Method Article

وإنتاجية عالية منصة ميكروأري الخليوي لتحليل مترابط من تمايز الخلايا وقوات الجر

DOI:

10.3791/55362

⸱

March 1st, 2017

 ,  , 
1Department of Bioengineering, University of Illinois at Urbana–Champaign

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وينظم تمايز الخلايا من قبل مجموعة من العوامل microenvironmental، بما في ذلك تكوين مصفوفة والمواد الركيزة خصائص. نحن هنا وصف تقنية استخدام ميكروأرس خلية بالتعاون مع قوة الجر المجهري لتقييم كلا تمايز الخلايا والنشاط الحيوي التفاعلات خلية الركيزة بوصفها وظيفة من السياق microenvironmental.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ميكروأرس الخلوية Microfabricated، والتي تتكون من مجموعات مطبوعة الاتصال الجزيئات الحيوية على سطح هيدروجيل مرن، وتوفير رقابة مشددة، الإنتاجية العالية نظام هندسيا لقياس أثر الإشارات البيوكيميائية المحتشدة على تمايز الخلايا. وقد أثبتت الجهود التي بذلت مؤخرا باستخدام المجهرية الخلية فائدتها للدراسات اندماجي الذي يتم العديد من العوامل microenvironmental بشكل متواز. ومع ذلك، فقد ركزت هذه الجهود في المقام الأول على التحقيق في الآثار من الاشارات البيوكيميائية على استجابات الخلايا. هنا، نقدم منصة الخلية ميكروأري مع خصائص المواد الانضباطي لتقييم كلا تمايز الخلايا المناعي والنشاط الحيوي خلية الركيزة التفاعلات التي كتبها قوة الجر المجهري. للقيام بذلك، وقد وضعنا شكلين مختلفين باستخدام الهلاميات المائية بولي أكريلاميد متفاوتة معامل يونغ ملفقة على أي من شرائح المجهر أو أطباق بتري الزجاج السفلي. ونحن نقدم بيزالممارسات ر واستكشاف الأخطاء وإصلاحها لتصنيع القطع الصغيرة على هذه ركائز هيدروجيل، وزراعة الخلايا لاحقة على المجهرية، والحصول على البيانات. ومناسبة تماما هذا المنبر لاستخدامها في التحقيقات في العمليات البيولوجية التي على حد سواء والكيمياء الحيوية (على سبيل المثال، خارج الخلية تكوين مصفوفة) وفيزيائية (على سبيل المثال، الركيزة صلابة) العظة قد تلعب كبير، المتقاطعة الأدوار.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التفاعلات بين الخلايا والمحيطة العوامل microenvironmental تتوسط مجموعة كبيرة ومتنوعة من العمليات البيولوجية في جميع أنحاء التنمية، التوازن، والتسبب 1، 2، 3، 4 المرض. وتشمل هذه التفاعلات microenvironmental تسليم من العوامل القابلة للذوبان إلى الخلايا، خلية مصفوفة ملزمة، والتفاعلات خلية خلية عبر يجند مستقبلات ملزمة. وبالإضافة إلى الاعتبارات الحيوية المذكورة أعلاه، المعلمات الفيزيائية الحيوية، مثل الخصائص الميكانيكية الركيزة (على سبيل المثال، معامل يونغ، المسامية) وشكل الخلية، وما يرتبط بها من mechanotransduction المصب اكتسبت على نحو متزايد الاعتراف بها الوسطاء الرئيسيين من تمايز الخلايا 5، 6، 7، 8، 9 10. الإشارات الناتجة من هذه التفاعلات microenvironmental بمثابة مدخلات لشبكات الجينات ومسارات إشارات. وعلاوة على ذلك، كما توفر هذه المكونات خلايا ذاتية التغذية الراجعة للالمكروية عبر العوامل يفرز والانزيمات المهينة المصفوفة، واستكمال حلقة معقدة شارك التنظيمي بين البرامج الجينية الخلايا الذاتية والعوامل خلية خارجي microenvironmental 5 و 11 و 12.

وقد ثبت أن استخدام نظم هندسيا لعرض رقابة من العوامل microenvironmental مفيدا في مجموعة من السياقات المختلفة 13 و 14 و 15. وقد سهلت أنظمة Microfabricated على وجه الخصوص الزخرفة المكانية دقيقة من البروتينات والخلايا وكذلك تحليل بشكل متوازي للغاية عبر التصغير 13، 16، 17، 18، 19، 20، 21، 22. تمثل ميكروأرس خلية واحدة مثل هذا النظام microfabricated التي مجموعات من الجزيئات الحيوية هي من الاتصال المطبوعة على وهيدروجيل الركيزة بولي أكريلاميد مرن 23، 24، 25. إدراج عناصر خلية لاصقة (وهي البروتينات المصفوفة) تمكن التصاق مستمر الخلية والثقافة على القطع الصغيرة، التي كثيرا ما يتبعه تحليل المصب عبر مناعية وصحفيين الفلورسنت. وجهت ميكروأرس خلية منتجة نحو تحقيق تحسين فهم خلية الكبد النمط الظاهري 23، 26، العصبية السلائف التمايز 27، معمر الذي كان ينتظرقرارات ذ السلف مصير 28، الجنينية الخلايا الجذعية صيانة / التمايز 23، 29، 30، سرطان الرئة ورم خبيث 31، والاستجابة العلاجية في سرطان الجلد 32. لقد أثبتت مؤخرا استخدام ميكروأرس الخليوي لتحديد دور المصفوفة خارج الخلية (ECM) تكوين البروتين في مواصفات الأديم 33، الكبد السلف التمايز 34 و 35، وورم الرئة استجابة الخلية المخدرات 36. في هذه الأعمال، فقد ركزنا على توسيع قدرات اندماجي من منصة مجموعة واستكشاف تقاطعات إشارات الخلية الجوهرية مع تكوين مصفوفة خارج الخلية والميكانيكا الحيوية. وبالإضافة إلى ذلك، قمنا بتنفيذ قراءات الفيزيائية الحيوية في هذه المنصة مجموعة لتوفير القدرة على كميا characterize دور انقباض الخلايا في التمايز عمليات 35. للقيام بذلك، ونحن متكاملة المجهري قوة الجر (TFM) مع ميكروأرس خلية لتمكين تقييم الإنتاجية العالية من الجر ولدت الخلية. الآلية المالية المؤقتة هي طريقة تستخدم على نطاق واسع لقياس قوى الجر ولدت الخلية، وقدمت أفكارا هامة بشأن تنسيق وحيدة الخلية وظيفة على مستوى الأنسجة لتكوين والميكانيكا الحيوية من المكروية المحلية 37، 38، 39، 40. وهكذا، والجمع بين الآلية المالية المؤقتة مع ميكروأرس خلية يوفر نظام الإنتاجية العالية لقياس الرئيسية، المعلمات الفيزيائية الحيوية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية.

منصة الخلية ميكروأري هو موضح هنا تتكون من أربعة أقسام: تلفيق ركائز بولي أكريلاميد، تصنيع المصفوفات، زراعة الخلايا وقراءات الفحص، وتحليل البيانات. نرىالشكل رقم 1 لملخص تخطيطي لثلاثة أقسام التجريبية الأولى. انظر الشكل 2 للحصول على ملخص تخطيطي من القسم الأخير مع التركيز على تحليل البيانات المناعي. من أجل التكيف مع منصة الخلية ميكروأري لدراسات النشاط الحيوي التفاعلات خلية الركيزة، كنا ركائز بولي أكريلاميد معامل الانضباطي يونغ لكن المسامية مماثلة، في ون وآخرون. 41. لتمكين القياسات الآلية المالية المؤقتة من قوات من الخلايا على الركيزة التي تمارسها، نفذنا بيتري شكل صحن زجاج القاع بالإضافة إلى المجهر الزجاج السميك في كثير من الأحيان الشرائح التي تستخدمها الجماعات الأخرى. وهكذا، هذه المنصة الخلية ميكروأري قادرة على قياسات موازية للتمايز الخلايا عن طريق المناعي على الشرائح المجهر والقوى المولدة الخليوي عبر الآلية المالية المؤقتة على أطباق الزجاج السفلي منفصلة. لقد طبقنا أيضا العديد من التحسينات على النهج التحليلي يشيع استخدامها مع المجهرية الخلية. Specificalلاي، بدلا من حدودي Z-التهديف من شدة جزيرة الشاملة، نقيس كثافة وحيدة الخلية وتطبيق التطبيع quantile في ذلك لحساب التوزيعات غير العادية وأكثر دقة وصف السلوك الخلوي. ونعتقد أن هذه التحسينات توفر فائدة معينة تجاه التحقيقات في العمليات البيولوجية التي العظة على حد سواء البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية تلعب كبيرة، والأدوار المتداخلة. وعلاوة على ذلك، وإدخال تحسينات تحليلية لدينا تتيح تطبيق المجهرية الخلية إلى دراسات لمجموعة من الوظائف الخلوية التي وحيدة الخلية والسلوك على مستوى السكان تتباعد.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تصنيع بولي أكريلاميد ركائز

