يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تحديد "قوتها النسبية" من مكافحة-تنف [مونوكلونل] جسم (ماب) قبل Neutralizing تنف استخدام أسلوب بيواناليتيكال في المختبر

8.3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/55376

⸱

سبتمبر 16, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Research and Development, Probiomed, 2Bioprocess Research and Development Unit, Instituto Politecnico Nacional

في هذه المقالة

ملخص

بروتوكول لتحديد نشاط apoptotic مكافحة النسبي ماب TNFα مكافحة استخدام إليه إبطال مع خلايا WEHI 164 يرد هنا. هذا البروتوكول مفيدة لمقارنة قوة الأبطال من جزيئات مختلفة مع نفس الوظيفة البيولوجية.

الملخص

هذا البروتوكول يظهر قياس تحييد نشاط apoptotic TNFα في نموذج خلية تنتجها الخلايا الليفية ماوس (WEHI 164) ماب TNFα المناهضة استخدام. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذا البروتوكول لتقييم الجزيئات المضادة-TNFα الأخرى، مثل البروتينات الانصهار. نموذج الخلوية المستخدمة هنا حساس للمبرمج بوساطة TNFα عندما فعل عامل ضغط إضافي في خلية ثقافة الظروف (مثل مصل الحرمان). ويمثل هذا الإجراء كيفية تنفيذ هذا الفحص التحليلي، تسليط الضوء على العمليات الرئيسية المتصلة بإعداد عينة وتمييع الخلية، المبرمج التعريفي، والقياسات سبيكتروفوتوميتريك ذات الأهمية الحاسمة لضمان تحقيق نتائج ناجحة. ويكشف هذا البروتوكول، أداء أفضل الشروط المتعلقة بتحريض المبرمج وكفاءة إشارة تسجيل، مما يؤدي إلى عدم اليقين انخفاض قيم.

المقدمة

الفاعلية البيولوجية هو مقياس كمي للنشاط البيولوجي استناداً إلى سمات المنتج جزيئي مرتبطة بالخصائص البيولوجية ذات الصلة، بينما الكمية (معبراً عنها بالكتلة) مقياس الفيزيائية لمحتوى البروتين. يتم إجراء الاختبارات فاعلية، جنبا إلى جنب مع منهجيات تحليلية أخرى، كجزء من المنتج المطابقة، والاستقرار، والدراسات المقارنة. وبهذا المعني، تستخدم القياسات فاعلية لإثبات استيفاء دفعات المنتج السمات النوعية الحرجة (كقاس) أو معايير القبول خلال جميع مراحل من التجارب السريرية، وبعد الحصول على موافقة السوق.

المبرمج موت الخلايا المبرمج، وتحدث بشكل طبيعي عندما الخلايا مصابة بفيروس، أو عندما يتم أكد الخلايا البيئية عاملاً أن التنازلات الخلوية البقاء والدالة1،2. بين أمور أخرى، تثبيط المبرمج، أو تحييد البيولوجية، إحدى الآليات العلاجية المعروفة أساسا من مابس، لا سيما في علاج الأمراض المزمنة مثل أمراض التهاب المناعي بوساطة. تمارس الجزيئات المضادة-TNFα خصائصها العلاجية بحجب تفاعل عامل نخر الورم ألفا (TNFα) مع p55 و p75 خلية المستقبلات السطحية3، وبالتالي منع مسارات إشارة تؤدي أخيرا إلى المبرمج الخلوي.

يمكن أن تنتج TNFα التهاب في بعض الأمراض المزمنة4. ويفرز TNFα أيامهم في الوسط خارج الخلية بواسطة الضامة، التي هي الحراس من نظام المناعة الفطرية، والجهات الفاعلة الرئيسية في هذا النوع من المرض5. كمسار مشترك، TNFα رفع القيود المقترنة مع الآلية المرضية لهذه الأمراض. دون مراقبة وفي إطار الحث المستمر والإجهاد الخلية، يستحث TNFα خلية انحطاط الموت والأنسجة، يؤدي في النهاية إلى التهاب المفاصل، وداء كرون، و الملامح المرضية الأخرى6.

