مقالة منهجية

كشف وإثراء نادر محددة مستضد الخلايا B لتحليل النمط الظاهري وظيفة

DOI:

10.3791/55382

⸱

فبراير 16, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado School of Medicine, 2Department of Microbiology, Immunology, and Pathology, Colorado State University, 3Barbara Davis Center for Childhood Diabetes, University of Colorado School of Medicine, 4Department of Biomedical Research, National Jewish Health

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ووصف وهناك طريقة بسيطة لكنها فعالة التي توظف النانوية المغناطيسية للكشف عن وإثراء خلايا B-مستضد رد الفعل لتحليل وظيفي والمظهرية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
عادة ما تحدث < p class = 'jove_content'>B التي تتفاعل مع مستضد معين بتردد <0.05٪ من الخلايا الليمفاوية. لعقود من الزمان ، سعى الباحثون إلى طرق لعزل وإثراء هذه الخلايا النادرة لدراسات نمطها الظاهري وبيولوجيتها. تستند الأساليب حتما إلى مبدأ أن الخلايا البائية تتعرف على المستضد الأصلي بحكم مستقبلات سطح الخلية التي تمثل خصوصية الأجسام المضادة التي ستفرزها بناتها في النهاية. ربما يتضمن النهج الأكثر وضوحا للمشكلة استخدام المستضدات المترافقة بالفلوروكروم جنبا إلى جنب مع فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS). ومع ذلك ، فإن فائدة هذه الطرق محدودة بتردد الخلية ومعدل التحليل والعزل الذي يمكن تحقيقه عن طريق الفرز الإلكتروني. تم وصف طريقة جديدة لإثراء الخلايا البائية النادرة الخاصة بالمستضد باستخدام الجسيمات النانوية المغناطيسية التي تؤدي إلى إثراء عالي الغلة للخلايا البائية المتفاعلة بالمستضد من مجموعات خلايا البداية الكبيرة. تتيح هذه الطريقة مراقبة محسنة للنمط الظاهري وبيولوجيا الخلايا التفاعلية للمستضد قبل وبعد مواجهة مستضد في الجسم الحي ، مثل بعد التحصين أو أثناء تطور المناعة الذاتية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الحد تخفيف تحليلات تردد خلية السلائف إفراز الأجسام المضادة قد اقترح أن الخلايا B رد الفعل لمستضد معين يحدث عادة على تردد 0.05 إلى 0.005٪ في جعبته العادي، وهذا يتوقف على حالة التلقيح وحجم / عدد الحواتم موجودة على المستضد. جعلت التردد المنخفض من هذه الخلايا من الصعب دراسة التغيرات في وضعهم خلال تطوير الاستجابات المناعية، مثل بعد التطعيم أو التعرض لمستضد أجنبي، أو خلال تطوير المناعة الذاتية. سابقا، وقد الباحثون إجراء عزل خلايا B-مستضد رد الفعل باستخدام تقنيات تتراوح بين لوحات مستضد المغلفة أو الماصة العمود، لالمغلفة مستضد الدم الحمراء خلية إعادة تعيين، إلى خلية الفرز 1، 2، 3، 4، 5، 6 مضان تنشيط. بالرغم من ذلكح كانت هذه التقنيات ناجحة في تحديد وعزل الخلايا مستضد رد الفعل B، وقد اختلفت النتائج من حيث العائد والنقاء وتطويره. مؤخرا قمنا بتطوير طريقة جديدة لكلا كشف وإثراء نادرة القطعان ب اللمفاويات استخدام الجسيمات النانوية المغناطيسية. طريقة تمكن التخصيب مع ارتفاع العائد نسبيا، ونقاء من السكان انطلاق كبيرة، ومتوافق مع تحليل الردود على مستضد. من خلال إثراء من السكان من الخلايا في تعليق، والأسلوب يلغي القيود التي ترتبط مع هندسة لوحات أو الأعمدة المغلفة مستضد، والحد من الإنتاجية. وأخيرا، منذ تبقى الخلايا المخصبة المرتبطة مستضد ومراسل الفلورسنت، ويمكن زيادة تنقيته بواسطة FACS الفرز. كما هو موضح هنا استخدمنا هذا النهج لدراسة الطرفية الكزاز الدم توكسيد رد الفعل الخلايا البائية قبل وبعد التحصين من الموضوعات الإنسان، وكذلك الخلايا مستضد ذاتي رد الفعل B من الموضوعات مع مختلف autoiاضطرابات مناعية، بما في ذلك داء السكري من النوع 1، مرض جريفز، ومرض هاشيموتو 7. والطريقة تعمل ايضا على قدم المساواة في الماوس والبشرية، ومتوافق مع تحليل الخلايا مستضد رد الفعل B من مجموعة متنوعة من الأنسجة (مخطوطة قيد الإعداد).

