مقالة منهجية

سينوكلينس α β و γ المؤتلف تحفيز البروتين الفوسفاتيز 2A نشاط الحفاز وحدة فرعية في فحوصات الخلية الحرة

8.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/55361

⸱

أغسطس 13, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Center of Emphasis in Neurosciences, Graduate School of Biomedical Sciences, Paul L. Foster School of Medicine, Texas Tech University Health Sciences Center El Paso

في هذه المقالة

إشعار تصحيح

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

ملخص

يعرض هذا المنشور على بروتوكول تبين كيفية قياس نشاط البروتين المؤتلف 2A الفوسفاتيز الحفاز وحدة فرعية (PP2Ac) ردا على المؤتلف α-سينوكلين، β-سينوكلين، أو البروتينات γ-سينوكلين مقايسة اللونية بسيطة باستخدام. نعرض النتائج فيما يتعلق بخصوصية α-سينوكلين نحو PP2Ac في المخ الماوس.

الملخص

Α-سينوكلين (aSyn)، β-سينوكلين (بسين)، و γ-سينوكلين (جسين) هم أفراد من عائلة المصانة وصي مثل البروتينات التي يتم التعبير عن درجة عالية في الأنسجة العصبية الفقاريات. من سينوكلينس الثلاثة، قد فقط aSyn بشدة تورط في اضطرابات الأعصاب مثل مرض باركنسون، والخرف مع الهيئات ليفي، وضمور نظام متعددة. في دراسة دالة aSyn العادي، تشير البيانات إلى أن aSyn يحفز النشاط فرعية حفاز إنزيم ديفوسفوريلاتينج المعرب عنها تماما، PP2Ac في المختبر و في فيفو. وتظهر البيانات السابقة أن التجميع aSyn في دماغ الإنسان يقلل من نشاط PP2Ac في مناطق مع ليفي الهيئة علم الأمراض، حيث aSyn القابلة للذوبان قد أصبحت غير قابلة للذوبان. ومع ذلك، لكل سينوكلينس ثلاثة التماثل الكبير في سلاسل الأحماض الأمينية، صممت تجارب اختبار ما إذا كان كل ما يمكن أن تعدل النشاط PP2Ac. استخدام سينوكلينس المؤتلف والمؤتلف PP2Ac البروتين، تم تقييم النشاط بمقايسة اللونية الملكيت الأخضر. وكشفت البيانات أن جميع سينوكلينس المؤتلف ثلاثة حفز النشاط PP2Ac في فحوصات الخلية الحرة، رفع إمكانية أن التماثل المصانة بين سينوكلينس قد تضفي على جميع هومولوجس ثلاثة القدرة على ربط وتفعيل PP2Ac. ومع ذلك، توحي البيانات Co-إيمونوبريسيبيتيشن، أن يحدث PP2Ac التعديل المحتمل من خلال التفاعلات الذاتية بين aSyn و PP2Ac في فيفو.

المقدمة

وأفادت دراسات تحديد توزيع سينوكلينس في المخ والحبل الشوكي وتظهر أن جميع سينوكلينس الثلاث هي أثري في الأنسجة العصبية، على الرغم من أن أنماط مختلفة للتعريب وكانت1. على سبيل المثال، aSyn الأكثر وفرة في مواقع بريسينابتيك في قشرة الدماغ والعقد القاعدية32،، بسين قد توزيعاً أكثر توحيدا في المخ والحبل الشوكي4،5، وجسين أكثر وفرة في الحبل الشوكي والعقد الطرفية6. على الرغم من أن قد تحدث بعض التعبير الجنينية من جميع سينوكلينس، هومولوجس الثلاثة تصبح أكثر وفرة خلال الفترة الوليدية4،5،6،،من78. بشكل ملحوظ، البيانات من الفئران خروج المغلوب ثلاثية سينوكلين، تشير إلى أن فقدان جميع سينوكلينس ثلاثة أسباب سن بداية الخلل في الخلايا العصبية9، دعم وظائف سينوكلين الهامة في الجهاز العصبي المركزي (CNS)10، 11-ولا يعرف حتى الآن إذا كانت الفئران خروج المغلوب ثلاثية سينوكلين إظهار التغييرات في توزيع PP2Ac أو النشاط. وتكشف البيانات من الفئران خروج المغلوب سينوكلين واحد أن فقدان aSyn وحدها يمكن أن تقلل إلى حد كبير النشاط PP2Ac في المخ12. بالإضافة إلى الجهاز العصبي المركزي، ترجمة جميع سينوكلينس للأنسجة الأخرى في جميع أنحاء الجسم13،،من1415.

