شأن اتباع نهج أكثر واقعية يكون لتصور الخلايا العصبية كلها الواردة في أقسام الدماغ التي قطعت في سمك أكبر.

نفيدكم هنا تقنية وصمة عار الخلايا العصبية داخل 400-500 ميكرون أقسام الدماغ سميكة من الفئران باستخدام طريقة جولجي كوكس، وتصور لهم موrphology باستخدام عالية الدقة السيليكون هدف النفط الغمر يحتوي على مسافة العمل 800 ميكرون. يتم تعديل التشريب وتجهيز بروتوكول جولجي كوكس التي وصفنا من أحد البروتوكولات الحديثة الأكثر ذكرا في الأدب 6. نهجنا مع أقسام الدماغ سميكة يوفر ميزة زيادة احتمال تحديد الخلايا العصبية من أي نوع أن ترد بشكل كامل داخل القسم. وبالإضافة إلى البروتوكول الرئيسي، ونحن أيضا موجودة شكلان التي توفر مزايا فريدة من نوعها: (1) جولجي كوكس تلطيخ مع مباين الكريزيل البنفسجي على سطح أقسام المركبة، من أجل تحديد حدود مناطق الدماغ وتحديد طبقات قشرة الدماغ، و (2) جولجي كوكس تلطيخ مع خطوة تجميد المتوسطة للتخزين على المدى الطويل من العقول كلها مشربة قبل باجتزاء والتجهيز النهائي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استخدام الكبار للإناث الفئران CD1 سلالة في هذه الدراسة. تلطيخ مماثل يمكن تحقيق ذلك باستخدام كلا الجنسين في مختلف الأعمار. ويهتم حيوانات التجارب لوفقا لمبادئ وتوجيهات من المجلس الكندي لرعاية الحيوان، وتمت الموافقة على بروتوكول تجريبي من قبل الجامعة لجنة رعاية الحيوان جويلف.

1. جولجي كوكس تلطيخ

  1. جولجي كوكس إشباع العقول
    1. جعل الحل جولجي كوكس 1٪ (ث / ت) ثاني كرومات البوتاسيوم، و 0.8٪ (ث / ت) كرومات البوتاسيوم و 1٪ (ث / ت) كلوريد الزئبق عن طريق إذابة ثاني كرومات البوتاسيوم وكرومات البوتاسيوم في الماء عالية الجودة بشكل منفصل . مزيج من الحلول، إضافة كلوريد الزئبق وتصفية الحل النهائي باستخدام الصف 1 ورق الترشيح. تخزين الحل في الظلام لمدة شهر واحد.
    2. تخدير الماوس باستخدام 5٪ الأيزوفلورين.
    3. الموت ببطء الماوس عن طريق قطع الرأس وإزالة بسرعة الدماغ.
    4. وضع الدماغ في قارورة التلألؤ 20 مل غلاس التي تحتوي على 17 مل من محلول جولجي كوكس واحتضان في الظلام في RT لمدة 25 د.
    5. Cryoprotect الدماغ عن طريق وضعها في أنبوب مخروطي 50 مل تحتوي على 40 مل من السكروز cryoprotectant (30٪ (ث / ت) السكروز في 0.1 M الفوسفات العازلة، ودرجة الحموضة 7.4) في الظلام في 4 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
      ملاحظة: قد تكون عاملة وفيما يلي ثلاث خطوات اختيارية كبديل للبروتوكول الرئيسي، من أجل تجميد الدماغ في هذه المرحلة للتخزين على المدى الطويل.
    6. تجميد الدماغ كله تخبط في 200 مل نظير البنتان التي تم precooled على الثلج الجاف.
    7. وضع الدماغ المجمدة في أنبوب 50 مل المخروطية وتخزينها في الظلام في -80 ° C.
    8. عندما تصبح جاهزة للشروع، ذوبان الجليد الدماغ عن طريق وضعها في أنبوب مخروطي 50 مل تحتوي على 40 مل من cryoprotectant السكروز في الظلام في 4 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  2. الدماغ باجتزاء
    1. إزالة الدماغ من السكروز والكتلةك ذلك لباجتزاء بقطع المخيخ باستخدام شفرة حلاقة وترك حافة مسطحة في نهاية الذيلية المتبقية من الدماغ.