  1. ركائز الزجاج النظيفة - إما شرائح المجهر القياسية لالمناعي نقطة أو الزجاج السفلي 35 مم أطباق بتري إدارة المرافق الكلية - من أجل ضمان بولي أكريلاميد الأمثل هيدروجيل تلفيق والنزاهة خلال زراعة الخلايا. بدلا من ذلك، استخدام ركائز الزجاج قبل تنظيفها.
    1. تزج ركائز الزجاج في 0.25٪ ت / ت تريتون X-100 في الماء المقطر (DH 2 O). وضع ركائز على شاكر المداري لمدة 30 دقيقة.
    2. إزالة تريتون X-100 حل وشطف ركائز 5 مرات مع منغمسين في شطف النهائي ومكان على شاكر المداري لمدة 30 دقيقة درهم 2 O. اترك ركائز.
    3. إزالة درهم 2 O وتزج ركائز في الأسيتون. وضع ركائز على شاكر المداري لمدة 30 دقيقة.
    4. إزالة الأسيتون وتزج ركائز في الميثانول. وضع ركائز على شاكر المداري لمدة 30 دقيقة.
    5. إزالة الميثانول وشطف ركائز 5 مرات مع DH <فرعية> 2 ركائز O. تزج في 0.05 N هيدروكسيد الصوديوم ومكان على شاكر المداري لمدة 1 ساعة.
      تنبيه: هيدروكسيد الصوديوم هو الكاوية للغاية ويمكن أن يسبب حروقا جلدية شديدة والأضرار التي تصيب العين. ارتداء قفازات واقية، ملابس، وحماية العين.
    6. إزالة محلول هيدروكسيد الصوديوم وشطف ركائز 5 مرات مع DH 2 O. استخدام تصفية الهواء المضغوط لتجف ركائز وتخبز على 110 درجة مئوية على صفيحة ساخنة حتى الجاف (5-15 دقيقة). ويمكن تخزين ركائز تنظيفها في درجة حرارة الغرفة لأجل غير مسمى.
  2. Silanize ركائز الزجاج النظيفة من أجل ضمان الحجز على هيدروجيل بولي أكريلاميد.
    1. تزج ركائز الزجاج النظيفة في طازجة 2٪ ت / ت 3- (trimethoxysilyl) بروبيل ميتاكريليت (3) مدمجة في الإيثانول. وضع ركائز على شاكر المداري لمدة 30 دقيقة.
      تنبيه: 3 TPM هو سائل قابل للاحتراق. الابتعاد عن الحرارة، والشرر، اللهب المكشوف، والأسطح الساخنة واستخدام فقط في غطاء الدخان الكيميائية.
    2. إزالة حل 3-TPM وتزج ركائز في الإيثانولنول. وضع ركائز على شاكر المداري لمدة 5 دقائق.
    3. استخدام تصفية الهواء المضغوط لتجفيف ركائز وتخبز على 110 درجة مئوية على صفيحة ساخنة حتى الجاف (5-15 دقيقة). ويمكن تخزين ركائز Silanized في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 1 في الشهر.
  3. الخيار 1: يتم تصنيع الهلاميات المائية بولي أكريلاميد على الشرائح المجهر silanized لالمناعي نقطة النهاية.
    1. يعد حل قبل البوليمر في DH 2 O مع الأكريلاميد / نسبة bisacrylamide المطلوب (ث / ت) نسبة الى افتعال ركائز مع الرجوعية يونغ من 4 كيلو باسكال (4٪ الأكريلاميد، 0.4٪ bisacrylamide)، و 13 كيلو باسكال (6٪ الأكريلاميد، 0.45 ٪ bisacrylamide)، أو 30 كيلو باسكال (8٪ الأكريلاميد، 0.55٪ bisacrylamide) والمسامية مماثلة، في ون وآخرون. 41. حل دوامة حتى اضحة وفلتر مع حقنة 0.2 ميكرون. ويمكن تخزين حلول قبل البوليمر في 4 درجة مئوية لمدة 3 أشهر.
      تنبيه: التعرض لمادة الأكريلاميد أو bisacrylamide يمكن أن يؤدي إلى السمية الحادة، neurotoxicity، والاحمرار. ارتداء قفازات واقية، ملابس، وحماية العين.
    2. يعد حل photoinitiator من 20٪ ث / ت Irgacure 2959 في الميثانول. هذا الحل photoinitiator لا يمكن تخزينها ويجب أن يكون مستعدا جديد في كل مرة.
    3. مزيج الحلول photoinitiator قبل البوليمر وفي 9: نسبة: 1 (photoinitiator قبل البوليمر). ديغا اختياريا مع فراغ الغرفة لمدة 15 دقيقة لإزالة الفقاعات.
    4. وضع الشرائح silanized في صينية تجفيف الزجاج والماصة 100 ميكرولتر من 9: 1 قبل البوليمر: حل photoinitiator على كل شريحة. تغطية بلطف كل شريحة مع مم ساترة 22 × 60 مع تجنب خلق فقاعات. لاحظ أن ساترة يمنع تثبيط رد الفعل البلمرة بواسطة الأكسجين.
    5. صينية تجفيف مكان في crosslinker الأشعة فوق البنفسجية وفضح الشرائح إلى 365 نانومتر الأشعة فوق البنفسجية ولمدة 10 دقيقة (4 واط / م 2). تحسين وقت البلمرة حسب الحاجة. يعد تعرضات صعوبة خطر إزالة ساترة بسبب overpolymerization. التعرض أقصر صunderpolymerization ISK وانخفاض الاستقرار هيدروجيل.
    6. تزج الهلاميات المائية في DH 2 O لمدة 5 دقائق. إزالة coverslips بشفرة الحلاقة، مع الحرص على عدم الإضرار الهلاميات المائية بلمرة.
    7. ترك الهلاميات المائية في DH 2 O في درجة حرارة الغرفة ل1-3 د، وتغيير O 2 درهم يوميا. يذوى الهلاميات المائية عند 50 درجة مئوية على صفيحة ساخنة حتى تجف (15-30 دقيقة) وتخزينها في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 3 أشهر.
  4. الخيار 2: يتم تصنيع الفلورسنت الهلاميات المائية بولي أكريلاميد التي تحتوي حبة على الزجاج القاع أطباق بتري silanized 35 مم للتقييم المباشر لالتفاعلات خلية الركيزة باستخدام الآلية المالية المؤقتة.
    1. يصوتن محلول المخزون من 1 ميكرون الخرز الفلورسنت لمدة 15 دقيقة لتفريق المجاميع.
    2. يعد حل قبل البوليمر في DH 2 O مع الأكريلاميد / نسبة bisacrylamide المطلوب (ث / ت) نسبة الى افتعال ركائز مع الرجوعية يونغ من 4 كيلو باسكال (4٪ الأكريلاميد، 0.4٪ bisacrylamide)، و 13 كيلو باسكال (6٪ الأكريلاميد، 00.45٪ bisacrylamide)، أو 30 كيلو باسكال (8٪ الأكريلاميد، 0.55٪ bisacrylamide) والمسامية مماثلة، في ون وآخرون. 41. حل دوامة حتى اضحة وفلتر مع حقنة 0.2 ميكرون. ويمكن تخزين حلول قبل البوليمر في 4 درجة مئوية لمدة 3 أشهر.
      تنبيه: التعرض لمادة الأكريلاميد أو bisacrylamide يمكن أن يؤدي إلى تسمم حاد، العصبية، والاحمرار. ارتداء قفازات واقية، ملابس، وحماية العين.
    3. إضافة الخرز الفلورسنت إلى حل قبل البوليمر في تركيز النهائي من 0.2٪ ت / ت ودوامة لخلط.
    4. يعد حل photoinitiator من 20٪ ث / ت Irgacure 2959 في الميثانول. هذا الحل photoinitiator لا يمكن تخزينها ويجب أن يكون مستعدا جديد في كل مرة.
    5. مزيج من الحلول قبل البوليمر / حبة وphotoinitiator في 9: 1 (قبل البوليمر / حبة: photoinitiator) النسبة. ديغا اختياريا مع فراغ الغرفة لمدة 15 دقيقة لإزالة الفقاعات.
    6. وضع silanized 35 أسفل الزجاج أطباق بتري ملم في علبة زجاجية التجفيف وصIPET 20 ميكرولتر من 9: حل photoinitiator على مركز كل طبق: 1 قبل البوليمر / حبة. تغطية بلطف كل شريحة مع ساترة دائرية 12 ملم مع تجنب خلق فقاعات. لاحظ أن ساترة يمنع تثبيط رد الفعل البلمرة بواسطة الأكسجين.
    7. من أجل توزيع حبات الفلورسنت على سطح هيدروجيل، عكس الأطباق وترك في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة، في الربوة وآخرون. 42.
    8. في حين لا يزال مقلوب، فضح الأطباق إلى 365 نانومتر الأشعة فوق البنفسجية ولمدة 10 دقيقة (4 واط / م 2). تحسين وقت البلمرة حسب الحاجة. يعد تعرضات صعوبة خطر إزالة ساترة بسبب overpolymerization. أقصر underpolymerization التعرض للمخاطر وانخفاض الاستقرار هيدروجيل.
    9. تزج الهلاميات المائية في 0.1 M 4- (2-هيدروكسي) حامض -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) العازلة وترك في درجة حرارة الغرفة في ليلة وضحاها الظلام. إزالة coverslips بعناية بشفرة الحلاقة، مع الحرص على عدم الإضرار البوليمرالهلاميات المائية rized بين.
    10. يذوى الهلاميات المائية عند 50 درجة مئوية على صفيحة ساخنة حتى الجافة (15-30 دقيقة). ويمكن تخزين الهلاميات المائية في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 3 أشهر.

