تم وصف إجراء قياس مرجعي للقياس الكمي المطلق ل Aβ1-42 في السائل الدماغي النخاعي البشري بناء على استخراج الطور الصلب وقياس الطيف الكتلي الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
مرض الزهايمر (AD) هو أكثر الأمراض التنكسية العصبية شيوعا بين كبار السن ويمثل 60-80٪ من جميع حالات الخرف. حاليا ، يعتمد تشخيص مرض الزهايمر على الاختبارات المعرفية وفحوصات الحالة العقلية ، ولكن الببتيد أميلويد بيتا (Aβ) في السائل الدماغي النخاعي (CSF) يستخدم بشكل متزايد في التجارب السريرية والإعدادات السريرية. بالنسبة لمعظم المؤشرات الحيوية للبروتين والببتيد ، يتم إجراء القياس الكمي باستخدام تقنيات قائمة على الأجسام المضادة ، مثل مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA). ومع ذلك ، فإن التباين داخل المختبر وفيما بينه في هذه المقايسات يعيق استخدامه كعلامة تشخيصية في الروتين السريري. < p class = 'jove_content'> تم تطوير إجراء قياس مرجعي مستقل عن الأجسام المضادة (RMP) بناء على استخراج الطور الصلب (SPE) والكروماتوغرافيا السائلة (LC) - قياس الطيف الكتلي الترادفي (MS / MS) ، حيث تم استخدام ببتيدات Aβ المستقرة المسماة بالنظائر كمعايير داخلية ، مما يتيح القياس الكمي المطلق. تم استخدام أداة هجينة عالية الدقة رباعية الأقطاب المدارية للقياسات. تسمح الطريقة بالقياس الكمي للنخاعي النخاعي Aβ1-42 بين 150-4,000 بيكوغرام / مل.
المقدمة
مرض الزهايمر (م) هو الشكل الأكثر شيوعا من الخرف ويصيب حوالي 35 مليون شخص في جميع أنحاء العالم 1. بصمات عصبية مرضية من مرض يعتقد على نطاق واسع تكمن في جوهر م المرضية هي التشابك الليفي العصبي بين الخلايا من hyperphosphorylated بروتين تاو 2 ولويحات خارج الخلية التي تتكون من (Aβ) الببتيد 3 المجمعة اميلويد بيتا. وتماشيا مع هذا، وقد تم مؤخرا شملت تقييم أمراض الترسبات في الجسم الحي من المؤشرات الحيوية في المعايير البحوث التشخيصية لمدة 4 م. لقياس السائل النخاعي من Aβ 1-42، هي عدة المناعية المتاحة وتستخدم في العديد من المخ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: هذا البروتوكول يتطلب قسامات لا يقل عن 50 ميكرولتر، مع تركيز 50 ميكروغرام / مل لكل الببتيد Aβ، في بدء المواد. يجب حل الببتيد Aβ في 20٪ الأسيتونتريل (إيه سي) و 4٪ محلول الأمونيا المركزة في الماء منزوع الأيونات (ت / ت) وتخزينها في 80 درجة مئوية.
تحذير: انظر الجدول رقم 1 لمعلومات السلامة.
1. إعداد حلول
- إعداد 100 مل من 20٪ إيه سي و 4٪ محلول الأمونيا المركزة في الماء منزوع الأيونات (ت....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يتم استخدام الإعداد لوحة في الشكل رقم 1 لوحة كاملة من العينات. إذا ليتم تحليلها أقل عينات غير معروفة، وتدريج الثاني، ينبغي أن توضع مجموعات الترددات اللاسلكية، ومراقبة الجودة بعد نهاية الشوط الأول من العينات غير معروف.
كما رأينا في الشكل 2، ومعايرة قريبة من خط الانحدار، مع الانحرافات المعيارية منخفضة. هذا الأس.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
للتعرف على طريقة وصفها، بدلا من استخدام مصفوفة البديلة، استخدمنا نهج بديل تحليلها 13، 14، 15، 16، والتي تمكن المعايرة في السائل النخاعي البشري. ينطوي على نهج تحليلها البديل مختلفين معايير المسمى isotopically. واحد (15 NAβ 142) يستخدم لتوليد منحنى المعايرة في السائل النخاعي البشري، في حين يتم استخدام (13 CAβ 142)
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
أبلغ JP و EP عن عدم الإفصاح. عمل HZ في المجالس الاستشارية لشركة Roche Diagnostics و Eli Lilly و Pharmasum Therapeutics. عمل KB كمستشار أو في المجالس الاستشارية لشركة Fujirebio Europe و IBL International و Roche Diagnostics. HZ و KB هما مؤسسان مشاركان لشركة Brain Biomarker Solutions في Gothenburg AB ، وهي شركة منصات مقرها GU Venture في جامعة جوتنبرغ.