بسبب صلاته الوراثية راسخة إلى16،نيوروديجينيريشن17، درس aSyn هي من بين الأفضل من سينوكلينس ثلاثة. المختبر بيريز عملت منذ فترة طويلة على تحديد الأنشطة الوظيفية العادية ل aSyn، لا سيما في الجهاز العصبي المركزي11،12،،من1819،،،من2021 ،من 2223 ، وفي الآونة الأخيرة في الأنسجة المحيطية24،25. ومن بين هذه، كان الاكتشاف أن aSyn يلعب دور تنظيمي رئيسي في تحفيز النشاط PP2Ac19. PP2A نشاط يساهم وظيفة المخ المعتادة، بما في ذلك لتنظيم إنتاج الدوبامين26على نطاق واسع. هولونزيمي PP2A ويتألف من ثلاث مفارز مستقلة وفرعية ج الحفاز، PP2Ac، وحدة فرعية لسقالات A وواحد من عدة مختلفة التنظيمية/استهداف ب الوحدات الفرعية التي تساعد على ترجمة PP2A إلى ميكرودومينس سوبسيلولار محددة، وبالتالي توفير PP2A 27من التنوع الوظيفي. وتبين الأدلة أن التفاعلات aSyn مع PP2Ac تسهم كثيرا في الفوسفاتيز النشاط في المختبر و في فيفو12،،من1921،23، 25. عندما يتراكم aSyn في المجاميع البروتين، كما هو الحال عند ليفي هيئات النموذج داخل الخلايا العصبية لمرض باركنسون والخرف مع الهيئات ليفي (دلب)، الأنسجة مع aSyn مجمعة تقلصت PP2Ac النشاط23،25، عندما تقلل من مستويات aSyn القابلة للذوبان. نظراً لأن جميع سينوكلينس الثلاثة قد التماثل الكبير28 (aSyn مشاركة هوية 66% مع بسين و 56 في المائة مع جسين) وأن aSyn يساهم في تفعيل PP2Ac، وأنه كان الافتراض بأن جميع أفراد الأسرة البروتين سينوكلين قد تكون قادرة على زيادة نشاط PP2Ac، على الأقل في المختبر. لتقييم هذا، وتم قياس نشاط PP2Ac ردا على aSyn المؤتلف، وبسين، وجسين استخدام مقايسة اللونية بسيطة، على غرار طريقة فتحي et al. 29-هذا الأسلوب والنتائج الرواية بالتفصيل هنا.

البروتوكول

1-إعداد المخازن المؤقتة والمواد الكاشفة

  1. إعداد المخزن المؤقت للفوسفات (بنب) فنيتروفينيل
    1. إعداد 50 مل بنب المخزن المؤقت على النحو التالي.
    2. وزن خارج قاعدة تريس 0.30285 ز (انظر الجدول للمواد) ويحل عليه في 25 مل مياه عالي النقاوة.
      1. إضافة ميليلتر 41.6 كاكل 120 مم2. ضبط على درجة الحموضة 7.0 مع 1 م HCl وحجم الحل النهائي 50 مل مع المياه عالي النقاوة.
      2. ضمان أن يكون التركيز النهائي 50 مم تريس-HCl، 100 مم كاكل2، درجة الحموضة 7.0.
      3. تخزين المخزن المؤقت بنب في 4 ياجيم
  2. لحلول الملكيت الأخضر، وإعداد ما يلي.
    1. إعداد الحل A عن طريق إضافة 32.8 مل HCl مركزة إلى 67.2 مل مياه عالي النقاوة. لإنشاء حل HCl 4 أمتار.
      ملاحظة: أعد حل الملكيت غطاء دخان باستخدام قفازات القابل للصرف وقناع الوجه، ونظارات واقية.
    2. إعداد حل ب التي تزن بها ز 4.2 من موليبدات الأمونيوم وإضافته إلى 95.8 مل من محلول أ
    3. إعداد الحل ج التي تزن بها ز 0.045 الملكيت الأخضر أكسالات الملح وإضافة المياه عالي النقاوة لكي النهائي إجمالي حجم 100 مل.
    4. إعداد الحل د بخلط الحلول ب وج في نسبة 1:3 (v/v)، إثارة ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
    5. تصفية د الحل عن طريق 0.22 ميكرومتر المسامية حجم النيتروسليلوز غشاء تصفية وحدة استخدام حقنه 50 مل.
    6. تخزين حل الملكيت المعدة في 4 سج محمية من الضوء.
  3. إعداد المنشط
    1. لإعداد من 1% توين 20 الحل، ماصة 10 ميليلتر من توين 20 إلى 990 ميليلتر من النقاوة منزوع الماء (v/v) ثم دوامة توين 20 حتى يذوب تماما.
  4. إعداد الملكيت الأخضر 20 توين (مالية) العامل الحل.
    1. مزيج المنشط (الخطوة 1، 3) مع الحل الملكيت الأخضر (الحل د، خطوة 1.2.5) بنسبة 1: 100 (مثلاً 1 ميليلتر المنشط لحل الملكيت الأخضر ميليلتر 99).
  5. إعداد ثريونين فوسفوبيبتيدي (كربتير) (pT) الركيزة.
    1. إعداد مكان أسهم، 2 مم قنينة 1 ملغ فوسفوبيبتيدي على الجليد، إضافة ميليلتر 550 المياه عالي النقاوة، ودوامه بلطف حل.
      1. جعل مختبرين ~ 10 وتخزين pT في جيم-20س
  6. إعداد سينوكلين
    1. إعداد سينوكلينس في غطاء دخان باستخدام قفازات القابل للصرف وقناع الوجه، ونظارات واقية.
    2. ريسوسبيند 1 ملغ سينوكلين المؤتلف في المياه عالي النقاوة. 1 مل لتركيز 1 ملغ/مل نهائي.
    3. الدوامة بلطف بحل ووضع على الجليد.
    4. إعداد 50 ميليلتر مختبرين وتخزينها في جيم-80 س
  7. إعداد معايير الفوسفات
    1. إعداد الحل مخزون الفوسفات 0.1 ملم على النحو التالي.
      1. تزن بها 0.1361 ز خ2ص4 ، ووضعه في كوب مع 80 مل مياه عالي النقاوة. إضافة شريط ضجة ومزيج لحل. نقل كل من الحل إلى اسطوانة تخرج والحجم الإجمالي النهائي 100 مل مع المياه عالي النقاوة.
      2. تصفية الحل الكامل من خلال 0.22 ميكرومتر المسامية حجم النيتروسليلوز غشاء تصفية وحدة استخدام حقنه 50 مل؛ أن تركيز النهائي 10 مم.
      3. تمييع 1: الحل (10 ملم) 100؛ وسيكون التركيز النهائي الفوسفات 0.1 ملم (ص4) لاستخدامها لمعايير الفحص.
      4. تخزين الحل مخزون الفوسفات في 4 ياجيم
    2. انظر الجدول 1 للحد من تخفيف تستخدم لجعل بو4 المعايير بحجم إجمالي نهائي 1250 ميليلتر. إضافة المقدار المناسب من الفوسفات والمياه عالي النقاوة إلى أنابيب 1.5 مل وفقا للجدول 1.
      1. المتجر أعد بو4 المعايير في جيم-20 س
معايير الفوسفات
حل4 مم 0.1 بو (mL)0751503006001,200
المياه عالي النقاوة (mL)1,2501,1751,10095065050
التركيز النهائي بو4 [بمول]01503006001,2002,400