2. تصنيع المصفوفات

  1. إعداد مخازن لطباعة الجزيئات الحيوية. استخدام المخزن المؤقت الطباعة المناسب لالجزيئات الحيوية التي تهم. عازلة الطباعة عامل النمو (GF) هي مناسبة على نطاق واسع لفئات أخرى من الجزيئات، مثل بروابط خلية خلية.
    1. لإعداد 2 × ECM عازلة الطباعة البروتين، إضافة 164 ملغ من خلات الصوديوم و 37.2 ملغ من ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA) إلى 6 مل درهم 2 O. دوامة واحتضان عند 37 درجة مئوية لإذابة تماما. بعد الإذابة، إضافة 50 ميكرولتر من قبل تحسنت تريتون X-100 و 4 مل من الجلسرين. دوامة واحتضان عند 37 درجة مئوية مرة أخرى لإذابة. إضافة 40 - 80 ميكرولتر من حمض الخليك الجليدي، المعايرة لضبط درجة الحموضة إلى 4.8. ويمكن تخزين 2 × ECM عازلة الطباعة البروتين في 4° مئوية لمدة 1 شهر.
      تنبيه: حمض الخليك غير قابلة للاشتعال والتآكل. ارتداء قفازات واقية، ملابس، وحماية العين.
    2. لإعداد 2 × عازلة الطباعة GF، إضافة 105.5 ملغ خلات الصوديوم وEDTA 37.2 ملغ إلى 6 المالحة الفوسفات مخزنة مل (PBS). دوامة واحتضان عند 37 درجة مئوية لإذابة تماما. بعد الإذابة، إضافة 100 ملغ 3 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (الفصول) و 4 مل من الجلسرين. ويمكن تخزين 2 × عازلة الطباعة البروتين GF عند 4 درجة مئوية لمدة 1 شهر.
  2. إعداد لوحة المصدر.
    1. في 384 جيدا صفيحة-V السفلي، والجمع بين كميات متساوية من 2 عازلة × الطباعة مع كل حل جزيء حيوي في ضعف تركيز الهدف.
      ملاحظة: إن تركيز الهدف المناسب للبروتينات ECM الأكثر شيوعا هو 250 ميكروغرام / مل في حين أن تركيزات الهدف لأنواع أخرى من العوامل المحتشدة تختلف تبعا الاحتفاظ في هيدروجيل وظيفة بيولوجية. الحجم الإجمالي في كل بئر يمكن أن يكونما يصل الى 5 ميكرولتر وليس من الضروري أن يكون أكثر من 15 ميكرولتر. بالإضافة إلى تركيبات جزيء حيوي من الفائدة، وتشمل علامة فلوري العريض من أجل تسهيل تحليل الصور المصب. استخدام ديكستران-رودامين مترافق (2.5 ملغ / مل).
    2. خلط كل بئر دقيق من قبل pipetting، مع الحرص على عدم توليد فقاعات. الطرد المركزي صفيحة مصدر لمدة 1 دقيقة في 100 × ز. افتعال المجهرية باستخدام لوحات مصدر أعدت في نفس اليوم وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى تلفيق ميكروأري.
  3. دبابيس نظيفة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة قبل كل تشغيل ميكروأري تلفيق. تحميل دبابيس نظيفة مباشرة إلى رأس الطباعة من microarrayer.
  4. إعداد microarrayer والبرنامج باستخدام برنامج الشركة المصنعة. على الرغم من أن الخطوات التالية هي محددة جزئيا إلى microarrayer معين المستخدمة هنا، وتشغيل أكثر microarrayers مشابهة.
    1. تشغيل وحدة المرطب، وضبط نقطة مجموعة إلى 65٪ RH (غير-condensing)، وانتظر حتى مقياس غلفاني يطابق نقطة مجموعة. وضع لوحة مصدر في المحول المناسب.
    2. يذوى ركائز هيدروجيل عند 50 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، ووضع في المحول المناسب. وmicroarrayer ديه محولات لكل الشرائح المجهر وmicroplates. لتنظيم زجاج القاع أطباق بتري 35 مم، تحميل الأطباق إلى صفيحة 6 جيدا ووضع صفيحة في محول صفيحة على arrayer.
    3. ضبط المعلمات من البرنامج لتعكس بدقة تخطيط لوحة مصدر، تصميم مجموعة، وشكل المطلوب (على سبيل المثال، شريحة المجهر أو صفيحة تحتوي على 35 مم أطباق بتري). وتشمل الخطوات غسل باستخدام كل سلفوكسيد الماء وثنائي ميثيل ([دمس]) بين كل حالة من أجل منع ترحيل والتلوث.
    4. تبدأ مجموعة تلفيق، والتحقق من أي أقل كثيرا من ساعة مرة واحدة أن الرطوبة لم انخفض إلى أقل من 65٪ RH (دون تكاثف) والتي لم يتم انسداد دبابيس. إذا كان humiوانخفض dity بشكل غير متوقع، وقفة تنظيم لملء المرطب واضحة الأنابيب المرتبطة التكثيف. إذا تم انسداد دبابيس، وقفة تنظيم لتنظيف المسامير أو استبدال خلاف مع دبابيس تنظيفها مسبقا. لاحظ أنه من الممكن لمجموعة أنواع متعددة من الجزيئات الحيوية بالتتابع على نفس ركائز المقدمة وقت التجفيف كاف (أي 4 ساعات ليلة وضحاها).
    5. مرة واحدة هذا البرنامج هو الكامل، ووضع المصفوفات ملفقة في صندوق الشرائح أو صفيحة مغطاة بورق الألمنيوم في درجة حرارة الغرفة و 65٪ RH (دون تكاثف) بين عشية وضحاها. لاحظ أنه قد يكون من الضروري لتقييم جودة مجموعة والاحتفاظ بها باستخدام البقع بروتين العام أو المناعي. رؤية برافمان وآخرون. لمزيد من التفاصيل 25.

3. خلية ثقافة والفحص قراءات

  1. اليوم بعد التصنيع، ووضع ركائز المحتشدة في 4 حجرات أطباق (شرائح المجهر) أو 6 جيدا microplates (أطباق بتري) وتزج في 1٪ت / ت البنسلين / الستربتومايسين في برنامج تلفزيوني. استخدام 4 مل للشرائح و 3 مل لأطباق. فضح للأشعة فوق البنفسجية مئوية لمدة 30 دقيقة. صرف البنسلين / حل الستربتومايسين لوسائل الإعلام ثقافة الخلية.
  2. جمع وعدد الخلايا. البذور على المصفوفات في 500 × 03 حتي 02 أكتوبر × 10 6 خلايا / مجموعة في 4 مل لكل شريحة المجهر و3 مل لكل 35 مم طبق بيتري. احتضان الثقافات مجموعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 ل2-24 ساعة أو حتى تشكيل الجزر خلية ذات الكثافة السكانية. ضبط كل من كثافة البذر والوقت اللازم لخلايا الجسم وتطبيق معين. Underseeding (أي كثافة منخفضة أو الوقت منبذرة) قد يؤدي ذلك إلى ضعف سكان مجموعة والنتائج البيولوجية منحرفة. Overseeding (أي كثافة عالية أو الوقت منبذرة) قد يؤدي إلى خفض سلامة مجموعة بسبب انفصال الجزيرة.
  3. بعد السماح لتشكيل الجزر خلية، وغسل الثقافات مجموعة مرتين مع وسائل الإعلام ثقافة الخلية قبل تحسنت. مرة أخرى استخدام 4 مل للشرائح و 3 مل لأطباق. اختياريهLLY إضافة عناصر التحكم والعلاجات المناسبة (على سبيل المثال، مثبطات جزيء صغير، عوامل النمو، الخ) التي تهم النظام البيولوجي. تغيير وسائل الإعلام من صفائف كل 1-2 د من أجل الحفاظ على تركيز أي علاج. تقييم التعبير علامة الخلية وظيفة الخلية التي كتبها المناعي أو خلية الركيزة التفاعلات التي كتبها الآلية المالية المؤقتة ضمن 1-5 د من بدء الثقافات مجموعة - راجع الخيار 1 والخيار 2 أدناه.
  4. الخيار 1: إجراء المناعي نقطة النهاية. لاحظ أنه المناعي من بعض البروتينات قد تتطلب permeabilization أكثر صرامة باستخدام الميثانول والإيثانول، أو حمض الهيدروكلوريك. بسبب أضرار محتملة لصفائف وتقييم وتحسين كل بروتوكول permeabilization قبل استخدامها في التجارب على نطاق أوسع.
    1. نضح وسائل الإعلام ثقافة خلية من الشرائح مجموعة في 4 حجرات أطباق وإضافة 4 مل / شريحة من الطازجة 4٪ ت / ت امتصاص العرق (PFA) في برنامج تلفزيوني. احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      تنبيه: المعارضلدى عودتهم إلى PFA يمكن أن يؤدي إلى تسمم حادة ويمكن أيضا أن تهيج أو تآكل الجلد على اتصال. ارتداء قفازات واقية، ملابس، وحماية العين واستخدام فقط في غطاء الدخان الكيميائية.
    2. نضح PFA حل ويغسل كل شريحة 3 مرات مع 4 مل من برنامج تلفزيوني. في هذه المرحلة، والشرائح الثابتة يمكن تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة 1 أسبوع. ومن المستحسن، مع ذلك، أن يستمر من خلال immunolabeling وتصاعد في نفس اليوم كما التلاعب من أجل ضمان سلامة مجموعة.
    3. نضح في برنامج تلفزيوني وإضافة 4 مل / شريحة من 0.25٪ ت / ت تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني. احتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    4. نضح تريتون X-100 حل ويغسل كل شريحة 3 مرات مع 4 مل من برنامج تلفزيوني. إضافة 4 مل / شريحة من 5٪ مصل ت / ت مطابقة لنوع من الأجسام المضادة الثانوية (على سبيل المثال، حمار المصل عن الأجسام المضادة الثانوية حمار) في برنامج تلفزيوني واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
    5. تماما إزالة عرقلة الحل من كل شريحة. إضافة 500 ميكرولتر / الشريحة من الأجسام المضادة الأولية مخففة في 5٪ ت / ت المصل في برنامج تلفزيوني. هذا الحجم يكفي لتغطية المصفوفات لكلا حضانات ح 1 في درجة حرارة الغرفة، فضلا عن حضانات بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    6. يغسل كل شريحة مجموعة 3 مرات مع 4 مل من برنامج تلفزيوني. تماما إزالة غسل النهائي وإضافة 500 ميكرولتر / الشريحة من الأجسام المضادة الثانوية المناسبة المخفف في 5٪ ت / ت المصل في برنامج تلفزيوني.
    7. يغسل كل شريحة مجموعة 3 مرات مع 4 مل من برنامج تلفزيوني. غسل لفترة وجيزة مع DH 2 O قبل إزالة بعناية الشرائح مجموعة من الحل باستخدام ملقط. استخدام النسيج المختبر إلى الفتيل أو الجافة المتبقية درهم 2 O.
    8. الماصة 100 ميكرولتر من تصاعد حل مع دابي عبر الشريحة فيما أكدت بصريا تغطية كاملة للمجموعة بأكملها.
    9. وضع 22 × 60 مم ساترة على الشريحة إلى جبل. ختم حواف ساترة مع طلاء الأظافر واضحة. مخزن في الظلام في 4 درجات مئوية حتى التصوير، أي في وقت سابق من اليوم التالي.
    10. صورة صفائف بأكملها باستخدام إما ماسح ضوئي ميكروأري أو مقلوب تجهيز المنطقة المجهر الفلورسنتإد مع مرحلة الروبوتية. توفر الماسحات الضوئية ميكروأري قراءات أسرع ولكنها قد تتطلب Cy3- أو Cy5 المتوافقة مع fluorophores وغالبا ما تكون من قرار محدود في ترتيب الخلايا واحد (أي 1-10 ميكرون). توفر المجاهر الفلورية الخيار لاستخدام مجموعة متنوعة من القنوات الفلورسنت ودقة أعلى (<1 ميكرون، ~ 100 × مجموع التكبير)، ولكن توفر أبطأ قراءات اعتمادا على نوعية من مرحلة الروبوتية والتكبير / الهدف.
    11. حفظ الصور الملتقطة من صفائف كامل من أي طريقة كملفات TIFF للحيلولة دون ضغط البيانات أو الخسارة المرتبطة غيرها من الأشكال ملف (على سبيل المثال، JPG).
  5. الخيار 2: إجراء تقييم مباشر لالتفاعلات خلية الركيزة باستخدام الآلية المالية المؤقتة.
    1. إعداد محلول 1٪ ت / ت زلال المصل البقري (BSA)، و 1٪ ت / ت كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS) في برنامج تلفزيوني لفصل الخلايا من ركائز خلال الآلية المالية المؤقتة.
    2. نقل 35 مم أطباق بتري تحتوي على الثقافات مجموعة لوحضنت (37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2)، المجهر الفلورسنت المقلوب مع مرحلة الروبوتية لقياس نسبة المواد الدسمة.
      1. في طبق واحد، احتفال وظائف (X-تنسيق، Y-تنسيق) والتركيز طائرات (Z-تنسيق) من الجزر الخلايا الفردية باستخدام المجهر النقيض من المرحلة.
      2. التبديل إلى المجهر أحمر فلوري بكثير من تصور الخرز. العودة إلى كل موقع من المواقع المحفوظة في الخطوة السابقة وتصحيح Z-تنسيق الطائرة التركيز بحيث لا الطبقة الأولى من الخرز أدناه الجزيرة الخلية في التركيز. حفظ إحداثيات جديدة، والشروع في التصوير الآلي من جميع الجزر خلية لالتقاط ما قبل التفكك مرحلة التباين والبعيدة الصور الحمراء الفلورسنت.
    3. بعناية إضافة 150 ميكرولتر من محلول BSA / SDS إلى الطبق والانتظار مدة 5 دقائق للسماح للتفكك خلية كاملة من الركيزة. مراقبة تفكك خلية باستخدام المجهر النقيض من المرحلة.
    4. بعد أن تم فصلها الجزر خلية من الركيزة، والعودة إلى tانه تميز المواقف وتأكد من أن الطبقة الأولى من الخرز لا تزال في التركيز. إذا كانت هذه هي حبات الخروج من الطائرة بسبب تشوه الناجمة عن الجر ولدت الخلية، ثم تصحيح Z-تنسيق الطائرة التركيز بحيث تكون مرة أخرى في التركيز. حفظ إحداثيات Z-تصحيح وتكرار التصوير الآلي من جميع الجزر لالتقاط ما بعد التفكك الصور الفلورسنت الحمراء بكثير.
    5. كرر الخطوات 3.5.1 - 3.5.4 لأطباق المتبقية.