في الشكل الأساسي لها، يتم تحضين الخلايا وحيدة النواة في الدم المحيطي لأول مرة مع مستضد المعقدة البيروكسيديز جنبا إلى جنب مع الأجسام المضادة إلى الخلية المستضدات السطحية اللازمة لتحليل المظهري. ويتبع هذه الخطوة وضع العلامات من قبل الغسيل والتثبيت، وإضافة streptavidin بالإضافة إلى صبغ بعيدة الحمراء فلوري للكشف عن الخلايا ملزمة المعقدة البيروكسيديز مستضد (الشكل 1). وقد حددت الدراسات السابقة خلايا مستضد معين B بطريقة مماثلة ولكن باستخدام مستضدات مترافق مباشرة إلى تألقي 8، 9، 10، 11. على الرغم من أن هذا هو جديرالنهج، واستخدام المضادات المعقدة البيروكسيديز بالتزامن مع streptavidin يتيح أكبر تضخيم إشارة (التمايز بالتالي أفضل من الربط والخلايا غير ملزمة)، لا سيما عندما المستضدات صغيرة 12 و 13 و 14. وهناك اعتبار آخر هو استخدام streptavidin بدلا من أفيدين لأن deglycosylated streptavidin، وخفض غير محددة وملزمة. وعلاوة على ذلك، ونحن نستخدم صبغ بعيدة الحمراء الفلورسنت كما تألقي بسبب صمود لها، والغلة الكم (السطوع)، وحجمها الصغير (~ 1.3 دينار كويتي). fluorochromes البروتين مثل فيكوإيريترين (~ 250 دينار كويتي) وallophycocyanin (~ 105 دينار كويتي) 15 ليست هي الأمثل لأنها يحتمل أن تحتوي على العديد من الحواتم مستضدي. استخدام صبغة الفلورسنت العضوية صغيرة تتألف من حاتمة واحدة، مثل صبغ بعيدة الحمراء الفلورسنت، ويقلل من تعقيد السكان خلية معزولة.

بمجرد خلايا البيروكسيديز واحدntigen وصبغ streptavidin كثف بعيدة الحمراء الفلورسنت، وإثراء أنها تستخدم لمكافحة بعيدا الحمراء الفلورسنت النانوية المغناطيسية صبغ مترافق. لم يتم الكشف عن الجسيمات النانوية واحدة من قبل معظم أجهزة قياس التدفق الخلوي، وبالتالي ليس من الضروري إزالتها قبل تنقية من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز والمقايسات المصب 16. اختيار المغناطيسي للخلايا مستضد معين B إثراء السكان من الاهتمام، والقضاء على الوقت والتكلفة اللازمين لفرز الأحداث النادرة باستخدام قياس التدفق الخلوي.