الجدول 1: معايير الفوسفات.

2-PP2A بالانزيم ردا على سينوكلينس المؤتلف

ملاحظة: الحجم الإجمالي النهائي لكل رد فعل سيكون 60 ميليلتر، حتى المجرب يجب ضبط حجم المخزن المؤقت بنب الأولى على نحو ملائم لاستيعاب حجم سينوكلينس المستخدمة لكل عينة. وفي معظم الحالات، سيكون حجم المخزن المؤقت بنب بين 40 و 44 ميليلتر.

  1. إعداد كل رد فعل PP2Ac على النحو التالي.
    1. في أنبوب 1.5 مل، إضافة ميليلتر 39 بنب المخزن المؤقت ومكان على الجليد.
    2. أضف 1 ميليلتر (105 نانوغرام/ميليلتر أو 0.0007 U/ميليلتر) من PP2Ac الماشوب البشري (rPP2Ac).
    3. إضافة 4 ميليلتر من 0، 1.5، 7.5، 15 أو 30 ميكرون سينوكلينس إلى rPP2Ac في المخزن المؤقت بنب لالنهائي تركيزات 0، 0.1، 0.5، 1.0 و 2.0 ميكرون، واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على وحدة الدورية؛ ستكون وحدة التخزين النهائي 60 ميليلتر.
    4. وبعد 30 دقيقة، نقل عينات الجليد وإضافة 16 ميليلتر من الركازة pT 2 مم.
    5. احتضان كل خليط الإنزيم PP2A لمدة 10 دقيقة في 30 درجة مئوية في حمام مائي مع الهز متقطعة.
    6. إضافة إلى لوحة مسطحة قاع 96، حسنا، 25 ميليلتر من كل بو4 القياسية (0، 150، 300، 600، 1,200 وبمول 2,400) في الآبار مكررة من منخفض إلى عالي.
    7. بعد إضافة 25 ميليلتر من كل عينة تجريبية (PP2A المقايسة ± سينوكلين)، أعد الخطوات 2.1.1 ل 2.1.6، لتكرار الآبار على نفس اللوحة 96-جيدا.
    8. المقبل، بإضافة ميليلتر 75 من حل عملي مالية إلى كل كذلك تحتوي على المعايير وعينات.
    9. اترك اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
    10. مراقبة لون تغيير في العينات وجود اختلافات قابلة للقياس في مستويات الفوسفات.

3. مضوائيه التحليل

  1. تحليل لوحة 96-كذلك يتضمن معايير والعينات باستخدام قارئ لوحة سبيكتروفوتوميتريك مع الطول الموجي تعيين إلى 630 نيوتن متر29.
  2. ارسم منحنى امتصاص المنتجة (قراءة عينات في 630 نيوتن متر) ولاحظ أنه لا يزال الخطية حتى تركيز بمول 2,400 ص. ب4.

