وصف هنا هو وسيلة لإنتاج السيتوكينات الخارجية في الطعم أجنبي المستمدة المريض (بدكس) الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق الأسبوعي للخلايا الخلوية ترانزدوسد خط الخلايا. هذا الأسلوب يوسع فائدة بدكس ويوفر خيار عابرة أو متواصلة تسليم السيتوكينات الخارجية في العديد من النماذج بدكس.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التعبير عن سايتوكين خارجي في زينوغرافتس المشتقة من المريض عن طريق الحقن مع خط الخلايا ستتروكين ترانسدوسد انسجة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يتم إنتاج طعم أجنبي المستمدة المريض (بدكس) الفئران عن طريق زرع الخلايا البشرية إلى الفئران المناعية ناقصة. هذه النماذج هي أداة هامة لدراسة آليات الدم و الخبيث الطبيعي و هي المعيار الذهبي لتحديد العلاج الكيميائي الفعال لكثير من الأورام الخبيثة. نماذج بدكس ممكنة لأن العديد من السيتوكينات الماوس تعمل أيضا على الخلايا البشرية. ومع ذلك، هذا ليس هو الحال بالنسبة لجميع السيتوكينات، بما في ذلك العديد التي تعتبر حاسمة لدراسة تكون الدم الطبيعي والخبيث في الخلايا البشرية. التقنيات التي مهندس الفئران لإنتاج السيتوكينات البشرية (المعدلة وراثيا وتدق في نماذج) تتطلب نفقات كبيرة قبل فائدة من هذا النموذج وقد ثبت. تقنيات أخرى هي كثيفة العمالة (حقن السيتوكين المؤتلف أو العدوى) وفي بعض الحالات تتطلب مستويات عالية من الخبرة التقنية (حقن هيدروديناميكي من الحمض النووي). ويصف هذا التقرير طريقة بسيطة لتوليد الفئران بدكس التي لها سيان الإنسان الخارجيةتوكين (تسلب، الليمفاوية اللحمية الغدة الصعترية) عن طريق الحقن داخل الصفاق الأسبوعي من سدى التي تم ترانزدوسد إلى أوفيركسريس هذا السيتوكين. استخدام هذا الأسلوب يوفر في الجسم الحي مصدر إنتاج السيتوكينات المستمر الذي يحقق مستويات فسيولوجية تعميم السيتوكين الإنسان في الماوس. مستويات البلازما من السيتوكينات البشرية يمكن أن تختلف على أساس عدد من الخلايا اللحمية حقن، ويمكن البدء في إنتاج السيتوكينات في أي نقطة في التجربة. وتشمل هذه الطريقة أيضا سيتوكين سلبية الفئران السيطرة التي تنتج بالمثل، ولكن من خلال الحقن داخل الصفاق من سدى ترانزدوسد مع ناقلات التحكم. لقد أثبتنا سابقا أن خلايا اللوكيميا التي تحصد من تسلب معربا عن بدكس، بالمقارنة مع بدكس السيطرة، يحمل نمط التعبير الجيني أشبه عينة المريض الأصلي. معا تنتج السيتوكين والفئران بدكس السيتوكين السلبية التي تنتجها هذه الطريقة توفير نظام نموذج التي استخدمناها بنجاح لدراسةدور تسلب في تكون الدم الطبيعي والخبيث.