فيما يلي نعرض نتائج ممثلة من تخصيب الخلايا الكزاز وتوكسويد الخاصة ب من الموضوع بعد قبل وسبعة أيام التطعيم ضد التيتانوس معززة. لقد اخترنا هذا تطبيق معين على سبيل المثال من أجل إثبات قدرة هذه الطريقة لتخصيب خلايا B-مستضد معين التالية الحاد في تحفيز الجسم الحي. عندما يقترن مع التدفق الخلوي، وهذه الطريقة هي قادرة على إثراء والتمييز مستضد معين ساذجة، والذاكرة، وخلايا أرومة البلازماوية باء وتسمح للباحث لمتابعة التغيرات في وتيرتها مع مرور الوقت. وبالإضافة إلى ذلك، ندرج الممكن فحص آخر المصب، مثل مقايسة ELISPOT، والذي يدل على أن الخلايا تحتفظ القدرة على إفراز الأجسام المضادة بعد التخصيب. تطبيق آخر من هذه الطريقة يمكن أن تشمل نقل بالتبني من الخلايا المخصب إلى المضيف. لقد أظهرنا سابقا خلايا الحفاظ على القدرة على التصرف كما مستضد الخلايا إلى خلايا T مستضد معين بعد عزل ونقل (لا تظهر البيانات). وبالتالي، هناك عدد من المقايسات المصب المحتملة التي يمكن أن يقترن إلى الطريقة التي تبلغ معا فهم الاستجابة المناعية مستضد معين. وصفناها الأسلوب أدناه، بما في ذلك الضوابط لتحديد العائد الكلي، والنقاء، والنوعية الخلية، وأضعاف اليورانيوم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. عزل PBMCs البشرية

  1. جمع 30-50 مل من الدم باستخدام heparinized أنابيب جمع الدم.
    ملاحظة: كمية الدم المستخدمة تعتمد على السؤال تجريبي معين، وتردد في الدم من خلايا B-مستضد معين من الاهتمام. الدم Heparinized يمكن معالجتها على الفور أو هز بلطف بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة لتجهيز في اليوم التالي. التأخير في معالجة له ​​تأثير ضئيل جدا على كفاءة تخصيب ويترافق مع فقدان الحد الادنى من قدرتها على البقاء.
  2. خلط الدم الكامل 1: 1 مع معقم، والمغنيسيوم والكالسيوم درجة حرارة الغرفة خالية الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
  3. في 50 مل أنبوب مخروطي العقيمة، وإضافة 10 مل من درجة حرارة الغرفة حل التدرج الكثافة. تخزين الزجاجات الكثافة التدرج فتح في الظلام في 4 درجات مئوية، ولكن الحار إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
  4. إذا كان ذلك ممكنا تعيين بندقية ماصة إلى الإعداد بطيئة و / أو تطبيق القليل جدا، ولكن بما يتفق وضغط الزناد لببطءطبقة 30-35 مل من الدم المخفف على أعلى درجة الكثافة، والحرص على عدم خلط اثنين.
    ملاحظة: وضع غيض من ماصة على حافة ال 50 مل شطبة في حين اضاف الدم المخفف سوف تساعد على ضمان تدفق مستمر ثابت.
  5. تحولت أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 30 دقيقة عند 20 درجة مئوية مع قبالة الفرامل.
  6. إزالة الطبقة العليا، والذي يحتوي على البلازما والصفائح الدموية، والحرص على عدم تعكير صفو طبقة الخلايا وحيدة النواة أدناه.
  7. باستخدام ماصة معقمة، وجمع طبقة الخلايا وحيدة النواة (معطف الشهباء) والمكان الى العقيمة 50 مل أنبوب مخروطي منفصل.
  8. إضافة برنامج تلفزيوني للتعليق الخلية إلى حجم 50 مل. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة عند 20 درجة مئوية مع الفرامل.
  9. إزالة طاف و resuspend الخلايا مكعبات في 10 مل من برنامج تلفزيوني. عد الخلايا وتحديد الجدوى باستخدام عدادة الكريات أو آلية مكافحة الخلايا.
  10. Resuspend الخلايا في 10 7 خلية / مل ومكان على الجليد حتى جاهزة لمزيد من المعالجة.