4. تحليل البيانات

  1. تحليل البيانات المناعي.
    1. عملية الحصول على الصور مجموعة. تقسيم الصور مجموعة المركبة إلى الملفات التي تحتوي على القنوات الفردية (أي الأحمر والأزرق، أو خضراء) وتحويلها إلى صور TIFF 8 بت 43 و 44. تطبيق binning (على سبيل المثال، 2 × 2 أو 4 × 4) لتقليل حجم الصورة ل~ 32 ميغا بكسل لكل قناة للحد من متطلبات الذاكرة خلال تحليل وحيدة الخلية المصب من انتيإعادة الصور مجموعة. رؤية الملف رمز إضافي بعنوان "array_processing.ijm" لتنفيذ يماغيج الكلي من هذه الخطوات تجهيز مجموعة.
    2. لاحظ الإحداثيات بالبكسل من أعلى اليسار، أسفل اليسار، والسفلية اليمنى علامات ديكستران-رودامين مترافق أو شروط المحتشدة. استخدام هذه الإحداثيات لتدوير الصور 8 بت TIFF أن يكون رأسي تماما، وبعد ذلك لتعليم الإخراج من تحليل وحيدة الخلية مع الظروف المحتشدة محددة. رؤية الملفات رمز إضافي بعنوان "rb_array_rotater.ijm"، "rg_array_rotater.ijm"، "rgb_array_rotater.ijm"، و "array_gridding.ijm" لتطبيقات هذه مجموعة الدورية وgridding الخطوات.
    3. لتحليل وحيد الخلية من اهمال، استدارة الصور TIFF 8 بت في CellProfiler (الإصدار 2.1.1) 45 باستخدام الوحدات التالية: IdentifyPrimaryObjects، IdentifySecondaryObjects، وMeasureObjectIntensity. يحدد IdentifyPrimaryObjects نوى، IdentifySecondaryObjects يحدد immunolabels المرتبطة بكل نواة الخلية، ويوفر MeasureObjectIntensity التحديد الكمي لكلا تسميات النووية وimmunolabels.
      1. إخراج البيانات وحيدة الخلية من جميع الوحدات الثلاث كملف CSV من قناة باستخدام وحدة ExportToSpreadsheet لتسهيل تحليل المصب في وقت لاحق. رؤية الملفات رمز إضافي بعنوان "b_array_image_analysis.cppipe"، "gb_array_image_analysis.cppipe"، "rb_array_image_analysis.cppipe"، و "rgb_array_image_analysis.cppipe" لخطوط الأنابيب CellProfiler تنفيذ هذه الخطوات لمجموعات الصور التي تحتوي على قنوات الأحمر والأخضر، أو الأزرق.
    4. لتحويل البيانات لحساب التباين التجريبية وغير جاوس التوزيعات وحيدة الخلية، وتطبيق التطبيع quantile من تكرار البيولوجي 46. هذه العملية تولد التوزيع المشترك عبر مكررات وتمكن مقارنات مشاركات التغيرات في كثافة immunolabel. وعلاوة على ذلك، نتحدث عنه اليومآيك Z-التهديف وطرق حدودي أخرى، تطبيع quantile هو غير حدودي ولا يتحمل توزيع معين من البيانات، والسماح لأكثر تمثيلا ويحلل السلوك وحيدة الخلية بوصفها وظيفة من حالة المحتشدة.
    5. رسم البيانات وتفسيرها. وتبعا للنظام البيولوجي والفرضية، وحساب ورسم واحد أو أكثر من التدابير الفرقة التالية لكل حالة المحتشدة:
      1. حساب ورسم خلايا في جزيرة كإجراء المشترك للالتصاق والبقاء على قيد الحياة على مدى التجربة.
      2. حساب ورسم كثافة immunolabel-تطبيع quantile كمقياس للمصير خلية أو وظيفة.
      3. حساب ورسم النسبة المئوية للخلايا إيجابية لimmunolabel على النحو الذي يحدده كثافة فوق عتبة متسقة، وعادة 2 الذاكرة الرقمية المؤمنة فوق يعني شدة سيطرة سلبية.
      4. بدلا من ذلك، توزيعات مؤامرة من شدة immunolabel من أجل دراسة وتصنيف السلوك وحيدة الخليةبوصفها وظيفة من حالة المحتشدة. يمكن أن تزيد هذه التوزيعات أن توصف باستخدام مقاييس النزعة المركزية (الوسط الحسابي والوسيط، واسطة) والاختلاف (التباين، معامل الاختلاف، عامل فانو) وطرق اختبار الفرضيات مثل اختبار كولموجوروف-سميرنوف.
  2. تحليل البيانات الآلية المالية المؤقتة. هنا يتم وصف نهج دمج خوارزمية ضعت من قبل بتلر وآخرون. وانغ وآخرون. 40، 47.
    1. استخدام يماغيج لدفعة تحويل الصور إلى ملفات TIFF 8 بت. تطبيق binning بلغ متوسط بكسل (على سبيل المثال، 2 × 2) لخفض تكلفة الحسابية ووقت التحليل المصب. كما ركزت خوارزميات إدارة المرافق الكلية إلى حد كبير على التحليل وحيدة الخلية، كبيرة واجهة الخلية ركيزة من الجزر (~ 17.5 × 10 3 ميكرون 2) في مقارنة إلى واجهة الخلية ركيزة من خلية واحدة (75 ميكرون 2) necessiتتس الخطوة binning.
    2. إدخال القبض على النقيض من المرحلة والبعيدة الصور الحمراء الفلورسنت (على حد سواء ما قبل الانفصال وبعد الانفصال) إلى بيئة البرمجة العلمية مثل MATLAB وعملية باستخدام الخوارزميات المتقدمة سابقا من بتلر وآخرون. وانغ وآخرون. 40، 47.
      1. تحديد ثلاث مناطق بعيدة من الجزيرة الخلية. وتستخدم هذه المناطق لحساب نزوح بسبب صورة أو عينة الانجراف.
      2. توفير عامل لتحويل من بكسل إلى ميكرومتر (على سبيل المثال، 0.454 بكسل / ميكرون)، معامل يونغ الركيزة (على سبيل المثال، 13 كيلو باسكال)، ونسبة بواسون (على سبيل المثال، 0.48 للالمواد الهلامية بولي أكريلاميد هو موضح هنا).
      3. لكل جزيرة، رسم الحدود حول محيط لتحديد المعوقات الهندسية. وركزت جميع القوات خارج هذه الحدود. هذا النظام مقيدة معقول بالنظر إلى dista كبيرالامتحانات التنافسية الوطنية (أي 450 ميكرون) بين الجزر.
    3. حساب الإجهاد الجر جذر متوسط ​​مربع ولحظة مقلص لكل جزيرة. لحظة مقلص هي مقياس الضغط المتبقية في جميع أنحاء الجزيرة الخلية ولقد ثبت لتعكس قوة التفاعلات خلية خلية 48. لكل حالة المحتشدة، متوسط ​​قيم جذر متوسط ​​مربع على جزرها المتعددة ومكررات البيولوجية وحساب المرتبطة التباين لاختبار الفرضيات. ومن الممكن أيضا أن يبلغ متوسط توزيع الضغوط أو لحظات على العديد من الجزر لتوفير خريطة تمثيلية كل التدابير بوصفها وظيفة من الهندسة، على سبيل المثال، المسافة من وسط الجزيرة.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام هذه المنصة، ونحن التحقيق في دور كل من الإشارات البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية في مواصفات مصير الأسلاف الكبد 34، 35. وأظهرت البروتين وبروابط / G-مترافق الشق تحسين الاحتفاظ والتجميع في هيدروجيل بولي أكريلاميد (الشكل 3A) وكانت قادرة علاوة على القيادة التفريق بين الأسلاف الكبد نحو مصير خلية القناة الصفراوية (الشكل 3B). عن طريق تحليل وحيدة الخلية، ونحن كميا ردا على بروابط الشق للبروتينات ECM أنا الكولاجين، الكولاجين الثالث، الكولاجين الرابع، فبرونيكتين، و laminin (الشكل 3C)، وجدت أن رد فعل الأسلاف الكبد ليجند تعتمد أيضا على السياق ECM. وأخيرا، ونحن استخدام shRNA ضربة قاضية لتوليد الأسلاف الكبد دون بروابط DLL1 وJag1. وردا على يجند الشق المحتشدة يختلف طبقا لنوع العلاقات العامةesence إما يجند، مؤكدا أن الاستجابة ليجند خلية خارجي هو أيضا وظيفة من يجند التعبير عن خلية الجوهرية (الشكل 3D). وعلاوة على ذلك، لاحظنا جزء من السكان متميزة من ضعف إيجابية (ALB + / OPN +) الخلايا في ضربة قاضية DLL1 (الشكل 3D). معا، وتشير هذه النتائج التمثيلية: (1) قدرات اندماجي في شكل مجموعة، كما يتضح من الاقتران من مضاعفات المحتشدة البروتينات ECM وبروابط الشق مع ضربة قاضية للبروابط الفردية؛ (2) وظائف ليس فقط تناثرت البروتينات ECM ولكن أيضا تناثرت يجند خلية خلية عن طريق بروتين A / G اقتران بوساطة؛ و (3) تنفيذ تحليلنا وحيدة الخلية وقدرتها على تمييز مجموعات سكانية فرعية فريدة من نوعها.