    2. أجار الحرارة (3٪ (ث / ت) في الماء) حتى ذاب والسماح لتبرد حتى يصبح أعلى قليلا من نقطة انصهاره.
    3. وضع الدماغ في صغير المتاح وزن الطبق مع نهايته الذيلية وجها لأسفل وإضافة كمية كافية من أجار ذاب لتغطي الدماغ.
    4. مرة واحدة وقد عززت أجار، وتقليم أجار الزائد وترك ما يقرب من 2-4 ملم المحيطة بالدماغ والغراء الدماغ إلى مرحلة من مراحل vibratome مع نهايته الذيلية وجها لأسفل باستخدام كمية صغيرة من الغراء إيثيل غراء سريع.
    5. ملء المنطقة مرحلة من مراحل vibratome مع كمية كافية من cryoprotectant السكروز لتغطي الدماغ، وقسم الدماغ في سمك شريحة من 400-500 ميكرون (اعتمادا على المنطقة من المخ لفحصها) باستخدام تردد الاهتزاز من 86 هرتز و سرعة شفرة النهوض 0.125 ملم / ثانية.
    6. باستخدام فرشاة الدهان الصغيرة، أقسام الدماغ مكان في بئر من لوحة 6 جيدا زراعة الأنسجة التي تحتوي على إدراج-شبكة السفلية المتاحة تجاريا وقبل مليئة 10 مل من 6٪ (ث / ت) السكروز في 0.1 M الفوسفات العازلة، ودرجة الحموضة 7.4.
    7. احتضان المقاطع في الظلام في 4 درجات CO / N.
  3. تطوير أقسام الدماغ
    1. عن طريق إدراج-شبكة القاع، ونقل أقسام الدماغ في عالم جديد يحتوي بشكل جيد 5 مل من 2٪ (ث / ت) لامتصاص العرق (PBD) في 0.1 M الفوسفات العازلة، ودرجة الحموضة 7.4. احتضان على الكرسي الهزاز يتحرك بسرعة بطيئة في الظلام في RT لمدة 15 دقيقة.
    2. غسل أقسام مرتين من قبل نقلهم إلى آبار جديدة تحتوي على 5 مل من الماء. يغسل على الكرسي الهزاز تتحرك بسرعة معتدلة في الظلام في RT لمدة 5 دقائق.
    3. نقل المقاطع إلى بئر جديدة تحتوي على 5 مل من 2.7٪ (ت / ت) هيدروكسيد الأمونيوم. احتضان على الكرسي الهزاز يتحرك بسرعة بطيئة في الظلام في RT لمدة 15 دقيقة.
    4. غسل أقسام مرتين من قبل نقلهم إلى آبار جديدة تحتوي على 5 مل من الماء. غسل سغ الروك تتحرك بسرعة معتدلة في الظلام في RT لمدة 5 دقائق.
    5. نقل المقاطع إلى جديد يحتوي بشكل جيد 5 مل من تثبيتي A (انظر الجدول المواد) التي تم مخففة في 10X المياه من التركيز الأصلي شراؤها. احتضان على الكرسي الهزاز يتحرك بسرعة بطيئة في الظلام في RT لمدة 25 دقيقة.
    6. غسل أقسام مرتين من قبل نقلهم إلى آبار جديدة تحتوي على 5 مل من الماء. يغسل على الكرسي الهزاز تتحرك بسرعة معتدلة في الظلام في RT لمدة 5 دقائق.
  4. تصاعد أقسام الدماغ
    1. باستخدام فرشاة الدهان الصغيرة، جبل أقسام على الشرائح المجهر. إزالة المياه الزائدة وأجار باستخدام الملقط والأنسجة الصغيرة. ضمان أن تتم إزالة جميع أجار قبل الشروع في الجفاف.
    2. السماح أقسام للهواء الجاف في RT لمدة 45 دقيقة (400 ميكرون أقسام) أو 90 دقيقة (500 ميكرون أقسام).
      ملاحظة: مستوى توقيت والسليم للجفاف أمر بالغ الأهمية، وربما تحتاج إلى أن تحدد في كلمختبر اعتمادا على درجة الحرارة المحيطة ومستوى الرطوبة. قصيرة جدا وقت التجفيف يؤدي إلى أقسام تسقط من الشرائح خلال الخطوات اللاحقة الجفاف، وطويل جدا وقت التجفيف يؤدي إلى أقسام تكسير. سوف أقسام تزال تبدو لامعة على المستوى المناسب من جفاف.