2. تلطيخ الخلايا

  1. إزالة 1-2 × 10 6 خلايا لكل تعويض مضان / تحكم FMO المطلوبة، إن وجدت. تبقى الطرد المركزي الخلايا في 400 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية مع الفرامل.
  2. Resuspend الخلايا في العقيمة التي تمت تصفيتها، عازلة الباردة FACS (PBS + 1٪ زلال المصل البقري (BSA) + 0.01٪ أزيد الصوديوم) في 3-6 × 10 7 خلية / مل (إزالة في أنبوب 1.5 مل الطرد المركزي). تأكد من أن FACS العازلة بارد والحفاظ على الجليد في جميع أنحاء الداخلي تلطيخ.
    1. تقسيم السكان الخلية إلى أرباع (م) عند تحسين الفحص. استخدام جزء من ألف إلى إثراء خلايا B-مستضد معين من الفائدة، واستخدام الكسور B و C لتحديد خصوصية تخصيب / تلطيخ (انظر 2.5 و 2.6 أدناه)، واستخدام جزء D لتحديد وتيرة وعدد الخلايا مستضد معين في السكان غير المخصب لتمكين حساب العائد وأمثالها اليورانيوم.
  3. إضافة FcγR الإنسان عرقلة إعادةوكيل لكسور م على الجليد لمنع ملزم من الأجسام المضادة لمستقبلات لكرة القدم.
    ملاحظة: اتبع تعليمات الشركة الصانعة للظروف ملائمة.
  4. إضافة الأجسام المضادة تألقي مترافق إلى الخلية المستضدات السطحية التي تهم كسور م لمدة 30 دقيقة على الجليد في الظلام، والحرص على عدم إدراج fluorochromes قد تعبر تتفاعل مع الأجسام المضادة صبغ مكافحة بعيدا الحمراء الفلورسنت بالإضافة إلى الجسيمات النانوية المغناطيسية.
    ملاحظة: وتشمل تقارن الأجسام المضادة لتقترب من الأشعة تحت الحمراء صبغة الفلورسنت، Cy5، Cy5.5، وCy7. وينبغي لأي بقع الجدوى التي تمت إضافتها تكون متوافقة مع استخدام مثبت. إذا لم يقصد لتحليل الخلايا باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية، ولكن تحديد وتيرة إفراز الأجسام المضادة، على سبيل المثال، من خلال ELISPOT، وتلطيخ السطح مع الأجسام المضادة غير ضروري.
  5. لاختبار خصوصية للمقايسة، احتضان جزء (ب) مع كمية كافية من المستضد الخالي من الملصقات لمدة 30 دقيقة على الجليد، مثل أن غالبية المستقبلات مع تقارب على الأقليتم حظر 10 -6 م.
    ملاحظة: عادة، وتركيز بداية جيدة هو 50-100 تتجاوز أضعاف كمية المستضد تعتبر كافية في 2.6 أدناه (على سبيل المثال 50-100 ميكرون). وهذا ينبغي منع أي الخلايا البائية مع قابلية عالية للمستضد الخالي من الملصقات لربط مستضد المعقدة البيروكسيديز، والذي يضاف في الخطوة 2.6 أدناه، مما يسمح لتأكيد خصوصية الخلايا المخصب. يمكن أن تكتمل هذه الخطوة بالتزامن مع خطوة 2.4 أعلاه.
  6. إضافة مستضد المعقدة البيروكسيديز إلى الكسور A، B، و D. احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: تركيز المستضد المعقدة البيروكسيديز يجب معاير لتحديد القيمة المثلى اللازمة لضمان الكشف الكافي وفصل ملزمة الخلايا من الخلايا المارة غير محددة. عادة ما يكون تركيز انطلاق جيدة لاختبار 1-5 ميكرومتر.
    ملاحظة: للحصول على الكسور A و D، هذه الخطوة يمكن أن يتم بالتزامن مع خطوة 2.4 أعلاه. لكسر B، يجب أن تتم هذه الخطوة بعد الخطوة 2.5 (الغسيل في betwخطوات التابعين غير ضرورية).
  7. حذف مستضد المعقدة البيروكسيديز من الكسر C من أجل تحديد أي ربط الخلايا البائية إلى الكواشف الأخرى في البروتوكول، مثل streptavidin- صبغ بعيدة الحمراء الفلورسنت وحبات مغناطيسية.
  8. غسل الخلايا مرتين من قبل تعليق من الخلايا في 1 مل من العازلة FACS الباردة في 5 × 10 7 خلايا والطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  9. بعد غسل النهائي، وتمييع تعليق خلية تتركز في 1 مل 2٪ الفورمالديهايد في 5 × 10 7 خلايا وترك الجلوس في الظلام على الجليد لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: التثبيت من الخلايا في هذه المرحلة يضمن أن مستضد المعقدة البيروكسيديز لا تزال ملزمة لBCR للمدة المتبقية من هذا الإجراء. لخلايا قابلة للحياة - لتحليل المصب، كما هو الحال في ELISPOTs أو نقل بالتبني، حذف الخطوة التثبيت.
  10. غسل الخلايا مرتين مع 1 مل من العازلة FACS الباردة في 5 × 10 7 خلايا وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. resuspend في 1 مل FACS الباردة العازلة في 5 × 107 خلايا.
  11. إضافة صبغة 1-2 ميكروغرام streptavidin بعيدة الحمراء الفلورسنت / مل واحتضان على الجليد لمدة 20 دقيقة في الظلام. عاير كمية streptavidin لكل تطبيق.
  12. غسل الخلايا مرتين مع 1 مل العازلة FACS الباردة في 5 × 10 7 خلايا وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. اكتمال إعداد جزء D في هذه المرحلة لأنها لن تخضع لتخصيب باستخدام حبات مغناطيسية.
    ملاحظة: سيتم استخدام هذا النموذج لتحديد وتيرة وعدد الخلايا مستضد معين B في العينة. وسوف تستخدم هذه لتحديد العائد واضعاف التخصيب بحلول تخصيب تحقيقه.