لاحظنا أيضا أن التفريق بين الأسلاف الكبد يعتمد على كل من صلابة الركيزة وتكوين ECM (الشكل 4A أونج>)، وإيجاد وجه التحديد أن الكولاجين الرابع هو داعم للتمايز على كل من ركائز لينة وصلبة في حين الفيبرونكتين يعتمد فقط التمايز على ركائز صلبة (الشكل 4B). وتشير خرائط الحرارة تمثيلية القياسات الآلية المالية المؤقتة أن الإجهاد الجر المستمر في انخفاض صلابة الركيزة الكولاجين الرابع تعزيز التمايز إلى خلايا القناة الصفراوية (الشكل 4C)، وهي نتيجة أكدتها متوسط جذر متوسط مربع القيم (الشكل 4D). معا، وتشير هذه النتائج التمثيلية: (1) الاندماج الناجح من نسبة المواد الدسمة مع المجهرية الخلية على ركائز مع صلابة الانضباطي لتقييم كل من النمط الظاهري الخلية والإجهاد الجر. (2) التنسيق بين مصير خلية سلفية الكبد مع كل من تكوين مصفوفة وصلابة الركيزة. و (3) تنفيذ دينا الآلية المالية المؤقتة تحليل ونموذجية ملامح الإجهاد الجر في المجهرية الخلية.

ه 1 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 55362 / 55362fig1.jpg "/>
الشكل 1: نظرة عامة تخطيطي عرض أول ثلاثة أقسام التجريبية. في القسم 1، يتم تنظيفها ركائز الزجاج وsilanized لتسهيل تصنيع الهلاميات المائية بولي أكريلاميد. في القسم 2، يتم إعداد تركيبات جزيء حيوي للمصلحة في صفيحة مصدر 384 أيضا. ثم يتم تحميل arrayer الروبوتية مع دبابيس نظيفة، وصفيحة المصدر، والهلاميات المائية بولي أكريلاميد وتهيئة وتصنيع المصفوفات على الهلاميات المائية. في القسم 3، هي المصنفة الخلايا على المجالات العريض والسماح للالالتزام، وبعد ذلك يتم تنفيذ بروتوكول ثقافة الفائدة. عند نقطة النهاية، إما أن تكون ثابتة خلايا مناعية ل/ المناعي أو تحليلها باستخدام الآلية المالية المؤقتة. الحانات هي مقياس 75 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ضمن الصفحات = "1"> figure-results-1
الشكل 2: معالجة وتحليل البيانات المناعي من المصفوفات. (A) القرميد، واهمال المركبة صور RGB 32 بت أولا ثم تنقسم إلى قنوات 8 بت الفردية. باستخدام مزيج من علامات الفلورسنت المحتشدة والجزر خلية، يتم تحديد ثلاث زوايا للمجموعة للسماح للتوجيه الآلي وgridding من المصفوفات. تم إنشاؤه (ب) بيانات وحيدة الخلية لكل قناة من صفائف الإدخال. من أجل لحساب الانحراف تجريبي، يتم تطبيق التطبيع quantile من تكرار البيولوجي، مما ينتج عنه توزيع مشترك واحد في جميع مكررات. Quantile يتم رسم البيانات تطبيع في وقت لاحق وتفسيرها عن طريق حساب القياسات فرقة (على سبيل المثال، خلايا / الجزيرة، يعني كثافة الخلايا نسبة إيجابية للتسمية) أو التحليل المباشر للتوزيعات وحيدة الخلية.م / الملفات / ftp_upload / 55362 / 55362fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل (3): الشق يجند عرض تتوسط كبد السلف التمايز. (A) بروابط-FC المؤتلف الشق خشنة-1 (JAG1) ودلتا مثل 1 (DLL1) عرضت تحسين الاحتفاظ والتجميع عندما تصطف مع بروتين A / G. شريط النطاق هو 50 ميكرون. الأسلاف (ب) الكبد متباينة في خلايا القناة الصفراوية عند تقديم مع يجند الشق. 4 "، 6 Diamidino-2-phenylindole (دابي) هو التسمية النووية، الزلال (ALB) هي علامة الخلية الكبدية، وosteopontin (OPN) هو علامة الصفراء خلية لاصق. شريط المقياس هو 150 ميكرون. (C) الكمي من النسبة المئوية للخلايا إيجابية لOPN لبروابط الشق JAG1، DLL1، ودلتا مثل 4 (DLL4) على البروتينات ECM الكولاجين الأول، جollagen الثالث، الكولاجين الرابع، فبرونيكتين، و laminin. أجريت -tests ر الطالب ضد مفتش لمراقبة كل يجند الشق المحتشدة داخل كل بروتين ECM مع ف القيم المشار إليها لP <0.05 (*). (D) التصوير الخلوي من ALB وOPN للخلايا الكولاجين في الثالث قدم مع بروابط الشق JAG1، DLL1، وDLL4. الأسلاف الكبد دون الشق بروابط DLL1 وJag1 (أي shDll1 وshJag1) تم إنشاؤها باستخدام shRNA ضربة قاضية. قدمت البيانات في (C) كما يعني ± ووزارة شؤون المرأة وهذا الرقم قد تم تعديله من Kaylan وآخرون. 34. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 4: تكوين مصفوفة والركيزة تصلب سجعrdinate الكبد السلف التمايز. (A) الكبد السلف التمايز إلى خلايا الصفراء القناة تعتمد على كل من تكوين ECM وصلابة الركيزة. دابي هو تسمية النووية، ALB هو علامة الخلية الكبدية، وOPN هو علامة الصفراء خلية لاصق. (ب) الكمي من النسبة المئوية للخلايا إيجابية لOPN على ركائز من معامل يونغ 30 كيلو باسكال، 13 كيلو باسكال، و 4 كيلو باسكال لالكولاجين الأول (C1)، والكولاجين الرابع (C4)، فبرونيكتين (الجبهة الوطنية)، وجميع اتجاهين مجموعات من تلك البروتينات ECM. (C) الإجهاد الجر الخلية يعتمد على كل من صلابة الركيزة وتكوين ECM. (D) الكمي للقيم جذر متوسط مربع من الإجهاد الجر على ركائز من معامل يونغ 30 كيلو باسكال و 4 كيلو باسكال لالكولاجين الأول (C1)، والكولاجين الرابع (C4)، فبرونيكتين (الجبهة الوطنية)، وجميع اتجاهين مجموعات من تلك البروتينات ECM. في (ب) و (د)، قدمت البيانات كما يعني ± ووزارة شؤون المرأة والطالب -tests رأجريت مقابل 30 كيلو باسكال لكل تركيبة ECM مع ف القيم المشار إليها لP <0.05 (*)، P <0.01 (**)، وP <0.001 (***). الحانات هي مقياس 50 ميكرون. تم تعديل هذا الرقم من Kourouklis وآخرون. 35. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجزء مشكلة الأسباب المحتملة حل
1. تصنيع بولي أكريلاميد الركيزة. ساترة لا يمكن إزالتها من هيدروجيل. Overpolymerization. تقليل وقت البلمرة إلى <10 دقيقة (4 واط / م 2). تأكد من أن crossli الأشعة فوق البنفسجيةالناتج nker ضمن النطاق المتوقع.
الفقيرة بولي أكريلاميد هيدروجيل البلمرة. Underpolymerization. زيادة وقت البلمرة ل> 10 دقيقة (4 واط / م 2). تأكد من أن الناتج الأشعة فوق البنفسجية crosslinker ضمن النطاق المتوقع.
معطوبة الهلاميات المائية بولي أكريلاميد بعد إزالة ساترة. الهلاميات المائية بولي أكريلاميد لينة سهلة للتلف. ونلاحظ تناقص الغلة هيدروجيل تلفيق (~ 50٪) لأنعم (أي 4 كيلو باسكال) الهلاميات المائية على وجه الخصوص. التعامل مع الهلاميات المائية بلطف وزيادة أعداد انطلاق لتحقيق العائد المطلوب.
2. تصنيع صالحة. الفقراء أو تتعارض بقعة التشكل. وظيفة المرطب غير متناسقة. تأكد من أن المرطب ومقياس غلفاني وظيفية في جميع أنحاء كل النسخ المطبوعة والحفاظ على 65٪ RH.
دبابيس عالقة في رأس الطباعة أو تسدGED. تنظيف رأس الطباعة للسماح للحركة دبوس الحرة. دبابيس نظيفة تماما قبل أو بعد كل النسخ المطبوعة لإزالة الركام من قنوات دبوس.
3. خلية ثقافة والفحص تنفيذ. مفرزة الخلية أو الموت على المصفوفات بعد التعلق الأولي. Overseeding والانتشار المفرط. تقليل كثافة البذر الأولية والوقت. استخدام "صيانة" أو "التمايز" وسائل الاعلام خلال الثقافة مجموعة للحد من تكاثر الخلايا.
الافراج عن مونومر الأكريلاميد السامة من هيدروجيل. نقع الهلاميات المائية في DH 2 O لا يقل عن 3 د للسماح للنشر / الافراج عن مونومر الأكريلاميد والحد من سمية الخلية.
الخلايا لا نعلق على المصفوفات. Underseeding. زيادة كثافة البذر الأولية والوقت. استخدام أكثر تمسكا قويا نوع من الخلايا.
ترسب سوءمصفوفة أو حالة جزيء حيوي. دبابيس نظيفة من الجسيمات والمجاميع، وتؤكد المعلمات الطباعة، وتقييم اكتشاف علامات الفلورسنت، على سبيل المثال،-رودامين مترافق ديكستران.
خصوصية التفاعلات خلية مصفوفة. أنواع مختلفة من الخلايا تلتزم خصيصا لبعض وليس البروتينات ECM أخرى. اختبار عدة بروتينات ECM مختلفة مع الخلايا الخاصة بك.
تخزين مجموعة الأمثل بعد التصنيع. نوصي تخزين المصفوفات ملفقة بين عشية وضحاها في 65٪ RH ودرجة حرارة الغرفة، في جزء منه لتجنب التغيرات مرحلة أثناء التجميد. التصاق الخلايا حساسة لكلا الرطوبة ودرجة الحرارة وفترة التخزين. تأكد من هذه المعايير متوافقة / الأمثل لتجاربك.
مفرزة من هيدروجيل من الركيزة الزجاج خلال زراعة الخلايا. تنظيف شريحة الفقراء وsilanization. استبدال حلول العمل لتنظيف الشريحة وsilanization.
هيدروجيل Overdehydrated. لا تترك الهلاميات المائية التجفيف على طبق ساخن لمدة أطول من 15-30 دقيقة.
4. تحليل البيانات. التباين الشديد بين المواقع تكرار والشرائح. تقلب في تصنيع مجموعة. تأكد من أن المسامير ورأس الطباعة نظيفة. تأكيد وظيفة المرطب. تصور وتحديد بقعة ومجموعة الجودة باستخدام علامات الفلورسنت. تخزين المصفوفات كما أوصت أعلاه.