    3. أقسام صمة عار مع البنفسجي الكريزيل عن طريق وضع شرائح في الجرار تلطيخ Coplin كما هو محدد.
      ملاحظة: يمكن استعمال هذه خطوة اختيارية لالمقاطع التي لم يتم تجميدها، من أجل وصمة عار نوى الخلايا العصبية مع البنفسجي الكريزيل. لقد وجدنا أن المقاصة والمضادة للجفاف أقسام قبل الحضانة في البنفسجي الكريزيل يؤدي حتى إلى تلطيخ وخلفية منخفضة عبر المقاطع.
      1. ضع في تطهير وكيل لمدة 5 دقائق. التكرار مرة واحدة.
      2. ضع في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 5 دقائق. التكرار مرة واحدة.
      3. ضع في 95٪ من الإيثانول في الماء، ثم 75٪ من الإيثانول في الماء، ثم الايثانول 50٪ في الماء لمدة 2 دقيقة لكل منهما.
      4. وضع في الماء لمدة 5 دقائق.
      5. ضع في 0.5٪ (ث / ت) لجنة المساواة العرقيةالبنفسجي SYL في الماء لمدة 7 دقائق.
      6. وضع في الماء لمدة 2 دقيقة. التكرار مرة واحدة.
    4. يذوى المقاطع عن طريق وضع شرائح في الجرار تلطيخ Coplin كما هو محدد.
      1. ضع في 50٪ من الإيثانول في الماء، ثم 75٪ من الإيثانول في الماء، ثم الايثانول 95٪ في الماء لمدة 2 دقيقة لكل منهما.
      2. ضع في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 5 دقائق. التكرار مرة واحدة.
      3. ضع في تطهير وكيل لمدة 5 دقائق. التكرار مرة واحدة.
        ملاحظة: هذه الجفاف والمقاصة مرات كافية لمعالجة أدمغة فئران كما هو موضح في هذه المخطوطة. ومع ذلك، لاحظنا بالنسبة للأنواع الأخرى بما في ذلك الفئران وشحارير البقر، أن الخطوة المقاصة النهائية قد تحتاج إلى أن تمتد ما يصل الى 15 مجموعه دقيقة.
    5. أقسام ساترة باستخدام المتوسطة المتزايدة اللامائية.
    6. تسمح الشرائح لتجف أفقيا في الظلام في RT لا يقل عن 5 د.

2. التصوير الملون الخلايا العصبية داخل الدماغ أقسام سميكة

  1. التقاط صورة الأكوام
    1. تشغيل لمبة ضوء المجهر، والكاميرا، وجهاز تحكم المرحلة.
    2. فتح البرنامج المجهر (على سبيل المثال، Neurolucida).
    3. وضع شريحة على المسرح المجهر.
    4. التقاط صورة على نطاق عرض 2D من قسم المخ باستخدام هدف تضخم منخفض مثل 1.25X 0.4 NA PlanAPO أو 4X 0.16 NA
      1. تركيز الصورة وضبط إعدادات الكاميرا بما في ذلك وقت التعرض وتوازن اللون الأبيض.
      2. إنشاء نقطة مرجعية من قبل اليسار النقر في أي مكان على القسم
      3. التقاط الصور عن طريق اختيار "الحصول على صورة واحدة" ضمن إطار الحصول على الصور.
    5. التقاط منتصف قرار مداخن صورة للمنطقة التي تحتوي على الخلايا العصبية (ق) من الفائدة، وذلك باستخدام 10X 0.3 NA الهدف UPlan FL N.
      1. التركيز على الصورة وضبط إعدادات الكاميرا بما في ذلك التعرض وتوازن اللون الأبيض.
      2. تعيين الحدود العليا والدنيا للصورة كومة من خلال التركيز على الجزء العلوي من القسمالثانية اختيار "مجموعة" إلى جانب "قمة كومة" ضمن إطار الحصول على الصور، ومن ثم التركيز على الجزء السفلي من القسم واختيار "مجموعة" بجانب "أسفل كومة" ضمن إطار الحصول على الصور.
      3. تعيين مسافة خطوة إلى 5 ميكرون عن طريق إدخال "5 ميكرون" بجوار "المسافة بين الصور" ضمن إطار الحصول على الصور.