3. المغناطيسي التخصيب القائم على جسيمات متناهية الصغر

  1. Resuspend الخلايا من عينات AC في 1 مل من العازلة الباردة فصل (PBS + 0.5٪ BSA + 2mm و EDTA) في 5 × 10 7 خلايا ويمر عبر فلتر 40 ميكرون للقضاء على أي كتل التي يمكن أن تسد العمود.
  2. إضافة مكافحة Cy5 / نظام مضاد للبعيدا الحمراء الفلورسنت النانوية صبغ. فوص أفضل النتائج، ينبغي معاير تركيز الجسيمات النانوية لكل استخدام، ولكن نقطة انطلاق جيدة 50 تعليق ميكرولتر لكل 5 × 10 7 خلية / مل. تدوير في الظلام في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  3. يغسل مرتين مع 1 مل العازلة الفصل البارد في 400 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. Resuspend الخلايا في 1 مل من العازلة الفصل البارد في 5 × 10 7 الخلايا.

4. إثراء المغناطيسي عن طريق LS أو أعمدة LD

  1. وضع ثلاثة ليرة سورية أو الأعمدة LD في المجال المغناطيسي للفاصل المغناطيسي وإضافة 3 مل من العازلة الفصل الرطب الأعمدة (انظر وصف المنتج لتحديد أي نوع من العمود هو الانسب). السماح لجميع 3 مل لتمرير من خلال عمود وتجاهل بعد جمع.
    ملاحظة: على الرغم من أن فصل الخلايا جسيمات متناهية الصغر المسمى المغناطيسية يمكن إنجازه باستخدام أي من أجهزة الفصل المغناطيسية المتوفرة تجاريا، تمت زيارتها المختبر أكثر نجاحا مع استخدام الأعمدة ليرة سورية، في الشركة المصرية للاتصالاتالتربيعي من العائد، والنقاء، وكفاءة تخصيب اليورانيوم.
  2. ضع الأنابيب الثلاثة 15 مل المخروطية المسمى "جزء A / (B) / (C) سلبي"، على الخلايا المحددة سلبا، تحت العمود. إضافة الجسيمات المغناطيسية الخلايا المسمى إلى العمود كل منهما وتسمح وحدة التخزين بالكامل بالمرور.
  3. إضافة 3 مل من العازلة الفصل البارد على القمة، ونسمح لهذا أن تمر عبر عمود ونكرر مع 2 مل. جمع الخلايا المحددة سلبا ويوضع جانبا على الجليد.
  4. إزالة عمود من الحقل المغناطيسي للأرض ووضع على رأس أنبوب مخروطي 15 مل المسمى "جزء A / (B) / (C) الإيجابي"، لالخلايا المحددة بشكل إيجابي.
  5. ملء العمود إلى أعلى مع ما يقرب من 6 مل من العازلة الفصل وعلى الفور يغرق هذا الصوت من خلال العمود لجمع الخلايا التي كانت متجهة إلى المجال المغناطيسي باستخدام المكبس المقدمة.
  6. لزيادة نقاء، الخلايا المحددة بشكل إيجابي يمكن زيادة إثراء باستخدام عمود نظيفة في الثانية، وتكرار صناعة تجDURE.
  7. تدور كل من الكسور مختارة سلبا وإيجابا في 400 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية، ووقف في الحجم النهائي المطلوب. المضي قدما في تحليل المصب، مثل نظام مراقبة الأصول الميدانية، ELISPOT أو نقل بالتبني.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحليل النقاء، والغلة، وأضعاف لتخصيب باستخدام التدفق الخلوي