النتائج

ويمكن تغيير وظيفة البروتين ونشاط بالتعديلات بعد متعدية الجنسيات، مثل الفسفرة. يمكن فوسفوريلاتيد من كيناز العديد من البروتينات، أو ديفوسفوريلاتيد الفوسفاتيز. وفي حالة 2A الفوسفاتيز البروتين (PP2A)، يسهل هذا الفوسفاتيز مولتيسوبونيت ديفوسفوريليشن بقايا سيرين وثريونين على عدد واسع من فوسفوبروتين. يمكن أن يؤدي نشاط PP2A غير طبيعي للتقلبات وظيفة البروتين الذي يحدث في العديد من الأمراض، بما في ذلك مرض باركنسون حيث يمكن أن تصبح aSyn هايبرفوسفوريلاتيد، ومرض الزهايمر حيث يمكن أن يصبح البروتين تاو هايبرفوسفوريلاتيد. وأتاح هذا التبرير لتحسين إجراء داخلي لتقييم نشاط PP2Ac بسرعة وتحديد إذا كان نشاط PP2Ac غير طبيعي قد يؤدي إلى خلل الخلوية.

باستخدام هذا الفحص خالية من الخلايا اللونية، PP2Ac تم قياس نشاط بالتحديد الكمي لمقدار الحرة بو4 المشقوق من الركازة pT (الشكل 1A) ومقارنة بالمبالغ بيكومولار المعروفة من بو4 في المنحنى القياسي (1B الشكل ). كما تم قياس النشاط PP2Ac في الاستجابة إلى 0.0 0.1، 0.5، 1.0 و 2.0 ميكرون سينوكلينس (الشكل 1A)، بالمقارنة مع خط الأساس PP2Ac النشاط في غياب سينوكلين المضافة (في السهم كبيرة في الشكل 1A).

figure-results-1
الشكل 1 : PP2A التنشيط بواسطة سينوكلينس المؤتلف، يقاس بالنسبة إلى مستويات الفوسفات في المعايير المعروفة. في (أ) قيمت aSyn، بسين، وجسين في نطاق من 0-2 ميكرومتر البروتين التركيزات، مقارنة إلى 0-2400 pmol بو4 المعايير. (ب) المنحنى المعياري للانزيم PP2Ac الملكيت الأخضر تم إنشاؤها لتوفير كميات معروفة من الفوسفات الذي يمكن حساب القيم التي تم الحصول عليها في ظروف تجريبية. وفي جميع الحالات، عندما يزداد نشاط PP2Ac، مقدار الحرة بو4 المشقوق من الركازة pT يزيد وتنتج لون أخضر أغمق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

وتبين النتائج أن إضافة سينوكلينس إلى PP2Ac في الخطوة الأولى من الحضانة يمكن زيادة مقدار الحرة بو4 قياسه، مدللة بذلك على زيادة PP2Ac النشاط. التحليل الإحصائي بعد كثرة التكرار وتبين أن جميع سينوكلينس ثلاث الماشوب (aSyn, بسين, جسين) زيادة النشاط PP2Ac (الشكل 2). هذه النتائج تشير إلى أن التغيرات البالغة سينوكلينس الخلوية القابلة للذوبان يمكن أن تغير النشاط PP2Ac؛ ومما قد يؤثر على التوازن الخلوية. لا يعرف، ومع ذلك، إذا كان جميع سينوكلينس الثلاثة تسهم في تفعيل PP2Ac في فيفو، على الرغم من أن البيانات في الشكل 3 توحي بأن aSyn المحتمل يساهم PP2Ac النشاط في فيفو.

figure-results-2
الشكل 2 : هو حفز النشاط PP2Ac بكل ثلاثة سينوكلينس. يتم عرض تمثيل رسومي للتنشيط PP2Ac ردا على تركيزات متفاوتة aSyn المؤتلف، أو بسين، أو جسين. جميع سينوكلينس المؤتلف ثلاثة حفز النشاط PP2Ac. ويبدو aSyn في معظم التجارب تكون أقوى قليلاً، على الرغم من ANOVAs إجراء باستخدام البرمجيات الإحصائية تماثل ملحوظ عموما. وتمثل البيانات ± يعني SEM التجارب المستقلة 4-9. ns، ليست كبيرة؛ ف < 0.05؛ ف < 0.01؛ ف < 0.0001. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