      4. القبض على كومة صورة عن طريق اختيار "كومة صورة اكتساب" ضمن إطار الحصول على الصور.
      5. كرر الخطوات المذكورة أعلاه للقبض على المنطقة بأكملها من الفائدة، والتأكد من أن جميع مداخن صورة تتداخل لا يقل عن 10٪ في X و Y محاور.
    6. التقاط عالية الدقة مداخن صورة للمنطقة التي تحتوي على الخلايا العصبية من الفائدة، وذلك باستخدام 30X 1.05 NA سيليكون هدف النفط الغمر.
      1. تطبيق 3-4 قطرات من زيت السيليكون الغمر إلى الشريحة ووضع الهدف على الشريحة، وضمان لاجراء اتصالات بين الهدف ومنظمة اوكسفام الدوليةل.
      2. التركيز على الصورة وضبط إعدادات الكاميرا بما في ذلك التعرض وتوازن اللون الأبيض.
      3. تعيين الحدود العليا والدنيا للصورة كومة من خلال التركيز على الجزء العلوي من الباب، واختيار "مجموعة" إلى جانب "قمة كومة" ضمن إطار الحصول على الصور، ومن ثم التركيز على الجزء السفلي من الباب، واختيار "ضبط" بجانب "أسفل كومة" ضمن إطار الحصول على الصور.
      4. تعيين مسافة خطوة إلى 1 ميكرومتر عن طريق إدخال "1 ميكرون" بجوار "المسافة بين الصور" ضمن إطار الحصول على الصور.
      5. القبض على كومة صورة عن طريق اختيار "كومة صورة اكتساب" ضمن إطار الحصول على الصور.
      6. كرر الخطوات المذكورة أعلاه للقبض على المنطقة بأكملها من الفائدة، والتأكد من أن جميع مداخن صورة تتداخل لا يقل عن 10٪ في X و Y محاور.
    7. حفظ ملف البيانات وحفظ جميع ملفات الصور في شكل TIFF للتجهيز الخارجي.
  2. خلق صور Z-الإسقاط وصورة التنسيقات
    1. إنشاء صور Z-الإسقاط في يماغيج
      1. برنامج ImageJ المفتوح الذي المساعد بيو تنسيقات مثبتة.
      2. حدد "الإضافات" -> "بيو تنسيقات" -> "بيو تنسيقات المستورد".
      3. حدد الملف كومة صورة ليتم فتحه.
      4. بمجرد فتح الملف، تغيير تنسيق لRGB عن طريق اختيار "صورة" -> "نوع" -> "RGB اللون".
      5. إنشاء Z-الإسقاط عن طريق اختيار "صورة" -> "أكوام" -> "Z المشروع ...".
      6. حفظ صورة ثنائية الأبعاد Z-الإسقاط كملف TIFF.
    2. إنشاء المونتاج صورة ثنائية الأبعاد من المنطقة بأكملها من الفائدة.
      1. فتح البرنامج (على سبيل المثال، أدوبي فوتوشوب).
      2. حدد "ملف" -> "أتمتة" -> "الدمج الصوري".
      3. حدد "استعراض" ثم قم بإضافة كل ايماجوفاق الملفات المراد دمجها.
      4. تأكد من أن "مزيج الصور معا" يتم تحديد ومن ثم حدد "OK".