قد استخدمت تنف الخصوم التي تمنع التفاعل بين تنف ولها مستقبلات متزايدة كعلاج فعال للحد من الأعراض وتعيق تطور هذه الأمراض. في الوقت الحاضر، TNFα مكافحة المخدرات المنتجات تستخدم على نطاق واسع التحكم بتركيز الجهازية سيتوكين هذا، وبالتالي منع المزيد من تدهور الأنسجة المعنية. وبهذا المعني، يتحتم توفير الحشري استنساخه وقوية لوصف قدرة محددة من المخدرات لتحقيق التأثير البيولوجي.

في هذا البروتوكول، الحرجة خطوات تم تحديدها من خلال تطوير مقايسة الأبطال-لقياس الفاعلية البيولوجية الناجحة هي أبرز، مع تركيز بشكل خاص على المهارات اللازمة لتنفيذ الأسلوب الحيوي التحليلية. يوفر هذا الأسلوب الحيوي التحليلية معلومات مفيدة القابلية للمقارنة بين دفعات مختلفة أو مكافحة-TNFα المنتجات الدوائية بالمقارنة مع مادة مرجعية تم اختبارها سريرياً.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد وسائل الإعلام والحلول

  1. إعداد متوسطة الثقافة: 1640 RPMI مع 10% FBS، درجة الحموضة 7.4.
  2. تحضير المقايسة الثقافة المتوسطة: 1640 RPMI دون الأحمر الفينول ولكن مع 1% FBS، درجة الحموضة 7.4.
  3. إعداد خلية يغسل الحل: الحل ملغ وخالية من كاليفورنيا دببس مع 0.02% يدتا، درجة الحموضة 7.4.
  4. تعد الخلية المفرزة الحل: التربسين 0.125 في المائة مع 1 مم يدتا.
    1. ذوبان الجليد 100 مل حل 0.25% يدتا التربسين ونقل إلى قارورة 500 مل معقمة.
    2. ميكس مع 100 مل خلية يغسل الحل والاستغناء عن مختبرين 15 مل في أنابيب معقمة 15 مل. مخزن في-70 إلى-80 درجة مئوية حتى استخدام.
    3. تصفية هذه الحلول من خلال غشاء 0.22 ميكرومتر والحارة يصل إلى 37 درجة مئوية لمالا يقل عن 30 دقيقة قبل استخدامها.
  5. إعداد المبرمج-التعريفي الأسهم الحل TNFα في 3.3 ميكروغرام/ملليلتر-
    1. حل 20 ميكروغرام من TNFα مع 500 ميليلتر لتصفية تعقيم المياه في الحاويات الأولية والمزيج حتى حل كامل-
      2. نقل في أنبوب عقيم 15 مل
    2. وإضافة 5.5 مل دببس مغ وخالية من كاليفورنيا إلى حل لهذا الأنبوب. المزيج بلطف باستخدام خلاط دوامة.
    3. قاسمة الحل إلى 70 ميليلتر أجزاء. الاستغناء عن كل قاسمة إلى 0.5 مل microtubes ومخزن في-80 درجة مئوية.
  6. إعداد المبرمج حل التعريفي: حل TNFα في 40 نانوغرام/مليلتر.
    1. ذوبان الجليد قاسمة الحل الأسهم التعريفي المبرمج، تفرخ في حمام مائي في ˚C 25 للحد الأدنى 10
    2. إضعاف التعريفي المبرمج حل الأسهم 40 نانوغرام/مل بإضافة ميليلتر 61 3.3 ميكروغرام/مل TNFα حل لمل 4.939 للمقايسة الثقافة المتوسطة في أنبوب عقيم 15 مل.
    3. مزيج من دوامة خلاط 10 s؛ وهذا الحل يجب أن يكون مستعدا طازجة قبل الاستخدام.
    4. الاحماء الحل إلى 37 درجة مئوية لمالا يقل عن 30 دقيقة قبل استخدامها في التحليل انيوتراليزيشن ال-
  7. إعداد الحل الركيزة: caspase 3/7 Glo الحل 7 ، 8-
    1. ذوبان الجليد الحل المخزن المؤقت كاسباسي (المخزن المؤقت Glo كاسباسي 3/7) ح 12 قبل الاستخدام.
    2. تمكنك من حل المخزن المؤقت كاسباسي والركيزة (الركيزة Glo كاسباسي 3/7) الجلوس بشكل منفصل في 25 ± 5 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل الاختلاط.
    3. نقل 10 مل الحل المخزن المؤقت caspase قنينة الركيزة ومزيج من انعكاس.
    4. تبقى في 25 ± 5 درجات مئوية، محمية بالضوء حتى استخدام.
      ملاحظة: الحل مستقر ح 6 في درجة حرارة الغرفة-