لتقدير synuclein(s) التي يمكن أن تتفاعل مع PP2Ac في المخ، أجريت فحوصات co-إيمونوبريسيبيتيشن (Co-IP) باستخدام نوع البرية الماوس الدماغ و PP2Ac-المحددة-الجسم, 6 1. ثم تم فصل البروتينات بالحزب الديمقراطي الصربي صفحة وتم سبر البقع aSyn، بسين، PP2Ac وجسين استخدام الأساليب المتبعة19. ضوابط سينوكلين المؤتلف تثبت خصوصية جسم aSyn وبسين وجسين (الشكل 3A). تكشف البيانات Co للملكية الفكرية أن سينوكلين الرئيسية المرتبطة PP2Ac في المخ aSyn، أقل بكثير بسين ونزل في (الشكل 3B) co-الملكية الفكرية، ولا جسين ونزل في أول أكسيد الكربون-الملكية الفكرية (البيانات لا تظهر). وهذا يوحي بدور مميز ل aSyn الذاتية في تنظيم PP2Ac في المخ. كما أنه يثير إمكانية أن التحوير PP2Ac مع العلاجات بسين على أساس يمكن أن تكون القدرة على استعادة النشاط PP2A في تلك مع سينوكلينوباثي، كما هو معروف بسين أن تكون نوناميلويدوجينيك حتى الآن كما هو موضح هنا يمكن أن تحفز PP2Ac30، 31.

figure-results-3
الشكل 3: التفاعل PP2Ac مع سينوكلينس الذاتية في الدماغ الماوس. تم سبر aSyn المؤتلف (A)، بسين وجسين مع سينوكلين أجسام مضادة محددة كما هو موضح أدناه. (ب) استخدام الماوس هوموجيناتي الدماغ أنجزت شركة للملكية الفكرية مع جسم 6 1، ثم تم تحليل العينات في إيمونوبلوتس. وترد البيانات PP2Ac و aSyn بسين، ولكن ليس جسين الذي لم لا Co-الملكية الفكرية مع PP2Ac. عينات ابدأ إظهار المستويات النسبية ل PP2Ac (لين 1)، aSyn (لين 4)، وبسين (لين 7) في هوموجيناتيس الأولى. نهاية عينات إظهار المستويات المتبقية من PP2Ac (لين 2)، aSyn (ممر 5)، وبسين (لين 8) في هوموجيناتيس بعد 6 1 PP2Ac Co للملكية الفكرية. كانت مستويات كبيرة من PP2Ac إيمونوبريسيبيتاتيد باستخدام 6 1 جسم (لين 3)، التي أسقطت أيضا كميات وافرة من aSyn (لين 6، في السهم) لكن القليل جداً بسين (لين 9، تعريض بشدة إظهار إشارة بسين باهتة، في الأسهم). * التنصيص وأقواس إشارات مارك غير المحددة في البقع. انظر الجدول للمواد لمزيد من التفاصيل عن الأجسام المضادة المستخدمة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

المناقشة

واستخدمت هذه المقايسة الملكيت الأخضر مع حزب العمال لقياس النشاط PP2Ac لأنه من الأسهل القيام من الأسلوب الكلاسيكي الذي يستخدم 32ف المسمى ركائز. ميزة أخرى لهذا التحليل على فحوصات المشعة هو أن خطر بعض النظائر المشعة، ويمكن أن يكون مكلفاً، لا سيما 32ف المسمى الجزيئات التي تحتوي على نصف حياة قصيرة، مما يحد من عدد فحوصات واحدة يمكن أن تؤدي قبل انتهاء صلاحية الكواشف. النفايات ف استخدام الملكيت الأخضر بدلاً من النشاط الإشعاعي أيضا يلغي الحاجة إلى التخلص من 32. فحوصات الملكيت الأخضر أيضا حساسة جداً عند قياس نشاط phosphatases سيرين/ثريونين عند مقارنتها بمقايسة اللونية آخر يستخدم الركازة فنيتروفينيلفوسفاتي (بنب)، وغير انتقائية كما يمكن أن يكون ديفوسفوريلاتيد بعدد كبير من الإنزيمات32.

مجموعات تجارية الملكيت الأخضر لقياس النشاط PP2A كانت متاحة لبعض الوقت، وكانت تستخدم سابقا في المختبر. ومع ذلك، عند القيام بفحوصات الملكيت الأخضر كثيرة، مثل مجموعات أصبحت باهظة. وبالإضافة إلى ذلك، هي مستقرة إلا لمدة سنة واحدة، في حين وجود الكواشف المتوفرة في مسحوق شكل مجموعات تجارية للنشاط PP2A ومع التخزين السليم، توفير مكونات الإنزيم متاحة بسهولة أن هيكلياً مستقرة لفترات طويلة من الزمن.

قبل إجراء الاختبار بسين وجسين، استخدمت aSyn كعنصر إيجابي لحفز النشاط PP2Ac وتحديد كمية PP2Ac المطلوبة لفحوصات، وأيضا للتأكد من أن تظل البيانات الناتجة في الجدول مع المنحنى القياسي (150-2400 pmol بو4 ). جدير بالذكر أنه إذا يحفز aSyn PP2Ac جداً بشدة، على الرغم من أن رد الفعل عادة الخطي، سوف تذهب البيانات خارج النطاق ويعجل بالمواد الكيميائية في حل مالية، مما يجعل من المستحيل على قياس كميات دقيقة من المفرج عنهم مجاناً-ص. ب.4 مع لوحة القارئ.