      5. حفظ الصورة المونتاج الناتجة من المنطقة بأكملها من الفائدة كملف TIFF.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يجوز استخدام هذا البروتوكول تلطيخ جولجي كوكس وصفهما مشتقاته اختياري لتصور الخلايا العصبية الفردية داخل 400-500 ميكرون أقسام الدماغ سميكة. وتظهر صورة مركبة تمثيلية اثنين من الأبعاد Z-توقعات استولت باستخدام الهدف 10X و 5 ميكرومتر الخطوات في محور Z في الشكل 1: A1 - C1 لمنطقة واسعة من أقسام الدماغ الاكليلية التي تتضمن الحزامية الأمامية منطقة القشرة 1 و القشرة الحركية الثانوية 18. قطعت أقسام في 500 ميكرون. لاحظ أ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن هنا وصف بروتوكول تلطيخ جولجي كوكس جنبا إلى جنب مع اثنين من المتغيرات مفيدة لتصور الخلايا العصبية داخل أقسام الدماغ سميكة. كما هو مبين في ممثل النتائج، واستخدام هدفا عالية الدقة لديه طويلة المسافة 800 ميكرون العمل يسمح التصور يمكن الاعتماد عليها من الخلايا العصبية كامل في جميع أنحاء عمق أقسام الدماغ قطع في 500 ميكرون. هذه الدراسة من أقسام الدماغ سميكة نسبيا يزيد من احتمال أن الخلايا العصبية الملون من أي نوع ترد بشكل كامل داخل شريحة، وهو أمر مهم خاصة بالنسبة للخلايا العصبية الهر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من قبل منحة ديسكفري إلى CDCB من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC)، وجون ريس ايفانز صندوق قادة منحة البنية التحتية البحثية لCDCB من المؤسسة الكندية للابتكار (CFI مشروع رقم 30381)، و منحة ديسكفري إلى NJM من NSERC. وأيد ELL عن طريق منح الدراسية أونتاريو العليا وعن طريق منح الأيتام والأطفال الضعفاء من كلية أونتاريو البيطري في جامعة جيلف. وأيد CDS عن طريق مساعدة مالية البحوث الجامعية الطالب من NSERC. وأيد ALM عن طريق منح الكسندر غراهام بيل من NSERC وقبل منح الأيتام والأطفال الضعفاء من كلية أونتاريو البيطري في جامعة جيلف.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ثنائي كرومات البوتاسيومفيشر ScientificP188-100
كرومات البوتاسيومفيشر ScientificP220-100
كلوريد الزئبقفيشر ScientificS25423ورق
ترشيح واتمان الخطير من الدرجة 1فيشر Scientific1001-185
شركاء الأيزوفلورانالصيدلانيون في كنداCP0406V2
20 مل قارورة التلألؤفيشر Scientific03-337-4
السكروزBioshop CanadaSUC700.1
فوسفات الصوديوم أحادي القاعدةSigma AldrichS5011-500G
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدةSigma AldrichS9390-500G
50 مل أنبوب مخروطيالشكل فيشر Scientific12-565-271
isopentaneفيشر ScientificAC126470010المعروف أيضا باسم 2-methylbutane ؛ أجار خطير
سيجما ألدريتشA1296-100G
طبق وزن صغيرفيشر ساينتفيك02-202-100
اهتزازLeicaVT1000 S
6 آبار لوحات زراعة الأنسجةفيشر Scientific08-772-1b
شبكة أسفل الأنسجة إدراجفيشر Scientific07-200-214
paraformadelhyde (PFA) ، 16٪علوم المجهر الإلكتروني15710-S
هيدروكسيد الأمونيومفيشر ScientificA669S-500كوداك الخطرة
ASigma AldrichP7542
superfrost plus شرائحفيشر Scientific12-550-15
عامل مقاصة CitroSolvفيشر ساينتفيك22-143-975
الكحول الإيثيلي اللامائيالكحوليات التجاريةN / A
كريسيل البنفسجيسيجما ألدريتشC1791
permountفيشر ScientificSP15-100
مجهر مستقيمأوليمبوسنموذج BX53
كاميرا ملونة ، 12 بتMBF BiosciencesDV-47dQImaging جزء 01-MBF-2000R-F-CLR-12
مرحلة مجهر آلي ثلاثي الأبعاد ، وحدة تحكم و enodersMBF BiosciencesN / Aيتم توفيرها ودمجها بالمجهر بواسطة MBF Biosciences
4X مجهر الهدفأوليمبوس4x 0.16 NA UplanSApo
10X المجهر الموضوعيأوليمبوس10x 0.3 NA UPlan FL N & nbsp ؛
هدف المجهر 30Xأوليمبوس30x 1.05 NA UPlanSApo 
هدف المجهر 60Xأوليمبوس60 × 1.42 NA PlanAPO N
زيت غمر السيليكونأوليمبوسZ-81114
برنامج NeurolucidaMBF Biosciencesالإصدار 10
برنامج ImageJالمعاهد الوطنية للصحةالإصدار الحاليمع البرنامج المساعد OME Bio-Formats
Photoshopالمثبتإصدار AdobeCS6
الخطرة الخطير شبكة الخطير مثبت الأمريكية برنامج

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Golgi, C. Sulla struttura della sostanza grigia del cervello. Gazzetta Medica Italiana. Lombardia. 33, 244-246 (1873).