2. خلية كولتورينج والعد

  1. ذوبان الخلية وثقافة فرعية الأولى.
    1. إزالة قنينة واحدة مع WEHI 164 الخلايا 9 من ثلاجة في-80 ˚C ونقلها إلى حمام الثلج.
    2. "الماصة؛" صعودا وهبوطاً مع 1 مل من قبل حرارة ثقافة متوسطة حتى ذوبان الجليد تماما الخلايا المجمدة.
    3. الاستغناء عن 9 مل من قبل حرارة متوسطة الثقافة على أنبوب عقيم 15 مل.
    4. نقل تعليق خلية في أنبوب عقيم 15 مل وتخلط بلطف من خمس مرات بانعكاس.
    5. الطرد المركزي من تعليق خلية في 125 x ز للحد الأدنى 3 تجاهل المادة طافية وتصنيف بيليه الخلية.
      6. إضافة
    6. 5 مل من الثقافة المتوسطة للأنبوب. مزيج حتى يتم تماما حراكه الخلايا.
    7. لعد الخلايا، نقل 50 ميليلتر من تعليق خلية إلى 500 ميليلتر microtube وخلط مع 50 ميليلتر من 0.4% تريبان الأزرق. عد الخلايا وضبط إلى 0.5 × 10 6 خلايا/مل. راجع الخطوة 2-2، أدناه-
    8. إضافة 13 مل من قبل حرارة الثقافة المتوسطة إلى قارورة ثقافة الخليوي 75 مل.
    9. الاستغناء عن حجم تعليق الخلية ما يكفي من الخطوة 2.1.6 لتحقيق 0.5 × 10 6 خلايا/مل في قارورة ثقافة الخليوي واحتضان في 37 درجة مئوية و 5% CO 2 بين عشية وضحاها.
  2. خلية العد.
    ملاحظة: انظر المرجع 10.
    1. باستخدام الحل من الخطوة 2.1.6، نقل 0.05 مل هيموسيتوميتير وتحديد كثافة الخلية تحت مجهر استخدام الاستبعاد تريبان الأزرق-
    2. تقدير العدد الكلي للخلايا وخلايا قابلة للحياة-
    3. ضبط تعليق خلية إلى 0.5 × 10 6 خلايا/مل.
      معادلة 1
      V الثقافة المتوسطة (mL) = figure-protocol-1
      V الثقافة المتوسطة (mL) = (5 مل-V تعليق خلية)
      V الثقافة المتوسطة (mL) = حجم المعدل WEHI 164 خلية تعليق
      NVC = عدد مجدية WEHI 164 خلايا/مل
      الخامس الثقافة المتوسطة (mL) = المقايسة الثقافة المتوسطة الحجم إضافة إلى تعليق خلية لتحقيق 0.5 × 10 6 خلايا/مل
      0.5 × 10 6 = كثافة الخلية المستهدفة
  3. الخلية المفرزة وفرعية الثاني والثالث.
    ملاحظة: يمكن استخدام نظام الشفط لإزالة الحلول من قوارير. ويمكن استخدام الماصات معقمة تستعمل لمرة واحدة أو الزجاج. إذا كان يحتوي الماصة تسد القطن أعلى، يجب إزالته قبل الاستخدام.
    1. إزالة المتوسطة الثقافة من زراعة الخلايا T-قارورة استخدام 1 مل ماصة معقمة وفراغ.
      2. الحل
    2. مل 5 الاستغناء عن الغسيل الخلية في الثقافة تي-قارورة، تخلط بلطف، وتجاهل الحل. كرر هذه الخطوة مرتين-
      ملاحظة: الإزالة الكاملة للمتوسط الثقافة حاسمة بالنسبة لكفاءة الخلية المفرزة.
    3. إضافة 15 مل من محلول مفرزة خلية T-قارورة واسمحوا الوقوف لمدة 3 دقائق في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO 2-
    4. التحقق من عدم وجود خلايا المرفقة في قارورة الجدار الداخلي تحت المجهر. إزالة الخلايا من ثقافة تي-قارورة استخدام ماصة معقمة من 20 مل والاستغناء عن لهم في أنبوب 50 مل معقمة.
    5. الطرد المركزي من تعليق خلية في 125 x ز للحد الأدنى 3 تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه مع آخر 5 مل من مستنبت.
    6. عد الخلايا، وإضافة المتوسطة الثقافة ما يكفي للوصول إلى تركيز الخلايا المطلوب وفقا المعادلة 1-
    7. إضافة هذا التعليق إلى 72 سم 2 ر-قارورة واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5% CO 2-
    8. ثقافة فرعية الخلايا مرتين على الأقل قبل استخدامها في التحييد الاعتداء. كرر الخطوات 2.3.1-2.3.8 لليومين المقبلين-
  4. الاعتداء تعليق خلية. ثقافة فرعية
    1. حدد 164 WEHI يحتوي على مسارات ثلاثة على الأقل. راجع الخطوة 2، 1-
    2. فصل وحساب الخلايا وفقا للخطوات 2-2 و 2-3 من هذا البروتوكول.
    3. تمييع تعليق خلية وفقا المعادلة 1 إلى 0.5 × 10 6 خلايا/مل.
    4. استخدام هذا التعليق الخلوية للمقايسة الأبطال. خلط كل تعليق خلية دوامة خلاط قبل استخدام.