السكان المخصب على النحو المبين أعلاه تتضمن حتما تلويث الخلايا التي ليست ملزمة صبغ streptavidin- بعيدة الحمراء الفلورسنت لكن محاصرون في المصفوفة. ويمكن إزالة هذه الشوائب من السكان المخصب بنسبة FACS الفرز. لتقدير نقاء السكان المخصب، بوابة على الخلايا الحية على أساس الأمام والجانب مبعثر و / أو ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن هنا تصف طريقة رواية لتحقيق العزلة والإثراء من خلايا B-ملزمة مستضد من الدم المحيطي البشري. طريقة قابلة للتطبيق بسهولة على الفئران والأنسجة الأخرى، مثل الطحال والغدد الليمفاوية، ومتوافق مع تحليل آخر لتخصيب النمط الظاهري خلية وظيفة (مخطوطة قيد الإعداد).

يجب أن يكون المستخدم مدركا لعدد من المتغيرات التي يمكن أن تؤثر على نجاح هذا الإجراء. من تجربة تميل الخلايا الميتة التمسك حبات مغناطيسية و"تولي" الأصباغ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل بمنح من JDRF (1-2008-994 ، 27-2012-450) والمعاهد الوطنية للصحة (R01DK096492-05 و R21AI124488-01 و T32OD012201 و F30OD021477).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مستضد متغير الاهتمامعلى الأقل 100 مو ؛ ز للبيوتينيلات بسهولة ؛ إذا كنت تستخدم البروتين ، فحاول استخدام البروتين الذي تم التحقق من صحته بواسطة ELISA. يجب أن يكون الناقل  خال من البروتين.
البيوتين لوضع العلامات ؛ <م > على سبيل المثال < / م > EZ link Sulfo-NHS-LC-BiotinThermo Scientific21335يتوفر البيوتين في تركيبات مختلفة ، مثل تلك التي تحتوي على فواصل طول مختلفة ، لذلك يجب تحديد النوع المستخدم من قبل الباحث
Streptavidin-Alexa Fluor 647InvitrogenS21374يمكن الحصول عليها من موردين آخرين.
Anti-Cy5 / Anti-Alexa Fluor 647 MicrobeadsMiltenyi Biotech130-091-395
LS ColumnsMiltenyi Biotech130-042-401
MACS فواصل يدويةMiltenyi Biotechمتغير
فورمالديهايدتمييع إلى 2٪ مع PBS ؛ اختياري إذا كان الفحص المصب يتطلب خلايا حية
PBS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم
Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare17-1440-02
دم كامل في أنابيب تجميع هيبارين عازلة
FACS (PBS + 1٪ BSA + 0.01٪ أزيد الصوديوم) عازلة
فصل (PBS + 0.5٪ BSA + 2 ملي EDTA) 50
مل أنابيب
الشكل 15 مل أنابيب مخروطية
1.5 مل أنابيب Eppendorf الأجسام
المضادة التفاعلية لعلامة السطح ، Fc Block ، بقعة تمييزية حية / ميتة ، إذا لزم الأمر
إمدادات ELISPOT ، إذا لزم الأمر
متغير مخروطية الشكل