  2. Cox, W. H. Imprägnation des centralen Nervensystems mit Quecksilbersalzen. Archiv f. mikrosk. Anat. 37, 16-21 (1891).
  3. Zaqout, S., Kaindl, A. M. Golgi-Cox Staining Step by Step. Front Neuroanat. 10, 38(2016).
  4. Levine, N. D., et al. Advances in thin tissue Golgi-Cox impregnation: fast, reliable methods for multi-assay analyses in rodent and non-human primate brain. J Neurosci Methods. 213 (2), 214-227 (2013).
  5. Ranjan, A., Mallick, B. N. A modified method for consistent and reliable Golgi-Cox staining in significantly reduced time. Front Neurosci. 1, 157(2010).
  6. Gibb, R., Kolb, B. A method for vibratome sectioning of Golgi-Cox stained whole rat brain. J Neurosci Methods. 79 (1), 1-4 (1998).
  7. Friedland, D. R., Los, J. G., Ryugo, D. K. A modified Golgi staining protocol for use in the human brain stem and cerebellum. J Neurosci Methods. 150 (1), 90-95 (2006).
  8. Narayanan, S. N., et al. Appraisal of the effect of brain impregnation duration on neuronal staining and morphology in a modified Golgi-Cox method. J Neurosci Methods. 235, 193-207 (2014).
  9. Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. The Golgi-Cox method. Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).
  10. Sutherland, R., Gibb, R., Kolb, B. The hippocampus makes a significant contribution to experience-dependent neocortical plasticity. Behav Brain Res. 214 (1), 121-124 (2010).
  11. Hamilton, G. F., Whitcher, L. T., Klintsova, A. Y. Postnatal binge-like alcohol exposure decreases dendritic complexity while increasing the density of mature spines in mPFC Layer II/III pyramidal neurons. Synapse. 64 (2), 127-135 (2010).
  12. Nashed, M. G., Seidlitz, E. P., Frey, B. N., Singh, G. Depressive-like behaviours and decreased dendritic branching in the medial prefrontal cortex of mice with tumors: A novel validated model of cancer-induced depression. Behav Brain Res. 294, 25-35 (2015).
  13. Frauenknecht, K., et al. Mice with experimental antiphospholipid syndrome display hippocampal dysfunction and a reduction of dendritic complexity in hippocampal CA1 neurones. Neuropathol Appl Neurobiol. 41 (5), 657-671 (2015).
  14. Camacho-Abrego, I., et al. Rearrangement of the dendritic morphology of the neurons from prefrontal cortex and hippocampus after subthalamic lesion in Sprague-Dawley rats. Synapse. 68 (3), 114-126 (2014).
  15. Redila, V. A., Christie, B. R. Exercise-induced changes in dendritic structure and complexity in the adult hippocampal dentate gyrus. Neuroscience. 137 (4), 1299-1307 (2006).
  16. Bailey, C. D., Alves, N. C., Nashmi, R., De Biasi, M., Lambe, E. K. Nicotinic alpha5 subunits drive developmental changes in the activation and morphology of prefrontal cortex layer VI neurons. Biol Psychiatry. 71 (2), 120-128 (2012).
  17. Lytton, W. W. From computer to brain : foundations of computational neuroscience. , Springer. (2002).
  18. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , 2nd, Academic. (2001).
  19. Ha, H. A modified Golgi-Cox method with counterstain for the study of synapses. Anat Rec. 155 (1), 59-64 (1966).
  20. Swanson, L. W. The locus coeruleus: a cytoarchitectonic, Golgi and immunohistochemical study in the albino rat. Brain Res. 110 (1), 39-56 (1976).
  21. Pilati, N., Barker, M., Panteleimonitis, S., Donga, R., Hamann, M. A rapid method combining Golgi and Nissl staining to study neuronal morphology and cytoarchitecture. J Histochem Cytochem. 56 (6), 539-550 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Golgi Cox MethodNeuron StainingThick Brain SectionsSilicone Oil ImmersionCresyl Violet StainBrain SectioningVibratome SectioningImage Stack AcquisitionDendritic Tree VisualizationSpine Density Analysis

مقالات ذات صلة