الجدول 1: استكشاف الأخطاء وإصلاحها.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في تجاربنا، وجدنا أن الفشل الأكثر شيوعا ترتبط نوعية صفائف ملفقة وسيئة اتسمت استجابة في النظام البيولوجي للاهتمام. نشير للقارئ أن الجدول رقم 1 لعدم وسائط مشتركة في تجارب الخلايا ميكروأري وما يرتبط بها من خطوات استكشاف الأخطاء وإصلاحها. فيما يتعلق بنوعية صفائف على وجه الخصوص، ونحن نوصي بما يلي: تأكيد الجودة التقنية ومتانة تنظيم البرامج والمعلمات، والمخازن باستخدام جزيئات fluorescently المسمى مثل ديكستران-رودامين مترافق. دبابيس نظيفة تماما سواء قبل أو بعد تنظيم فقا لتعليمات الشركة الصانعة وزيادة بصريا الاختيار أن القنوات دبوس واضحة من الحطام باستخدام المجهر الضوئي. تأكيد الاحتفاظ جزيء حيوي العريض باستخدام البقع بروتين العامة أو immunolabeling. لاحظ أن الجزيئات الحيوية مع الوزن الجزيئي أقل من 70 كيلو دالتون كثيرا ما لا يتم الاحتفاظ في هيدروجيل 23، سوب> 31. التحقق من صحة العريض جزيء حيوي خلية وظيفة باستخدام أنواع خلايا متعددة. لاحظ أن الخلايا الملتصقة فقط متوافقة مع المصفوفات. بالإضافة إلى ذلك، الانضمام إلى صفوف يعتمد على كل من خصائص خلية معينة (على سبيل المثال، إنتغرين الشخصي التعبير) والبروتينات ECM المحدد.

نظرا لضيق المساحة، ونحن لم تقدم علاجا واسعة من تصميم مجموعة، والتخطيط، وتلفيق هنا وتحيل القارئ إلى سابقة يعمل 23 و 25. ونحن عموما استخدام 100 subarrays بقعة (150 قطرها ميكرون بقعة، 450 ميكرون المسافة مركز إلى مركز) تتألف من 10-20 الظروف جزيء حيوي فريد (أي 5-10 البقع / حالة). عدد subarrays في مجموعة واحدة تختلف تبعا لعدد من الشروط جزيء حيوي من الفائدة، والتي يمكن زيادتها بشكل مريح حتى 1280 على واحد 25 × 75 مم شريحة المجهر (~ 6400 البقع في 64 subarrays)XREF "> 25، 31 المعلمات أعلاه إلى أن تختلف تبعا لحجم نمط من الفائدة؛ دبابيس قادرة على توليد أنماط من 75 - متوفرة بسهولة 450 ميكرون.

من الأفضل أن تستكمل التجارب مجموعة من التحقق من شروط عالية التهديف المحتشدة الاهتمام باستخدام صيغ ثقافة أخرى، قراءات الفحص، ونظم نموذج البيولوجية. على وجه التحديد، ونحن نوصي مزيد من التحقق من آثار الظروف المحتشدة مختارة باستخدام الثقافات السائبة بالتزامن مع تقنيات البيولوجيا الجزيئية القياسية (على سبيل المثال، QRT-PCR، immunoblotting) أو الآلية المالية المؤقتة القياسية. التلاعب الجيني (على سبيل المثال، ضربة قاضية أو overexpression) من العوامل ذات الأهمية في النظام النموذجي البيولوجي المناسب يمكن أن تخدم أيضا لتأكيد الآثار الملاحظة في المصفوفات. في الجسم الحي وتمثل النماذج الحيوانية وسيلة أخرى لإثبات واستخدمت في الآونة الأخيرة، على سبيل المثال، للتأكيد على الدور المركزي للgalectin-3 و galectin-8 فيسرطان الرئة المنتشر المتخصصة، كما حددت في البداية عن طريق خلية ميكروأري 31، 49.

وقد تم استخدام عدد من الأساليب الأخرى لتحقيق التنظيم microenvironmental من الوظائف الخلوية، بما في ذلك مجموعة متنوعة من اثنين الأبعاد أنظمة microfabricated 18، 50، 51، 52، 53، 54، 55 و ثلاثية الأبعاد أنظمة بيولوجية المهندسة 56، 57، 58 ، 59، 60، 61. بالمقارنة مع الطرق الأخرى، ومزايا معينة من منصة الخلية ميكروأري هو موضح هنا تتكون من: (1) إنتاجية تصل إلىمئات أو آلاف من مجموعات مختلفة من العوامل، مما يتيح تحليل آثار التفاعل. (2) يمكن الوصول إليها، والتصوير والتحليل الآلي. (3) دمج هاتين قراءات البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية مع عرض رقابة من العوامل المحتشدة. (4) القدرة على تغيير خصائص المواد الركيزة. و (5) تحليل وحيدة الخلية عالية المحتوى من مصير الخلايا وظيفة.