المقدمة
زينوغرافتس المشتقة من المريض (بدكس) هي قوية في نموذج الجسم الحي لدراسة إنتاج الخلايا المكونة للدم والخبيثة في بيئة الثدييات "الأم". في معظم الأحيان، يتم إنتاج بدكس عن طريق حقن أو زرع الخلايا البشرية في الفئران المناعية نقص المناعة. إنتاج بدكس باستخدام الخلايا الجذعية البشرية المكونة للدم يسمح في الدراسات المجراة من الدم البشري العادي وتطوير الخلايا المناعية. بدكس تنتج من سرطان الدم أو الخلايا السرطانية الأخرى تجعل من الممكن لدراسة الآليات الجينية وتحديد العلاجات الفعالة في سياق مجموعة من المناظر الطبيعية والطفرات الوراثية الموجودة في السكان. 1 ونتيجة لذلك، بدكس هي المع....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
أجريت الدراسات وفقا ل لوما ليندا الجامعة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام اللجنة (إاكوك) ومجلس المراجعة المؤسسية (إيرب) وافق البروتوكولات وفقا لجميع المبادئ التوجيهية الاتحادية.
تنبيه: يجب التعامل مع بدكس والأنسجة البشرية وفقا لإجراءات السلامة لمنع انتقال مسببات الأمراض التي تنتقل عن طريق الدم.
1. الثقافة والتوسع من الخلايا الخلوية ترانزدوسد سترومال
ملاحظة: في كل مرة سدى ستروما، حصاد طاف الثقافة (1 مل قسامة) وتخزينها في -....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويظهر الشكل 1 نظرة عامة على النموذج. مرة واحدة وقد تم الحصول على السيتوكينات المنتجة (تسلب + سدى) والسيطرة سدى تم توسيعها في الثقافة. قبل حقن سدى في الفئران، يتم تقييم طاف الخلايا اللحمية من قبل إليسا للتحقق من إنتاج السيتوكينات ( الشكل 2 ) ويستخدم قياس التدفق الخلوي الفوسفو (بروتوكول رقم 3) للتحقق من نشاط السيتوكين التي تنتجها سدى. يتم جمع طاف من الثقافات الخلايا اللحمية متموجة (سدى السيطرة و تسلب + سدى) عندما يتم.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تصف هذه المخطوطة طريقة بسيطة وسريعة وفعالة نسبيا من حيث التكلفة للهندسة بدكس للتعبير عن السيتوكين البشري الخارجي. وتستند الاستراتيجية الموصوفة هنا على الحقن داخل الصفاق الأسبوعي من خط الخلايا اللحمية ترانزدوسد للتعبير عن السيتوكين البشري، تسلب. قبل تنفيذ الطرق الموصوفة هنا، تم إنشاء سدى مصممة للتعبير عن مستويات عالية من السيتوكين من الفائدة (تسلب) و سدى تحكم مماثلة هندسيا. في البروتوكولات المعروضة هنا، يتم توسيع سدى في الثقافة وفحصها للقدرة على توفير مستقرة، وارتفاع مستوى إنتاج ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل NIH R21CA162259 و NIH R01CA209829 و NIH P20 MD006988 و NIH 2R25 GM060507 و Hyundai Hope on Wheels Scholar Hope Grant ، وقسم علم الأمراض والتشريح البشري ، وقسم العلوم الأساسية ، ومركز التفاوتات الصحية والطب الجزيئي في كلية الطب بجامعة لوما ليندا ومن خلال منحة لتعزيز البحوث التعاونية والانتقالية من جامعة لوما ليندا (KJP). المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوية>كواشف المختبر الرطبة < / قوي > | |||