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. de Wildt, R. M., et al. A new method for the analysis and production of monoclonal antibody fragments originating from single human B cells. J Immunol Methods. 207 (1), 61-67 (1997).
  2. Edelman, G. M., Rutishauser, U., Millette, C. F. Cell fractionation and arrangement on fibers, beads, and surfaces. Proc Natl Acad Sci U S A. 68 (9), 2153-2157 (1971).
  3. Haas, W., Schrader, J. W., Szenberg, A. A new, simple method for the preparation of lymphocytes bearing specific receptors. Eur J Immunol. 4 (8), 565-570 (1974).
  4. Kenny, J. J., Merrill, J. E., Ashman, R. F. A two-step centrifugation procedure for the purification of sheep erythrocyte antigen-binding cells. J Immunol. 120 (4), 1233-1239 (1978).
  5. Snow, E. C., Vitetta, E. S., Uhr, J. W. Activation of antigen-enriched b cells. I. Purification and response to thymus-independent antigens. J Immunol. 130 (2), 607-613 (1983).
  6. Egeland, T., Hovdenes, A., Lea, T. Positive selection of antigen-specific B lymphocytes by means of immunomagnetic particles. Scand J Immunol. 27 (4), 439-444 (1988).
  7. Smith, M. J., et al. Loss of anergic B cells in prediabetic and new-onset type 1 diabetic patients. Diabetes. 64 (5), 1703-1712 (2015).
  8. Hulbert, C., Riseili, B., Rojas, M., Thomas, J. W. B cell specificity contributes to the outcome of diabetes in nonobese diabetic mice. J Immunol. 167 (10), 5535-5538 (2001).
  9. Woda, M., Mathew, A. Fluorescently labeled dengue viruses as probes to identify antigen-specific memory B cells by multiparametric flow cytometry. J Immunol Methods. 416, 167-177 (2015).
  10. Nair, N., et al. Optimized fluorescent labeling to identify memory B cells specific for Neisseria meningitidis serogroup B vaccine antigens ex vivo. Immun Inflamm Dis. 1 (1), 3-13 (2013).
  11. Amanna, I. J., Slifka, M. K. Quantitation of rare memory B cell populations by two independent and complementary approaches. Journal of immunological methods. 317 (1-2), 175-185 (2006).
  12. Scheid, J. F., et al. A method for identification of HIV gp140 binding memory B cells in human blood. Journal of immunological methods. 343 (2), 65-67 (2009).
  13. Doucett, V. P., et al. Enumeration and characterization of virus-specific B cells by multicolor flow cytometry. Journal of immunological methods. 303 (1-2), 40-52 (2005).
  14. Malkiel, S., et al. Checkpoints for Autoreactive B Cells in Peripheral Blood of Lupus Patients Assessed By Flow Cytometry. Arthritis Rheumatol. , (2016).
  15. Pape, K. A., Taylor, J. J., Maul, R. W., Gearhart, P. J., Jenkins, M. K. Different B cell populations mediate early and late memory during an endogenous immune response. Science. 331 (6021), 1203-1207 (2011).
  16. Abts, H., Emmerich, M., Miltenyi, S., Radbruch, A., Tesch, H. CD20 positive human B lymphocytes separated with the magnetic cell sorter (MACS) can be induced to proliferation and antibody secretion in vitro. Journal of immunological methods. 125 (1-2), 19-28 (1989).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Fcgamma

مقالات ذات صلة