نظراً لأن يساهم aSyn PP2Ac النشاط في الجسم الحي وفي المختبر12،19،21،،من2325، وأن يكون جميع سينوكلينس التماثل الكبير، فقد كان الافتراض بأن جميع أفراد الأسرة سينوكلين قد تكون قادرة على حفز PP2Ac في الخلية فحوصات مجانية. باستخدام مقايسة اللونية الموصوفة هنا، واتضح أن جميع سينوكلينس ثلاث الماشوب (aSyn, بسين, جسين) في الواقع، حفز النشاط PP2Ac، وزيادة إمكانية أن جميع سينوكلينس الثلاثة قد تؤدي وظائف مماثلة في الجهاز العصبي. ولكن الدماغ من باركنسون أو العته مع ليفي الهيئة الحالات يكون أقل نشاط PP2Ac في الأنسجة التي تحتوي على درجة عالية مجمعة aSyn23. الأنسجة الماوس إيواء ليفي أيضا يحمل أمراض الجسم مثل خفض النشاط PP2Ac25. هذا، وبيانات جديدة في الشكل 3 ، فضلا عن البيانات السابقة من aSyn خروج المغلوب الفئران12، توحي بقوة أن بسين وﻻ جسين يمكن عادة التعويض عن فقدان aSyn القابلة للذوبان في الدماغ، أو بدلاً من ذلك أنه لا يجوز تلك homologs سينوكلين إقران PP2Ac بشدة باعتباره aSyn كما هو مبين (الشكل 3). أطلس الدماغ الين يظهر كولوكاليزيشن من جميع مرناس سينوكلين الثلاثة في العديد من مناطق الدماغ، وعلى الرغم من الفئران خروج المغلوب سينوكلين الثلاثي قد ولدت9،33، PP2Ac لم يتم تقييم النشاط في هذا النموذج. من المثير للاهتمام، aSyn التي يتم فوسفوريلاتيد في Ser129 بمثل بولو كيناز 2، أقل قدرة على تنشيط PP2Ac12، ولكن توحي الأدلة المعروضة هنا بسين الفسفرة بسين أن من غير المحتمل أن تؤثر على نشاط PP2Ac، كما بسين القليل جداً ونزل مع PP2Ac في المخ الماوس (الشكل 3). أخذت معا، تشير البيانات إلى أن المغيرون النشاط PP2Ac الذاتية، مثل aSyn، يحتمل المساهمة في العناية بالصحة والمرض.

البروتوكول الواردة هنا تقنية بسيطة لكنها قوية لتحديد قدرة PP2Ac على ديفوسفوريلاتي الركازة فوسفوبيبتيدي استجابة للعلاجات المختلفة. على سبيل المثال، يمكن استخدام هذه المنهجية نفسها لاختبار المنشطات PP2Ac الأخرى، مثل سيراميد، فضلا عن إمكانية التداوي رواية34، أو لتقييم أثر PP2Ac مثبطات في المختبر. من المهم أيضا أن نشير إلى أن فحوصات مماثلة يمكن قياس نشاط PP2Ac وقد تم عزلة بواسطة 6 1 إيمونوبريسيبيتيشن من مقتطفات الخلية أو أنسجة الجسم، كما تم وصفه سابقا بالمؤلفين12،19، 25-تطبيقات المستقبل للمقايسة الملكيت الأخضر موجودة خارج قياس النشاط PP2Ac، كنشاط ATP يمكن أيضا تحديد استخدام مثل هذا فحص.

ملاحظة، يجب إنشاء منحنى قياسي في كل مرة لكل مقايسة PP2Ac المستقلة. وملزمة لضمان أن جميع الكواشف تستخدم فوسفات حرة، الفوسفات الحرة مصطنع زيادة الإشارات الخلفية وتعطي نتائج خاطئة. اليوم من الفحص الضروري لإعداد كافية حل مالية جديدة لجميع العينات تكون جزيئي. أيضا، مالية جيدة فقط اليوم بأنها مصنوعة ويميل إلى تعمد بعد بضع ساعات. PP2Ac تم شراؤها من مورد يجب أن تكون الكوتيد وتخزينها مجمدة فور تلقيه لمنع تجميد دورات ذوبان الجليد التي تحد من نشاطها. كما يمكن أن ديفوسفوريلاتي أخرى فوسفاتاسيس الركيزة حزب العمال (مثلاً PP1 و PP535)، عند تحليل مقتطفات الخلية أو الأنسجة التي لا تم عزل PP2Ac من إيمونوبريسيبيتيشن، يجب أن يتم تمرير العينات عبر الأعمدة إلى إزالة الفوسفات مجاناً ويجب أن تستخدم مثبطات محددة من فوسفاتاسيس تأكيد خصوصية الفوسفاتيز، كما هو موضح سابقا18.

الإفصاحات

وكان بيريز الدكتور عضو هيئة التدريس في قسم طب الأعصاب في جامعة بيتسبرغ مدرسة الطب من عام 1999 – 2011.