3. إعداد الأجسام المضادة وتخفيف

  1. كوانتيتيشن مابس-
    1. تحديد تركيز المواد المرجعية ونموذج عنصر تحكم نموذج تحليلي من خلال امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 280 نانومتر باستخدام معامل (1.39) انقراض جماعي على 11-
      ملاحظة: يمكن أن تؤخذ تركيزات الأصلي من المخدرات المنتج التسميات. ومع ذلك، يجب التحقق من ذلك بامتصاص الأشعة فوق البنفسجية-
  2. تخفيف ماب-
    1. ديلوت جميع العينات بشكل مستقل في ثلاث نسخ، مع حل مغ وخالية من كاليفورنيا دببس في microtubes 2 مل، وصولاً إلى 2 ملغ/مل. تأكيد هذا التركز بامتصاص الأشعة فوق البنفسجية في ثلاث نسخ، باستخدام حل خالية من كاليفورنيا وملغ دببس الفارغة.
    2. ميكس الحلول البروتين المخزون 5 s باستخدام خلاط دوامة.
    3. ميليلتر 100 تمييع كل حل ماب 2 مغ/مل مع 0.9 مل المتوسط الثقافة المقايسة.
      4. S
    4. المزيج ل 5 من دوامة خلاط.
      ملاحظة: هذه الحلول لها بتركيز 200 ميكروغرام/مل. ويجب أن يتم تخفيف لكل ثلاث نسخ.
    5. تمييع 10 آند #181؛ L لكل حل ماب 200 ميكروغرام/مل مع مل 0.99 المتوسط الثقافة المقايسة. مزيج 5 s باستخدام خلاط دوامة. هذه الحلول لها بتركيز 2 ميكروغرام/مل. إجراء تخفيف المسلسل لكل ثلاث نسخ قبل استخدامها في التحليل تحييد.
      6. جعل
    6. المضادة-TNFα تخفيف ماب في ثلاثة ميكروبلاتيس المستقلة. جعل نسخة مكررة من كل ثلاث نسخ مستقلة والاستغناء عن لهم في صفيحة واحدة، كما هو مبين في الجدول 1. مرجع مضمون < الجدول fo:keep-together.within-الصفحة = fo:keep "1"-مع-next.within-صفحة = "دائماً" fo:text-محاذاة = "توسيط" > 1 لوحة لوحة 2 لوحة 3 الآبار عينة الآبار عينة الآبار عينة B2:B11 مادة مرجعية B2:B11 B2:B11 نموذج عنصر تحكم نموذج تحليلي C2:C11 C2:C11 C2:C11 D2:D11 نموذج تحليلي D2:D11 مادة مرجعية D2:D11 نموذج عنصر تحكم E2:E11 E2:E11 E2:E11 F2:F11 نموذج عنصر تحكم F2:F11 عينة تحليلية F2:F11 مادة مرجعية G2:G11 G2:G11 G2:G11 1 الجدول: صفائف عينة ميكروسكوبية. يجب تشغيل مقايسة تحييد كاملة في ميكروبلاتيس الثلاثة ضمن إحداثيات B2 إلى G11. عشوائي الاستغناء عن الإشارة، تحليلية، وعينات مراقبة السماح للباحثين للتحقق من أي تحيز في المقايسة.
    7. إجراء تخفيف ماب كل مرجع، عينة، أو التحكم، كما هو مبين في الجدول 2-
      ملاحظة: لا يتم تركيزات ماب TNFα المضادة الموضحة في هذا الجدول التركيزات النهائية في مقايسة الأبطال. < td > 250
      عمود لوحة"حجم المقايسة" الثقافة المتوسطة (ميكروليتر)حجم مادة مرجعية، ونموذج تحليلي أو عنصر تحكم عينة (uL)تركيز في "لوحة الفحص" (نانوغرام/مل)
      202302000
      3150150 من السطر 21000
      47575 من سطر 3500
      510050 من سطر 3333
      67575 من سطر 4
      77575 من سطر 5166
      87575 من خط 6125
      97575 جيئة وذهابا خط م 783
      107575 من الخط 941
      1115075 من خط 1013
      تي 2 قادرة على: تخفيف ماب المضادة-TNFα. تخفيف المسلسل لمكافحة--TNFα مابس وأظهرت في هذا الجدول. تركيزات النهائية المبينة في هذا الجدول لا التركيزات في التحليل، حيث كانت مخففة المضادة-TNFα مابس بمعامل 3 (تمييع ماب + المتوسطة الثقافة تعليق الخلايا). تمثل الخطوط بخط غامق تخفيف قادمة من البنود 3، 5، 7، 9 و 10؛ تمثل الخطوط غير الغامق التخفيف من البنود 3 و 4 و 6. وتتم هذه تخفيف المسلسل فقط قبل إجراء الفحص تحييد. ويجب الحرص على مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً ثلاث مرات قبل صرفها تخفيف.
    8. الحفاظ اللوحات في 25 ± 5 درجات مئوية حتى استخدام.