وباختصار، فإن الجمع بين المجهرية الخلية مع الآلية المالية المؤقتة على ركائز من صلابة الركيزة الانضباطي يمكن توصيف دقيق لكل من الاشارات البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية. كما وردت هنا، هذه المنصة هي للتعميم ويمكن تطبيقها بسهولة إلى مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا الملتصقة والسياقات الأنسجة نحو فهم أفضل لتنظيم microenvironmental اندماجي من تمايز الخلايا وmechanotransduction.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن نعترف أوستن Cyphersmith وMayandi Sivaguru (كارل معهد ر Woese للبيولوجيا الجينوم في جامعة إلينوي في أوربانا شامبين) للحصول على المساعدة مع المجهر ولاستيعاب بسخاء الشاشة والتقاط الفيديو في صميم المجهر.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 وميكرو ؛ مرشح حقنة mPall Corporation4433تطابق مع محاقن بلاستيكية بقفل لور بحجم مناسب.
100 & مرة ؛ البنسلين & - - - محلول الستربتومايسينفيشر SV30010
22 & مرات 60 ملم غطاء نظاراتعلوم المجهر الإلكتروني63765
3- (تريميثوكسي سيليل) بروبيل ميثاكريلات (3-TPM)سيجما ألدريتش440159يخزنها تحت غاز خامل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. يمكن أن يؤدي تعرض 3-TPM للهواء إلى الإضرار بتجميل الركائز الزجاجية. تنبيه: 3-TPM هو سائل قابل للاحتراق. يحفظ بعيدا عن الحرارة والشرر واللهب المكشوف والأسطح الساخنة واستخدمه فقط في غطاء الدخان الكيميائي.
3- [(3-كولاميدوبروبيل) ثنائي ميثيل أمونيو] -1-هيدرات البروبان سلفونات (CHAPS)Sigma-AldrichC3023
أطباق بتري زجاجية ذات قاع زجاجي 35 ممخلية E & GGBD00002-200بئر 13 مم يتكون من # 1.5 غطاء زجاجي. لتمكين TFM وتصوير الخلايا الحية.
384 بئر من مادة البولي بروبيلين على شكل حرف V صفيحة صغيرة ، غير معقمةالولايات المتحدة الأمريكية العلمية1823-8400
6 آبار من البوليسترين الألواح الدقيقةفيشر ساينتفيك08-772-1B35 مم تتناسب أطباق بتري ذات القاع الزجاجي مع آبار الصفيحة الدقيقة ، مما يسهل تصنيع المصفوفة.
الأسيتونسيجما ألدريتش179973
أكريلاميدسيجما-ألدريتشA3553تنبيه: يمكن أن يؤدي التعرض للأكريلاميد إلى سمية حادة وتهيج. ارتد قفازات واقية وملابس وواقية للعين.
الكولاجين الأول ، ذيل الفئرانEMD Millipore08-115MI
Collagen III ، EMD البشريMilliporeCC054
Collagen IV ،EMD MilliporeCC076
Crosslinker البشري ، 365 نانومترUVPCL-1000
Dextran ، الرودامين B المترافق ، 70 كيلو دالتونThermoFisher ScientificD1841يستخدم كعلامة لموقع المصفوفة.
ثنائي ميثيل سلفوكسيدفيشر ScientificBP231
ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (PBS)فيشر Scientific (HyClone)SH3001302
مختبراتكحول إيثيليDecon 2701
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA)سيجما ألدريتشED
FC المؤتلف DLL1 ، الفأرR & D Systems5026-DL-050
FC المؤتلف DLL4 ، الماوسAdipoGenAG-40A-0145-C050
FC المؤتلف JAG1 ، الفئرانR & D Systems599-JG-100
Fibronectin ،Sigma-AldrichF2006
البشري ، مقلوبZeissAxiovert 200Mتأكد من أن المجهر مجهز بمرحلة روبوتية لكل من التصوير الفلوري الآلي و TFM. الرقابة البيئية (i< / em>., 37 & deg; ينصح بشدة باستخدام C و 5٪ CO2< / sub>) ل TFM.
Fluoromount G مع DAPISouthernBiotech0100-20
حمض الخليك الجليديSigma-Aldrich695092تنبيه: حمض الخليك قابل للاشتعال والتآكل. ارتد قفازات واقية وملابس وواقية للعين.
الجلسرينسيجما ألدريتشM6145
Irgacure 2959BASF Corporation55047962
Laminin ، الماوسEMD MilliporeCC095
الميثانولسيجما-ألدريتش179957
ماسح ضوئي MicroarrayGenePix4000Bيجب أن تكون الفلوروفورات متوافقة مع Cy3 أو Cy5.
MicroarrayerDigilabOmniGrid Microيمكن بسهولة استبدال المصفوفات الدقيقة الأخرى ذات القدرة المماثلة أو الأكبر.
شرائح مجهرية ، 25 مرة ؛ 75 ممسيجما ألدريتشCLS294775X25~ 0.9 & - 1.1 مم سمك.
<م > ن ، ن & برايم ؛ < / em>-Methylenebisacrylamide (bisacrylamide)Sigma-AldrichM7279تحذير: يمكن أن يؤدي التعرض للأكريلاميد إلى سمية حادة وتهيج. ارتد قفازات واقية وملابس وواقية للعين.
بارافورمالدهيد (PFA) ، 16٪ v / vعلوم المجهر الإلكترونيRT15710تحضير PFA طازجا (لا تخزن) للتثبيت الأمثل. تنبيه: يمكن أن يؤدي التعرض ل PFA إلى سمية حادة ويمكن أن يؤدي أيضا إلى تهيج الجلد أو تآكله عند ملامسته. ارتد قفازات واقية وملابس وواقية للعين واستخدمها فقط في غطاء الدخان الكيميائي.
بروتين A / G ، مؤتلفThermoFisher Scientific21186
صينية تجفيف Pyrex ، 2،000 & nbsp ؛ ملفيشر Scientific15-242B
طبق ثقافة مستطيل من 4 غرففيشر Scientific (Nunc)12-565-495لزراعة الخلايا على شرائح المجهر المصفوفة.
أسيتات الصوديومSigma-AldrichS2889
هيدروكسيد الصوديومسيجما ألدريتش415413تنبيه: هيدروكسيد الصوديوم شديد الكاوية ويمكن أن يسبب حروقا شديدة في الجلد وتلف العين. ارتد قفازات واقية وملابس وواقية للعين.
دبوس التخفي لترتيب ArrayItSMP3تنظيف دبابيس بعد تشغيل كل صفيف باستخدام تعليمات الشركة المصنعة. ينتج مجالات 150 ميكرون ؛ شراء أحجام دبوس أخرى (75 & ndash ؛ 450 ميكرون) بما يناسب تطبيقك الخاص.
تريتون X-100سيجما ألدريتشX100
العلمي محلول مجهر الفلورسنت