شكر وتقدير
تم تنفيذ هذا العمل نيابة عن الاتحاد الدولي لمجموعة عمل الكيمياء السريرية حول بروتينات السائل الدماغي النخاعي ، والتي تحتوي على التركيبة التالية: Kaj Blennow (الرئيس) وهنريك زيتربيرج ، جامعة جوتنبرج ، السويد. ليس شو وماغدالينا كوريكا ، جامعة فيلادلفيا ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية. إنغريد زيجرز ، معهد المواد المرجعية والقياسات ، جيل ، بلجيكا. بيوتر ليتشوك ، جامعة إرلانغن ، ألمانيا ؛ وراند جينكينز ، مختبر التحليل الحيوي PPD ، ريتشموند ، فيرجينيا ، الولايات المتحدة الأمريكية. راندال بيتمان ، جامعة واشنطن ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية. و H Vanderstichele, Innogenetics NV, غنت, بلجيكا. كان هذا العمل أيضا جزءا من مجموعة عمل الأساليب المرجعية للاتحاد الع....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أنابيب الطرد المركزي الدقيقة Eppendorf Protein LoBind ، 0.5 مل | Eppendorf | 022431081 | |
| Eppendorf Protein LoBind ، 1.5 مل | الدقيقة Eppendorf | 022431081 | |
| Eppendorf Protein LoBind ، 2 مل | Eppendorf | 022431102 | |
| Eppendorf Protein LoBind أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، 5 مل | Eppendorf | 0030 108.310 | |
| Eppendorf Protein LoBind Deepwell Plates 96 | Eppendorf | 951032905 | |
| Micronic 0.75 مل أنابيب البولي بروبيلين ، | MPW32071BC3 الميكرونيك | المستخدمة لجمع مصافي SPE ، ولكن يمكن استخدام أجهزة تجميع أخرى مثل ألواح 96 بئرا. | |
| Micronic Split TPE Capcluster ل 96 ind. أنبوبا أغطية | MP53026 | ميكرونيك | لأنابيب ميكرونيك. |
| Micronic Loborack-96 أبيض ث غطاء عالي الغطاء | MPW51015BC3 ميكروني | مشفر لأنابيب الميكرونيك. | |
| نصائح Biohit Optifit 1.2 مل | Sartorius | 791210 | تستخدم للوصول إلى أسفل ألواح LoBind العميقة (96 بئر). قد تعمل النصائح الضيقة الأخرى أيضا. |
| واحة المياه MCX 96 جيدا & مياه لوحة Elution | 186001830BA | ||
| صينية خزان مشعب لوحة المياه | لوحة استخراج المياه | WAT058942 | |
| ألواح الواحة 96 بئر | المياه | 186001831 | |
| محلول هيدروكسيد الأمونيوم ، puriss. p.a. ، reag. ISO ، ريج. دكتوراه يورو ، ~ 25٪ NH3 أساس | سيجما ألدريتش | 30501-1L-D | |
| أسيتونيتريل ، درجة التدرج للأشعة فوق البنفسجية البعيدة HPLC ، 2.5 لتر | فيشر Scientific | A / 0627 / 17X | |
| حمض الفوسفوريك 85٪ ، ACS ، ISO ، ريج. Ph Eur | Merck Millipore | 1005731000 | |
| Guanidine Hydrochloride ، 500 جرام | Thermo Scientific | 24110 | |
| Thermo Scientific Q-exactive Hybrid Quadrupole Orbitrap مطياف الكتلة | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | مع Dionex Ultimate 3000 LC وجهاز أخذ العينات الآلي. |
| عمود Dionex ProSwift RP-4H Monolith (1.0 × 250 مم) | Dionex | 066640 | |
| ألبومين مصل البقر ، مسحوق مجفف بالتجميد ، مناسب ل (للبيولوجيا الجزيئية) ، | Sigma-Aldrich | B6917 | |
| Beta-Amyloid غير الأسيتيل (1-42) ، Ultra Pure ، TFA | rPeptide | A-1002-2 | |
| 15N بيتا أميلويد (1-42) ، مسمى بشكل موحد | rPeptide | A-1102-2 | |
| 13C بيتا أميلويد (1-42) ، | rPeptide | A-1106-2 | |
| ، TiMix 2 | Edmund B & uuml ؛ هلر | 6110 000 |
المراجع
- Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer's disease. N Engl J Med. 362 (4), 329-344 (2010).
- Braak, H., Braak, E. Evolution of the neuropathology of Alzheimer's disease. Acta Neurol Scand Suppl. 165, 3-12 (1996).
- Blennow, K., de Leon, M. J., Zetterberg, H. Alzheimer's disease. L....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