4. تحييد الإنزيم مع خلايا 164 WEHI

  1. مزيج من فورتيكسينج كل خلية المعلقات (0.5 × 10 6 خلايا/مل) قبل صرفها في أي خطوة من هذا البروتوكول.
    ملاحظة: في هذا القسم، الحارة كل حل إلى 37 درجة مئوية و 30 دقيقة قبل استخدام.
  2. نقل 50 ميليلتر من تعليق خلية لكل من الآبار 60 من ميكروبلاتيس، الانتقال من العمود 2 إلى 11 وخط ب غ.
    3. تخفيف
  3. نقل 50 ميليلتر ماب وعينه، والتحكم في ميكروبلاتيس. وتتبع النمط هو مبين في الشكل 1.
  4. إضافة 50 ميليلتر من الحل التعريفي المبرمج لكل بئر.
  5. ضوابط استخدام الهاتف الخلوي من 50 ميليلتر من WEHI 164 الخلايا، في ثلاثة آبار. إحضار كل بئر لوحدة تخزين نهائي من 150 ميليلتر مع المقايسة الثقافة المتوسطة.
  6. استخدام عنصر تحكم سيتوتوكسيسيتي من خليط من 50 ميليلتر من الخلايا WEHI 164 زائد 50 ميليلتر من المبرمج التعريفي الحل. إحضار كل بئر لوحدة تخزين نهائي من 150 ميليلتر مع المقايسة الثقافة المتوسطة.
  7. السيطرة على TNFα، استخدم 50 ميليلتر من الحل التعريفي المبرمج واحضاره إلى 150 ميليلتر مع المتوسط الثقافة المقايسة.
  8. للفراغ، استخدم 150 ميليلتر المتوسط الثقافة المقايسة وحدها.
  9. ملء الآبار المتبقية مع 150 ميليلتر من مستنبت لتجنب آثار تبخر لوحة.
    10. 4.1.1-4.1.9
  10. تكرار الخطوات مرتين في اثنين آخرين ميكروبلاتيس.
    ملاحظة: ماب وتركيزات نهائية في الميكروسكوبية هي: 0.666، 0.333، 0.167، 0.111، 0.083، 0.056، 0.042، 0.028، 0,014، و 0.004 ميكروغرام/ملليلتر-
  11. تحميل العينات في ميكروبلاتيس، كما هو مبين في الشكل 1.
    figure-protocol-2
    رقم 1: التخلص عينات في لوحات المقايسة. B1 إلى G11 إحداثيات جيدا في ميكروبلاتيس وتصف المواقف التي يوضع فيها تخفيف العينة. إحداثيات المفقودين آبار مليئة بالضوابط والمقايسة الثقافة المتوسطة (A1-A12 و H1-H12). ويساعد هذا التوزيع العشوائي من عينات (تخفيف الأمامية والعكسية في ميكروبلاتيس) للقضاء على التحيز في النتائج بسبب التبخر متوسطة أو متغيرات أخرى. فمن الأفضل أن كل الميكروسكوبية يقوم به محلل واحد في وقت واحد. R: مرجع, s: عينة، CS: عنصر تحكم نموذج، ديل: التخفيف. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
  12. احتضان ثلاث لوحات في 37 درجة مئوية و 5% CO 2 ل 16 ± 2 حاء
  13. اسمحوا الوقوف عند 25 ± 5 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل استخدام الكاشف Glo كاسباسي 3/7-
  14. إضافة 100 ميليلتر من هذا الكاشف لجميع الآبار، بما في ذلك النماذج وعناصر التحكم.
  15. يهز لوحات استخدام خلاط دوامة ميكروسكوبية لمدة 3 دقائق في 25 ± 5 درجات مئوية مباشرة بعد الاستغناء عن إلى الآبار.
  16. احتضان اللوحات ل 2.5 ± 0.5 ح في 25 ± 5 درجة مئوية، ومحمية من الضوء.
  17. إدراج هيئة التصنيع العسكريروبلاتيس إلى لومينوميتير وإكمال المقطع التالي-