| T-25 Nunc زراعة الخلايا المعالجة EasYFlasks ، سعة 7 مل ، ؛ 25 سم & sup2 منطقة الثقافة | الحرارية العلمية / فيشر | 156367 | |
| T-75 قارورة معالجة لثقافة أنسجة الصقر ، سعة 250 مل ، 75 سم & sup2 منطقة الثقافة وغطاء التهوية | Corning Inc. / Fisher | 353136 | |
| T-150 قارورة معالجة لثقافة الأنسجة الصقر ، سعة 600 مل ، 150 سم & sup2 ؛ منطقة الثقافة و غطاء تهوية | Corning Inc. / Fisher | 355001 | |
| 10 مل ماصات مصلية | Falcon | 357551 | |
| 15 مل & nbsp أنابيب مخروطية من مادة البولي بروبلين | فيشر | 05-539-12 | |
| 5 مل أنابيب البوليسترين المستديرة القاع Falcon | 352054 | ||
| 50 مل أنابيب مخروطية من مادة البولي بروبيلين | Falcon | 352098 | |
| 2.0 مل قوارير مبردة، خارجيا الخيوط | Corning Inc. / فيشر | 4230659 | |
| 1 مل نصائح ماصة | فيشر | 2707509 | |
| 200 مو ؛ أطراف ماصة L | دينفيل العلمي | P3020-CPS | |
| 10 & mu ؛ L نصائح ماصة | Denville Scientific | P-1096-CP | |
| وحدات تصفية معقمة يمكن التخلص منها مع غشاء SFCA ، Nalgene Rapid-Flow | Fisher | 09-740-28D | |
| 2 NH2< sub>SO4 < / sub> | BioLegend | 423001 | |
| Dulbecco' s محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) بدون كالسيوم والمغنيسيوم ، 1 & مرات ؛ | Corning cellgro / Mediatech | 21-031-CV | |
| Human TSLP ELISA Max Deluxe Set | BioLegend | 434204 | |
| 3٪ حمض الخليك مع | تقنيات الخلايا الجذعية | الميثيلين 7060 | |
| Trypan Blue & nbsp ؛ | كورنينج | 25-900-Cl | |
| "Trypsin" 1x 0.25٪ Trypsin 2.21 mM EDTA في HBSS | ThermoFisher | 25-053 | |
| TWEEN 20 BioXtra | Sigma-Aldrich | P-7949 | |
| " R10 " وسط زراعة الخلية ، ٪ من الحجم الكلي (يجعل 565 مل) < / قوي > | < قوي > - < / قوي > | < قوي > وصفة مختبر < / قوي > | |
| RPMI ، 88.5٪ (500 مل) ؛ | ميدياتك | 10-040-CV | |
| FBS ، 9.9٪ (56 مل) | Mediatech | 35-011-CV | |
| L-Glutamine ، 0.99٪ (5.6 مل) ؛ | ميدياتك | 25-005-Cl | |
| بنسلين ستربتومايسين ، 0.50٪ (2.8 مل) ؛ | Mediatech | 30-002-Cl | |
| 2-Mercaptoethanol ، 0.10٪ (560 & micro; L) | النائب | 190242 | |
| <قوي>" R20 " وسط زراعة الخلية ، ٪ من الحجم الكلي (يجعل 195 مل) < / قوي > | - | <قوي > وصفة مختبر < / قوي > | |
| ؛ RPMI, 76.84٪ (150 mL) | انظر أعلاه | انظر أعلاه | |
| FBS ، 20.49٪ (40 مل) | انظر أعلاه | انظر أعلاه | |
| 2 ملي مولار L-glutamine ، 1.02٪ (2 مل) | انظر أعلاه | انظر أعلاه | |
| ؛ 1 ملي مولار بيروفات الصوديوم ، 1.02٪ (2 مل) | انظر أعلاه | انظر أعلاه | |
| ؛ البنسلين الستربتومايسين, 0.51٪ (1 مل) | انظر أعلاه | انظر أعلاه | |
| 2-ميركابتو إيثانول ، 0.10٪ (0.1 م) ، ؛ 0.10٪ (200 & micro; L) | انظر أعلاه | انظر أعلاه | |
| <قوي>" وسط التجميد "، ٪ من الحجم الكلي < / قوي > | < | قوي > - < / قوي > | <قوي >وصفة مختبر < / قوي> |
| " R10 " متوسطة ، 45٪ | انظر وصفة "R10 | " - | |
| FBS ، 20٪ | انظر أعلاه | 35-011-CV | |
| DMSO ، 10٪ | Corning | 25-950-CQC | |