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9 (4), 239-252 (2009).">Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9 (4), 239-252 (2009).
  2. A family business: stem cell progeny join the niche to regulate homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (2), 103-114 (2012).">Hsu, Y. C., Fuchs, E. A family business: stem cell progeny join the niche to regulate homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (2), 103-114 (2012).
  3. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).">Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).
  4. No place like home: anatomy and function of the stem cell niche. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (1), 11-21 (2008).">Jones, D. L., Wagers, A. J. No place like home: anatomy and function of the stem cell niche. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (1), 11-21 (2008).
  5. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).">Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
  6. Extracellular-matrix tethering regulates stem-cell fate. Nat Mater. 11 (7), 642-649 (2012).">Trappmann, B., et al. Extracellular-matrix tethering regulates stem-cell fate. Nat Mater. 11 (7), 642-649 (2012).
  7. Stem cell mechanobiology: diverse lessons from bone marrow. Trends Cell Biol. 25 (9), 523-532 (2015).">Ivanovska, I. L., Shin, J. W., Swift, J., Discher, D. E. Stem cell mechanobiology: diverse lessons from bone marrow. Trends Cell Biol. 25 (9), 523-532 (2015).
  8. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).">Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  9. Hydrogels with tunable stress relaxation regulate stem cell fate and activity. Nat Mater. 15 (3), 326-334 (2016).">Chaudhuri, O., et al. Hydrogels with tunable stress relaxation regulate stem cell fate and activity. Nat Mater. 15 (3), 326-334 (2016).
  10. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev Cell. 6 (4), 483-495 (2004).">McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev Cell. 6 (4), 483-495 (2004).
  11. Genetic and cell biological analysis of integrin outside-in signaling. Genes Dev. 23 (4), 397-418 (2009).">Legate, K. R., Wickstrom, S. A., Fassler, R. Genetic and cell biological analysis of integrin outside-in signaling. Genes Dev. 23 (4), 397-418 (2009).
  12. Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment. Cell. 141 (1), 52-67 (2010).">Kessenbrock, K., Plaks, V., Werb, Z. Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment. Cell. 141 (1), 52-67 (2010).
  13. Stem cell bioengineering at the interface of systems-based models and high-throughput platforms. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 4 (6), 525-545 (2012).">Underhill, G. H. Stem cell bioengineering at the interface of systems-based models and high-throughput platforms. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 4 (6), 525-545 (2012).
  14. Bioengineering methods for analysis of cells in vitro. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 385-410 (2012).">Underhill, G. H., Galie, P., Chen, C. S., Bhatia, S. N. Bioengineering methods for analysis of cells in vitro. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 385-410 (2012).
  15. Microfabricated biomaterials for engineering 3D tissues. Adv Mater. 24 (14), 1782-1804 (2012).">Zorlutuna, P., et al. Microfabricated biomaterials for engineering 3D tissues. Adv Mater. 24 (14), 1782-1804 (2012).
  16. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).">Ruiz, S. A., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).
  17. Cell patterning technologies for organotypic tissue fabrication. Trends Biotechnol. 29 (4), 183-190 (2011).">Guillotin, B., Guillemot, F. Cell patterning technologies for organotypic tissue fabrication. Trends Biotechnol. 29 (4), 183-190 (2011).
  18. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. J. Cell Sci. 123 (Pt 24), 4201-4213 (2010).">Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. J. Cell Sci. 123 (Pt 24), 4201-4213 (2010).
  19. High-throughput approaches for the analysis of extrinsic regulators of stem cell fate. Curr. Opin. Cell Biol. 24 (2), 236-244 (2012).">Ranga, A., Lutolf, M. P. High-throughput approaches for the analysis of extrinsic regulators of stem cell fate. Curr. Opin. Cell Biol. 24 (2), 236-244 (2012).
  20. High-throughput methods to define complex stem cell niches. Biotechniques. 48 (4), ix-xxii (2010).">Kobel, S., Lutolf, M. High-throughput methods to define complex stem cell niches. Biotechniques. 48 (4), ix-xxii (2010).
  21. High-throughput cellular microarray platforms: applications in drug discovery, toxicology and stem cell research. Trends Biotechnol. 27 (6), 342-349 (2009).">Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Clark, D. S., Dordick, J. S., Cabral, J. M. S. High-throughput cellular microarray platforms: applications in drug discovery, toxicology and stem cell research. Trends Biotechnol. 27 (6), 342-349 (2009).
  22. Microscale screening systems for 3D cellular microenvironments: platforms, advances, and challenges. Cell Mol Life Sci. 72 (2), 237-249 (2015).">Montanez-Sauri, S. I., Beebe, D. J., Sung, K. E. Microscale screening systems for 3D cellular microenvironments: platforms, advances, and challenges. Cell Mol Life Sci. 72 (2), 237-249 (2015).
  23. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nat Methods. 2 (2), 119-125 (2005).">Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nat Methods. 2 (2), 119-125 (2005).
  24. Methods in Bioengineering: Stem Cell Bioengineering Artech House Methods in Bioengineering. Parekkadan, B., Yarmush, M. , Artech House Publishers. Boston, MA. 63-73 (2009).">Underhill, G. H., Flaim, C. J., Bhatia, S. N. Methods in Bioengineering: Stem Cell Bioengineering Artech House Methods in Bioengineering. Parekkadan, B., Yarmush, M. , Artech House Publishers. Boston, MA. 63-73 (2009).
  25. Arrayed cellular microenvironments for identifying culture and differentiation conditions for stem, primary and rare cell populations. Nat Protoc. 7 (4), 703-717 (2012).">Brafman, D. A., Chien, S., Willert, K. Arrayed cellular microenvironments for identifying culture and differentiation conditions for stem, primary and rare cell populations. Nat Protoc. 7 (4), 703-717 (2012).
  26. Investigating the role of the extracellular environment in modulating hepatic stellate cell biology with arrayed combinatorial microenvironments. Integr Biol. 1 (8-9), 513-524 (2009).">Brafman, D. A., et al. Investigating the role of the extracellular environment in modulating hepatic stellate cell biology with arrayed combinatorial microenvironments. Integr Biol. 1 (8-9), 513-524 (2009).
  27. Exploring the regulation of human neural precursor cell differentiation using arrays of signaling microenvironments. Mol Syst Biol. 2, 37(2006).">Soen, Y., Mori, A., Palmer, T. D., Brown, P. O. Exploring the regulation of human neural precursor cell differentiation using arrays of signaling microenvironments. Mol Syst Biol. 2, 37(2006).
  28. Human mammary progenitor cell fate decisions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integr Biol. 1 (1), 70-79 (2009).">LaBarge, M. A., et al. Human mammary progenitor cell fate decisions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integr Biol. 1 (1), 70-79 (2009).
  29. Nanoliter-scale synthesis of arrayed biomaterials and application to human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 22 (7), 863-866 (2004).">Anderson, D. G., Levenberg, S., Langer, R. Nanoliter-scale synthesis of arrayed biomaterials and application to human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 22 (7), 863-866 (2004).
  30. Defining long-term maintenance conditions of human embryonic stem cells with arrayed cellular microenvironment technology. Stem Cells Dev. 18 (8), 1141-1154 (2009).">Brafman, D. A., Shah, K. D., Fellner, T., Chien, S., Willert, K. Defining long-term maintenance conditions of human embryonic stem cells with arrayed cellular microenvironment technology. Stem Cells Dev. 18 (8), 1141-1154 (2009).
  31. A combinatorial extracellular matrix platform identifies cell-extracellular matrix interactions that correlate with metastasis. Nat Commun. 3, 1122(2012).">Reticker-Flynn, N. E., et al. A combinatorial extracellular matrix platform identifies cell-extracellular matrix interactions that correlate with metastasis. Nat Commun. 3, 1122(2012).
  32. MicroSCALE screening reveals genetic modifiers of therapeutic response in melanoma. Sci Signal. 5 (224), rs4(2012).">Wood, K. C., et al. MicroSCALE screening reveals genetic modifiers of therapeutic response in melanoma. Sci Signal. 5 (224), rs4(2012).
  33. Extracellular matrix microarrays to study inductive signaling for endoderm specification. Acta Biomater. 34, 30-40 (2016).">Braga Malta, D. F., et al. Extracellular matrix microarrays to study inductive signaling for endoderm specification. Acta Biomater. 34, 30-40 (2016).
  34. Combinatorial microenvironmental regulation of liver progenitor differentiation by Notch ligands, TGFbeta, and extracellular matrix. Sci Rep. 6 (23490), 23490(2016).">Kaylan, K. B., Ermilova, V., Yada, R. C., Underhill, G. H. Combinatorial microenvironmental regulation of liver progenitor differentiation by Notch ligands, TGFbeta, and extracellular matrix. Sci Rep. 6 (23490), 23490(2016).
  35. Substrate stiffness and matrix composition coordinately control the differentiation of liver progenitor cells. Biomaterials. 99, 82-94 (2016).">Kourouklis, A. P., Kaylan, K. B., Underhill, G. H. Substrate stiffness and matrix composition coordinately control the differentiation of liver progenitor cells. Biomaterials. 99, 82-94 (2016).
  36. Mapping lung tumor cell drug responses as a function of matrix context and genotype using cell microarrays. Integr. Biol. , (2016).">Kaylan, K. B., et al. Mapping lung tumor cell drug responses as a function of matrix context and genotype using cell microarrays. Integr. Biol. , (2016).
  37. Measuring Traction Forces in Long-Term Cell Cultures. Cellular and Molecular Bioengineering. 3 (1), 40-49 (2010).">Mann, C., Leckband, D. Measuring Traction Forces in Long-Term Cell Cultures. Cellular and Molecular Bioengineering. 3 (1), 40-49 (2010).
  38. Forces in tissue morphogenesis and patterning. Cell. 153 (5), 948-962 (2013).">Heisenberg, C. P., Bellaiche, Y. Forces in tissue morphogenesis and patterning. Cell. 153 (5), 948-962 (2013).
  39. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochim Biophys Acta. 1853 (11 Pt B), 3095-3104 (2015).">Schwarz, U. S., Soine, J. R. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochim Biophys Acta. 1853 (11 Pt B), 3095-3104 (2015).
  40. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), C595-C605 (2002).">Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), C595-C605 (2002).
  41. Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation. Nat Mater. 13 (10), 979-987 (2014).">Wen, J. H., et al. Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation. Nat Mater. 13 (10), 979-987 (2014).
  42. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. J Vis Exp. (91), e51873(2014).">Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. J Vis Exp. (91), e51873(2014).
  43. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).">Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  44. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).">Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  45. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).">Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
  46. A comparison of normalization methods for high density oligonucleotide array data based on variance and bias. Bioinformatics. 19 (2), 185-193 (2003).">Bolstad, B. M., Irizarry, R. A., Astrand, M., Speed, T. P. A comparison of normalization methods for high density oligonucleotide array data based on variance and bias. Bioinformatics. 19 (2), 185-193 (2003).
  47. Cell prestress. I. Stiffness and prestress are closely associated in adherent contractile cells. Am J Physiol Cell Physiol. 282 (3), C606-C616 (2002).">Wang, N., et al. Cell prestress. I. Stiffness and prestress are closely associated in adherent contractile cells. Am J Physiol Cell Physiol. 282 (3), C606-C616 (2002).
  48. Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (1), C146-C154 (2011).">Krishnan, R., et al. Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (1), C146-C154 (2011).
  49. Aberrant glycosylation promotes lung cancer metastasis through adhesion to galectins in the metastatic niche. Cancer Discov. 5 (2), 168-181 (2015).">Reticker-Flynn, N. E., Bhatia, S. N. Aberrant glycosylation promotes lung cancer metastasis through adhesion to galectins in the metastatic niche. Cancer Discov. 5 (2), 168-181 (2015).
  50. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).">Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
  51. Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (11), 4872(2010).">Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (11), 4872(2010).
  52. Cell-cell signaling by direct contact increases cell proliferation via a PI3K-dependent signal. FEBS Lett. 514 (2-3), 238-242 (2002).">Nelson, C. M., Chen, C. S. Cell-cell signaling by direct contact increases cell proliferation via a PI3K-dependent signal. FEBS Lett. 514 (2-3), 238-242 (2002).
  53. Micromechanical control of cell-cell interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (14), 5722-5726 (2007).">Hui, E. E., Bhatia, S. N. Micromechanical control of cell-cell interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (14), 5722-5726 (2007).
  54. Artificial stem cell niches. Adv Mater. 21 (32-33), 3255-3268 (2009).">Lutolf, M. P., Blau, H. M. Artificial stem cell niches. Adv Mater. 21 (32-33), 3255-3268 (2009).
  55. Artificial niche microarrays for probing single stem cell fate in high throughput. Nat. Methods. 8 (11), 949-955 (2011).">Gobaa, S., et al. Artificial niche microarrays for probing single stem cell fate in high throughput. Nat. Methods. 8 (11), 949-955 (2011).
  56. Cytocompatible click-based hydrogels with dynamically tunable properties through orthogonal photoconjugation and photocleavage reactions. Nat Chem. 3 (12), 925-931 (2011).">DeForest, C. A., Anseth, K. S. Cytocompatible click-based hydrogels with dynamically tunable properties through orthogonal photoconjugation and photocleavage reactions. Nat Chem. 3 (12), 925-931 (2011).
  57. Tissue geometry determines sites of mammary branching morphogenesis in organotypic cultures. Sci. STKE. 314 (5797), 298(2006).">Nelson, C. M., VanDuijn, M. M., Inman, J. L., Fletcher, D. A., Bissell, M. J. Tissue geometry determines sites of mammary branching morphogenesis in organotypic cultures. Sci. STKE. 314 (5797), 298(2006).
  58. Fabrication of 3D hepatic tissues by additive photopatterning of cellular hydrogels. FASEB J. 21 (3), 790-801 (2007).">Liu Tsang, V., et al. Fabrication of 3D hepatic tissues by additive photopatterning of cellular hydrogels. FASEB J. 21 (3), 790-801 (2007).
  59. Multiphase electropatterning of cells and biomaterials. Lab. Chip. 7 (6), 702-709 (2007).">Albrecht, D. R., Underhill, G. H., Mendelson, A., Bhatia, S. N. Multiphase electropatterning of cells and biomaterials. Lab. Chip. 7 (6), 702-709 (2007).
  60. Three-dimensional photopatterning of hydrogels using stereolithography for long-term cell encapsulation. Lab. Chip. 10 (16), 2062-2070 (2010).">Chan, V., Zorlutuna, P., Jeong, J. H., Kong, H., Bashir, R. Three-dimensional photopatterning of hydrogels using stereolithography for long-term cell encapsulation. Lab. Chip. 10 (16), 2062-2070 (2010).
  61. Host epithelial geometry regulates breast cancer cell invasiveness. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (48), 19632-19637 (2012).">Boghaert, E., et al. Host epithelial geometry regulates breast cancer cell invasiveness. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (48), 19632-19637 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell Microarray PlatformTraction Force MicroscopyCell Differentiation AnalysisPolyacrylamide HydrogelsSubstrate Stiffness TuningImmunofluorescence DetectionLiver Progenitor CellsECM Protein ScreeningNotch Ligand PresentationHigh throughput Screening

Related Articles