شكر وتقدير

الكتاب نقدر جهود أعضاء المختبر السابقة ماكيت كندرا، ساندرا سلوشير، وتشن جي الذين عملوا لتحسين الأسلوب. يشكر المؤلفون أيضا المعاهد الوطنية للصحة، مايكل ج. فوكس مؤسسة، تكساس تكنولوجيا جامعة الصحة العلوم مركز الباسو العلماء النشاط البحث المشروع (SARP)، ليزانيل ومؤسسة كولدويل كولبير، "التحالف ضمور نظام متعددة"، البحوث الأسرية هوي، وأنا مي دويل هدية الأموال من أجل تقديم الدعم المالي لهذا البحث.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي >كاشف < / قوي > 1
م Trizma BaseSigma-AldrichT15003
CaCl 2 < / sub > (كلوريد الكالسيوم) فيشرScientificC70-500
مركز حمض الهيدروكلوريك & nbsp ؛  JT Baker9535-33
موليبدات الأمونيومسيجما ألدريتشA1343
ملح أكسالات الملكيت الأخضرسيجما ألدريتشM6880
توين 20سيجما ألدريتشP9416
ثريونين فوسفوببتيد (KRpTIRR) نيوإنجلاند الببتيد ذ م مBP12-011
KH2< / sub>PO4< / sub> ( فوسفات البوتاسيوم)سيجما ألدريتش795488
الوحدة الفرعية المؤتلفة البشرية PP2A Cكايمان الكيميائية   ؛10011237
المؤتلف البشري &alpha ؛ - synucleinrPeptideS-1001-2
المؤتلف البشري & بيتا ؛ - سينوكلينrPeptideS-1003-2
المؤتلف البشري & جاما ؛ - سينوكلينrPeptideS-1007-2
PP2Ac 1D6 الجسم المضادMillipore05-421
PP2Ac الأجسام المضادةNovus BiologicalsNB100-92217
aSyn الجسم المضاد C-20سانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-7011-R
bSyn الجسم المضاد EP1537YNovus BiologicalsNB100-79903
gSyn الجسم المضاد E-20سانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-10698
أعمدة تحلية Zeba Spin ، 7K MWCO ، 0.5 ملThermo-Fisher Scientific89882
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment/Software
Multiskan Spectrum PlateReader Thermo Fisher Scientific 51118650
مقياس الأس الهيدروجيني فيشر العلمية 13-636-AB15P