5. تحليل نتائج

  1. باستخدام برمجيات للكشف عن التﻷلؤ، حدد الدالة الوضع ونقطة النهاية التﻷلؤ.
  2. تحديد واضح 96-جيدا-قاع اللوحة وآبارها الداخلية 80، باستثناء الأعمدة 1 و 12-
  3. حدد وقت تكامل 1,250 مرض التصلب العصبي المتعدد و 10 ق لخلط الميكروسكوبية قبل القراءة.
  4. تحديد الآبار حيث سيتم وضع المواد المرجعية والمضمون التحليلي ونموذج عنصر تحكم وتحديد تركزاتها المقابلة.
  5. قراءة العينات التي توضع في ميكروبلاتيس لومينوميتير-
  6. استخدام معادلة معلمة الرابع بإجراء تحليلات للنتائج. رسم منحنى استجابة لجرعة، كما هو مبين في الشكل 2-
    figure-protocol-3
    رقم 2: منحنى الاستجابة للجرعة. ويرد المضادة-TNFα ماب تركيز مقابل التﻷلؤ (بقاء الخلية). واستخدمت كنموذج معادلة معلمة الرابع بوصف حماية مكافحة-TNFα مابس. EC50 هو تركيز الإنسان والمحيط الحيوي الذي يمكن تحييد مبلغ TNFα التي تتسبب في موت الخلايا 50% في كل فحص، يتمثل ذلك في الرسم البياني كالتغيير في المنحدر. أشرطة وصف الانحراف المعياري التﻷلؤ لكل تركيز الإنسان والمحيط الحيوي. x يمثل تركيز Ab المضادة-TNFα وهو يصور على أنه دالة لوغاريتمية في نانوغرام/ملليلتر، بينما تمثل y الاستجابة التﻷلؤ في وحدات التعسفي التﻷلؤ. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
    ملاحظة: في معادلة المعلمة الرابع، ج هو التركيز الفعال 50 (EC50). سيتم استخدام هذه القيمة مقارنة مادة مرجعية، ونموذج تحليلي، ونموذج عنصر تحكم عن طريق الدالة المستجيب.
  7. لحساب مقايسات النسبي، إصلاح مضمون الإشارة إلى 100% وحساب مقايسات العينة والسيطرة عليه.
    ملاحظة: هذه القيم ويرد في الشكل 3-
    figure-protocol-4
    رقم 3: المعادلات الرياضية المستخدمة لحساب في EC50s وقيمها. EC50 القيم، أو معلمات ج، بعدم اليقين ما وصفت الخطأ القياسي. كما هو مبين من EC50s مقارنة بين نتائج العينة ومرجع لقوتها النسبية. يتم حساب فاصل الثقة مع α = 0.05. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