| D (-) (+) - ثنائي هيدرات تريهالوز ، 5٪ | فيشر Scientific | BP2687-100 | |
| Name< / strong> | Company< / strong> | Catolog Number< / strong> | Comments |
| Biologics < / قوي> " | |||
| HS-27" HS-27A خط السدى البشري | ATCC | CRL-2496 | |
| "CALL-4" MHH-CALL-4 خط الخلية ، سلائف الدم للخلايا البائية البشرية | DSMZ | ACC 337 | |
| " فئران NSG " موافقه. Cg-Prkdcscid< / sup> Il2rgtm1Wjl/SzJ, ذكر أو أنثى, العمر 6 & ndash; 8 أسابيع | JAX الفئران | # 005557 | |
| خط خلية MUTZ-5 ، سلائف الدم للخلايا البائية البشرية | DSMZ | ACC 490 | |
| بروتين TSLP البشري | المؤتلف R & D Systems | 1398-TS-010 | |
| Name | Company | Catolog Number | Comments |
| Flow cytomery الأجسام المضادة (استنساخ) * < / قوي> | |||
| مضاد للفأر CD45 FITC (30F11) | Miltenyi Biotec | 130-102-778 | |
| CD127 PE (MB15-18C9) (الاسم البديل هو IL-7R α) | Miltenyi Biotec | 130-098-094 | |
| CD34 APC (8G12) BD | Biosciences | 340667 | |
| CD45 PE-Cy7 (مرحبا 30) | eBioscience | 25-0459 | |
| "FVD" صبغة جدوى قابلة للإصلاح eFluor 780 | eBioscience | 65-0865 | |
| Ig & kappa; سلسلة خفيفة FITC (مجموعة 20-193) | BD Pharmingen | 555791 | |
| Ig & lambda ؛ سلسلة خفيفة FITC (JDC-12) BD | Pharmingen | 561379 | |
| IgD PE (IA6-2) BioLegend | 348203 | ||
| IgM PE-Cy5 (G20-127) BD | Biosciences | 551079 | |
| pSTAT5 PE ، & nbsp ؛ ماوس مضاد ل STAT5 (pY694) BD | PhosphoFlow | 612567 | |
| Name< / قوي> | company | Catolog Number | Comments |
| مواد ومعدات أخرى < / قوي> | |||
| القابل للزرع نانو المستجيب مع Canula | Trovan | ID-100B (1.25) | |
| كريم مخدر EMLA lidocaine (الحصول عليه عن طريق الترسيب من خلال مرفق رعاية) | الوصف | ||
| & frac12 ؛ cc LO-DOSE U-100 حقنة الأنسولين 28G & frac12 ؛ | BD | # 329461 | |
| BD أنابيب Microtainer مع K2< / sub>EDTA | BD & nbsp ؛ | #365974 | |
| جهاز طرد مركزي | بيكمان كولتر | أليجرا X-15R | |
| أنابيب شعرية من FisherBrand (هيبارينية) | فيشر ساينتفيك | 22-260-950 | |
| مقياس الدم | Fisher | 02-671-6 | |
| MACuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
| Mouse Pie Cage | Braintree Scientific، Inc. | MPC-1 | |
| ماوس الذيل مضيئة التقييد | Braintree Scientific، Inc. | MTI STD | |
| مسدس قبضة الزرع | تروفان | IM-300 (1.25) | |
| ومايكرو ؛ Quant | Bio-Tek Instruments Inc. | MQX200 | |
| FlowJo برنامج تحليل قياس التدفق | الخلوي FlowJo، LLC | الإصدار 10 | |
| * جميع الأجسام المضادة مضادة للإنسان ما لم ينص على خلاف ذلك. |
المراجع
- Francis, O. L., Milford, T. A., Beldiman, C., Payne, K. J. Fine-tuning patient-derived xenograft models for precision medicine approaches in leukemia. J Investig Med. 64 (3), 740-744 (2016).
- Parrish, Y. K., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