المراجع

  1. Li, J., Henning Jensen, P., Dahlstrom, A. Differential localization of alpha-, beta- and gamma-synucleins in the rat CNS. Neurosci. 113 (2), 463-478 (2002).
  2. Iwai, A., et al. The precursor protein of non-A beta component of Alzheimer's disease amyloid is a presynaptic protein of the central nervous system. Neuron. 14 (2), 467-475 (1995).
  3. Irizarry, M. C., et al. Characterization of the precursor protein of the non-A beta component of senile plaques (NACP) in the human central nervous system. J Neuropathol Exp Neurol. 55 (8), 889-895 (1996).
  4. Shibayama-Imazu, T., et al. Cell and tissue distribution and developmental change of neuron specific 14 kDa protein (phosphoneuroprotein 14). Brain Res. 622 (1-2), 17-25 (1993).
  5. Nakajo, S., Shioda, S., Nakai, Y., Nakaya, K. Localization of phosphoneuroprotein 14 (PNP 14) and its mRNA expression in rat brain determined by immunocytochemistry and in situ hybridization. Brain Res Mol Brain Res. 27 (1), 81-86 (1994).
  6. Buchman, V. L., et al. Persyn, a member of the synuclein family, has a distinct pattern of expression in the developing nervous system. J Neurosci. 18 (22), 9335-9341 (1998).
  7. George, J. M., Jin, H., Woods, W. S., Clayton, D. F. Characterization of a novel protein regulated during the critical period for song learning in the zebra finch. Neuron. 15 (2), 361-372 (1995).
  8. Withers, G. S., George, J. M., Banker, G. A., Clayton, D. F. Delayed localization of synelfin (synuclein, NACP) to presynaptic terminals in cultured rat hippocampal neurons. Brain Res Dev Brain Res. 99 (1), 87-94 (1997).
  9. Greten-Harrison, B., et al. alphabetagamma-Synuclein triple knockout mice reveal age-dependent neuronal dysfunction. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19573-19578 (2010).
  10. Benskey, M. J., Perez, R. G., Manfredsson, F. P. The contribution of alpha synuclein to neuronal survival and function - Implications for Parkinson's Disease. J Neurochem. , (2016).
  11. Perez, R. G., Hastings, T. G. Could a loss of alpha-synuclein function put dopaminergic neurons at risk? J Neurochem. 89 (6), 1318-1324 (2004).
  12. Lou, H., et al. Serine 129 phosphorylation reduces the ability of alpha-synuclein to regulate tyrosine hydroxylase and protein phosphatase 2A in vitro and in vivo. J Biol Chem. 285 (23), 17648-17661 (2010).
  13. Akil, O., et al. Localization of Synucleins in the Mammalian Cochlea. JARO. 9 (4), 452-463 (2008).
  14. Guardia-Laguarta, C., et al. alpha-Synuclein Is Localized to Mitochondria-Associated ER Membranes. J Neurosci. 34 (1), 249-259 (2014).
  15. Shibayama-Imazu, T., et al. Distribution of PNP 14 (beta-synuclein) in neuroendocrine tissues: localization in Sertoli cells. Mol Reprod Dev. 50 (2), 163-169 (1998).
  16. Goedert, M. Alpha-synuclein and neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci. 2 (7), 492-501 (2001).
  17. Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H. 100 years of Lewy pathology. Nat Rev Neurol. 9 (1), 13-24 (2013).
  18. Alerte, T. N., et al. Alpha-synuclein aggregation alters tyrosine hydroxylase phosphorylation and immunoreactivity: lessons from viral transduction of knockout mice. Neurosci Lett. 435 (1), 24-29 (2008).
  19. Peng, X., Tehranian, R., Dietrich, P., Stefanis, L., Perez, R. G. Alpha-synuclein activation of protein phosphatase 2A reduces tyrosine hydroxylase phosphorylation in dopaminergic cells. J Cell Sci. 118 (Pt 15), 3523-3530 (2005).
  20. Perez, R. G., et al. A role for alpha-synuclein in the regulation of dopamine biosynthesis. J Neurosci. 22 (8), 3090-3099 (2002).
  21. Porras, J. L., Perez, R. G. Ch. III. Nova Publishers - Alpha-Synuclein. Kanowitz, H. C., Polizzi, M. , NOVA Science Publishers. 51-70 (2014).
  22. Tehranian, R., Montoya, S. E., Van Laar, A. D., Hastings, T. G., Perez, R. G. Alpha-synuclein inhibits aromatic amino acid decarboxylase activity in dopaminergic cells. J Neurochem. 99 (4), 1188-1196 (2006).
  23. Wu, J., et al. Lewy-like aggregation of alpha-synuclein reduces protein phosphatase 2A activity in vitro and in vivo. Neuroscience. 207, 288-297 (2012).
  24. Geng, X., et al. alpha-Synuclein binds the K(ATP) channel at insulin-secretory granules and inhibits insulin secretion. Am J Physiol Endocrinol Metab. 300 (2), E276-E286 (2011).
  25. Farrell, K. F., et al. Non-motor parkinsonian pathology in aging A53T alpha-synuclein mice is associated with progressive synucleinopathy and altered enzymatic function. J Neurochem. 128 (4), 536-546 (2014).
  26. Janssens, V., Goris, J. Protein phosphatase 2A: a highly regulated family of serine/threonine phosphatases implicated in cell growth and signalling. Biochem J. 353 (Pt 3), 417-439 (2001).
  27. Wlodarchak, N., Xing, Y. PP2A as a master regulator of the cell cycle. Critical reviews in biochemistry and molecular biology. 51 (3), 162-184 (2016).
  28. George, J. M. The synucleins. Genome Biol. 3 (1), (2002).
  29. Fathi, A. R., Krautheim, A., Lucke, S., Becker, K., Juergen Steinfelder, H. Nonradioactive technique to measure protein phosphatase 2A-like activity and its inhibition by drugs in cell extracts. Anal Biochem. 310 (2), 208-214 (2002).
  30. Hashimoto, M., et al. An antiaggregation gene therapy strategy for Lewy body disease utilizing beta-synuclein lentivirus in a transgenic model. Gene Ther. 11 (23), 1713-1723 (2004).
  31. Hashimoto, M., Rockenstein, E., Mante, M., Mallory, M., Masliah, E. beta-Synuclein inhibits alpha-synuclein aggregation: a possible role as an anti-parkinsonian factor. Neuron. 32 (2), 213-223 (2001).
  32. McAvoy, T., Nairn, A. C. Serine/threonine protein phosphatase assays. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 18, (2010).
  33. Anwar, S., et al. Functional alterations to the nigrostriatal system in mice lacking all three members of the synuclein family. J Neurosci. 31 (20), 7264-7274 (2011).
  34. Vargas-Medrano, J., et al. Novel FTY720-based compounds stimulate neurotrophin expression and phosphatase activity in dopaminergic cells. ACS Med Chem Lett. 5 (7), 782-786 (2014).
  35. Moorhead, G. Chapter 3, Small-molecule inhibitors of Ser/Thr protein phosphatases. Methods in Molecular Biology. 365, Protein Phosphatase Protocols, Humana Press. Totowa, New Jersey. 23-38 (2007).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

تصحيح


Formal Correction: Erratum: Recombinant α- β- and γ-Synucleins Stimulate Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Activity in Cell Free Assays
Posted by JoVE Editors on 4/01/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Recombinant α- β- and γ-Synucleins Stimulate Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Activity in Cell Free Assays

One of the authors' names was corrected from:

Brian Marcus

to:

Brian S. Marcus

الوسوم

PP2Ac pNPP

مقالات ذات صلة