الرسم البياني في الاستجابة للجرعة (مع عناصر التحكم)
يمثل الشكل 1 الاستجابة التﻷلؤ مقابل تركيز الإنسان والمحيط الحيوي. تجسد هذه الدالة سيجمويدال caspase 3 و 7 الإفراج عنه في مستنبت المقايسة بسبب تحلل الخلية. موت الخلية تتعزز بالمجاعة المصل بالإضافة إلى TNFα إشارات تعريفية. ولذلك، يتفاعل جزيء المضادة-TNFα (ماب) مع سيتوكين، يحول دون تفاعلها مع مستقبلات الخلية تنف (عن طريق إعاقة الفراغية). وهذا يسبب بقاء الخلية في تركيزات أعلى ماب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وهذا الوصف تساعد على تحديد بداهة السلوك البيولوجي لجزيء تحت التطوير قبل أن تجري التجارب السريرية مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً. كما أنها مفيدة للإفراج عن دفعة لدفعة لمنتج المخدرات الموافق عليها. تجدر الإشارة إلى أن هذه الاختبارات مفيدة لتحديد ما إذا كان جزيء له تأثير بيولوجية ملائمة بشأن إليه العمل. الأسلوب الحيوي التحليلية المقدمة في هذا البرنامج التعليمي من الأهمية بمكان للمقارنة بين الجزيئات المضادة-TNFα مختلفة. على الرغم من الأسلوب الفيزيائية المشتركة، هذه المنهجية قادرة على أن تحدد، من خلال الوسائل البيولوجية،...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف عن

شكر وتقدير

هذا العمل كان يدعمه "المجلس الوطني للعلوم" والتكنولوجيا (المجلس الوطني)، والمكسيك منحة بي مبرزين 2015 220333، دون مشاركة في التصميم الدراسة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
WEHI 164ATCCCRL-1751خلايا الساركوما الليفية من Mus musculus
RPMI-1640 MediumATCC30-2001تخزين متوسط في 2 درجة ؛ C إلى 8 & C
RPMI 1640 متوسط ، لا فينول أحمرGIBCO11835-030تخزين متوسط عند 2 درجة ؛ C إلى 8 & C
Trypsin-EDTA (0.25٪) ، الفينول الأحمرGIBCO25200-056تخزين متوسط عند -10 درجة ؛ C إلى -20 درجة ؛ C
DPBS ، خال من الكالسيوم ، خال من المغنيسيومGIBCO14190-136تخزين متوسط عند 2 درجة ؛ C إلى 8 & ج
المؤتلف البشري TNF-alpha البروتينR & D Systems210-TA-020مخزن عند -20 درجة ؛ C إلى -70 درجة ؛ C
مصل الأبقار الجنينية (الولايات المتحدة) ، تخزين SH3089803 IgGHyCloneالمنخفض للغاية عند -10 درجة ؛ C إلى -20 درجة ؛ C
مصل الأبقار الجنينية (الولايات المتحدة) ، يتميزHyCloneSH3007103بمخزن عند -10 درجة ؛ C إلى -20 درجة ؛ C
Caspase-Glo 3/7 مجموعة الفحصPromegaG8093تخزين Caspase-Glo. 3/7 الركيزة و Caspase-Glo. 3/7 Buffer at – 20 & ordm; C محمي منLight
EDTA ، ملح ثنائي الصوديوم ، ثنائي الهيدرات ، الكريستال ، كاشف ACSJTBaker8993-01-
عينة mAb AdalimumabProbiomedNAالتركيزات النهائية في الصفيحة الدقيقة هي:   ؛ 0.666 ، 0.333 ، 0.167 ، 0.111 ، 0.083 ، 0.056 ، 0.042 ، 0.028 ، 0.014 و 0.004 & جم / مل
مرجع وتحكم mAb AdalimumabAbbvieNAالتركيزات النهائية في الصفيحة الدقيقة هي:  0.666 ، 0.333 ، 0.167 ، 0.111 ، 0.083 ، 0.056 ، 0.042 ، 0.028 ، 0.014 و 0.004 & g / mL
Microplate Readerالأجهزة الجزيئية89429-536SpectraMax M3 Multi-Mode
Microplate Reader Software الأجهزة الجزيئية-حاضنة SoftMax Pro 6.3 GxP
  ؛ريفكو 30482Revco RNW3000TABB غطاء التدفق الصفحي CO2 للهواء القسري
 شركة بيكر   200256بيكر SG603A-HE | كفاءة عالية ، الفئة الثانية نوع A2 & nbsp ؛                  

المراجع

  1. Elmore, S. Apoptosis: A Review of programmed cell death. Toxicol Patho. 35 (4), 495-516 (2007).
  2. Darwish, R. S. Regulatory mechanisms of apoptosis in regularly dividing cells. Cell Health Cytoskelet. 2 (1), 59-68 (2010).
  3. Tracey, D., et al. Tumor necrosis factor antagonist mechanism of action: A comprehensive review. Pharmacol Ther. 117 (2), 244-279 (2008).
  4. Körner, H., Sedgwick, J. Tumour necrosis factor and lymphotoxin: Molecular aspects and role in tissue-specific autoimmunity. Immunol Cell Biol. 74 (5), 465-472 (1996).
  5. Wong, M., et al. TNFa blockade in human diseases: Mechanisms and future directions. Clin Immunol. 126 (2), 121-136 (2008).
  6. Furst, D. E., Wallis, R., Broder, M., Beenhouwer, D. O. Tumor necrosis factor antagonists: different kinetics and/or mechanisms of action may explain differences in the risk for developing granulomatous infection. Semin Arthritis Rheum. 36 (3), 159-167 (2006).
  7. Karvinen, J., et al. Homogeneous time-resolved fluorescence quenching assay (LANCE) for caspase-3. J Biomol Screen. 7 (3), 223-231 (2002).
  8. Ren, Y. G., et al. Differential regulation of the TRAIL death receptors DR4 and DR5 by the signal recognition particle. Mol Biol Cell. 15 (11), 5064-5074 (2004).
  9. Sud, D., Bigbee, C., Flynn, J. L., Kirschner, D. E. Contribution of CD8+ T cells to control of Mycobacterium tuberculosis infection. J Immunol. 176 (7), 4296-4314 (2006).
  10. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. Apendix 3, 3(2001).
  11. Ramasubramanyan, N., et al. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same. 1, ABBVIE INC. North Waukegan Road, North Chicago, IL, 60064, US. (2014).
  12. Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nat Protoc. 2 (9), 2276-2284 (2007).
  13. Eskandari, M. K., Nguyen, D. T., Kunkel, S. L., Remick, D. G. WEHI 164 subclone 13 assay for TNF: sensitivity, specificity, and reliability. Immunol Invest. 19 (1), 69-79 (1990).
  14. Hora, M. S., Rana, R. K., Smith, F. W. Lyophilized formulations of recombinant tumor necrosis factor. Pharm Res. 9 (1), 33-36 (1992).
  15. Ponnappan, S., Ponnappan, U. Aging and immune function: molecular mechanisms to interventions. Antiox Redox Signal. 14 (8), 1551-1585 (2011).
  16. Matsumaru, K., Ji, C., Kaplowitz, N. Mechanisms for sensitization to TNF-induced apoptosis by acute glutathione depletion in murine hepatocytes. Hepatology. 37 (6), 1425-1434 (2003).
  17. Camacho-Villegas, T., Mata-Gonzalez, T., Paniagua-Solis, J., Sanchez, E., Licea, A. Human TNF cytokine neutralization with a vNAR from Heterodontus francisci shark: a potential therapeutic use. mAbs. 5 (1), 80-85 (2013).
  18. Männel, D. N., Falk, W. Optimal induction of tumor necrosis factor production in human monocytes requires complete S-form lipopolysaccharide. Infect Immun. 57 (7), 1953-1958 (1989).
  19. Lis, K., Kuzawińska, O., Bałkowiec-Iskra, E. Tumor necrosis factor inhibitors-state of knowledge. Arch Med Sci. 10 (6), 1175-1185 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تعطيل عامل نخر الورم ألفانموذج خلايا WEHI 164مقايسة تحفيز الموت الخلوي المبرمجتحديد القوة النسبيةبروتوكول التخفيف التسلسليالتحليل الطيفي الضوئيقياس التركيز الفعال النصفي EC50الاستزراع الفرعي للمزارع الخلوية
تحديد "قوتها النسبية" من مكافحة-تنف [مونوكلونل] جسم (ماب) قبل Neutralizing تنف استخدام أسلوب بيواناليتيكال في المختبر
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.