مقالة منهجية

إعداد أنسجة المخ الرئيسيات غير البشرية لمرحلة ما قبل تضمين المناعية والمجهر الإلكتروني

DOI:

10.3791/55397

⸱

أبريل 3, 2017

 , 
1Centre de recherche de l'Institut universitaire en santé mentale de Québec, Department of Psychiatry and Neuroscience, Université Laval, 2Centre de recherche du CHU Sainte-Justine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، ونحن نقدم ل، منخفضة التكلفة سهلة، والوقت كفاءة بروتوكول لإصلاح أنسجة المخ كيميائيا الرئيسيات مع تثبيتي الأكرولين، مما يسمح للحفاظ على المدى الطويل والتي تتوافق مع ما قبل التضمين المناعية للانتقال المجهر الإلكتروني.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على الرغم من كل التقدم التكنولوجي على مستوى المجهر الضوئي، لا يزال المجهر الإلكتروني الأداة الوحيدة في علم الأعصاب لدراسة وتوصيف تفاصيل التركيبية والشكلية من الخلايا العصبية، مثل الاتصالات متشابك. حفظ جيد للأنسجة المخ لالمجهر الإلكتروني يمكن الحصول عليها عن طريق أساليب البرد تثبيت صارمة، ولكن هذه التقنيات مكلفة نوعا ما، والحد من استخدام immunolabeling، وهو أمر حاسم لفهم التواصل بين الأنظمة العصبية التي تم تحديدها. وقد تم تطوير طرق تجميد استبدال السماح للمزيج من البرد التثبيت مع immunolabeling. ومع ذلك، فإن استنساخ هذه المقاربات المنهجية عادة ما تعتمد على الأجهزة تجميد مكلفة. وعلاوة على ذلك، وتحقيق نتائج موثوقة مع هذه التقنية هو جدا تستغرق وقتا طويلا وتحدي المهارات. وبالتالي، فإن الدماغ ثابتة كيميائيا التقليدية، لا سيما مع تثبيتي الأكرولين، يبقى طريقة فعالة وقت ومنخفضة التكلفة للجمع بين الإلكترونالمجهر مع المناعية. هنا، ونحن نقدم بروتوكول تجريبي موثوق باستخدام تثبيت الأكرولين الكيميائي الذي يؤدي إلى الحفاظ على أنسجة المخ الرئيسيات ومتوافق مع ما قبل التضمين المناعية ونقل الإلكترون الفحص المجهري.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المجهر الضوئي، بما في ذلك متحد البؤر واثنين من الفوتون المجهري، وقد ثبت أن تكون أداة فعالة للدراسة في العمليات العصبية الجسم الحي، من بين أمور أخرى 1 و 2. على الرغم من أن القرار المكانية نموذجي على مستوى الضوء مجهرية (LM) ما يقرب من 200 نانومتر، والتقدم التكنولوجي الأخيرة باستخدام مصادر الضوء المختلفة، مثل الأشعة فوق البنفسجية المدقع وناعمة المجهر أشعة X، وأبرزها زيادة هذا القرار إلى ما يقرب من 10 القرار المكانية نانومتر 3 و 4 و 5. وتشمل التطورات التكنولوجية الأخرى في مجال التصوير الجمع بين التصوير بالرنين المغناطيسي مع الأنسجة وتوفر طريقة جديدة لقياس سمك غمد المايلين في الجسم الحي، والمعلمة التي كانت قابلة للقياس تقليديا فقط على مستوى الكترون مجهرية (EM) 6 و 7. Althouغ هذه التطورات على مستوى LM توفر أداة ممتازة لدراسة العمليات الحية، على عرض تفصيلي وتوصيف البنى، مثل الاتصالات متشابك، لا يمكن أن يتحقق إلا مع EM، الذي يقدم قرار يمكن أن تصل إلى 0.5 نانومتر. ومع ذلك، والمراقبة على مستوى EM تتطلب العينات أن القتلى وتغيير في بعض النواحي، مع المثبتات الكيميائية والعمليات الجفاف، من أجل الحفاظ على التهندس الخلوي. وهكذا، ودراسة العينات البيولوجية بدقة عالية يمكن أن يكون تحديا بسبب الأضرار الناجمة عن الإشعاع من شعاع الالكترون، وعلى النقيض منخفضة، والانحرافات الهيكلية من الأغشية، أو حتى وجود القطع الأثرية التي يمكن أن تحدث بعد الجفاف والايبوكسي تضمين 8 و 9 و 10.

الحفاظ على العينات في شكل الأصلي من أجل التحليل البنيوي لا يمكن أن يتحقق عن طريق استخدام "كرو EM الأقسام المزججة" أو CEMOVIS، نهج باجتزاء أنيشمل تجميد بسرعة وتضمينها العينة في الجليد الزجاجي، والنظر في أقسام تحت EM عند درجة حرارة المبردة 11 و 12. يسمح هذا الإجراء لفحص عينات حين أنها لا تزال صلبة والمائية بشكل كامل، وبالتالي القضاء على القطع الأثرية التي يسببها الجفاف العمليات 13. ومع ذلك، هذا الأسلوب ينطوي إضافية أجهزة لالبرد ultramicrotomy، وكذلك أجهزة إضافية على EM القياسية، وذلك للسماح هذه الملاحظة في درجات حرارة منخفضة جدا، والتي تولد تكاليف إضافية كبيرة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن النهج CEMOVIS يحول دون استخدام تقنيات immunolabeling، منذ الأجسام المضادة وعادة ما يكون لتكون المحتضنة في RT. بدلا من ذلك، فمن الممكن الجمع بين تحليل التركيبية للإجراءات المناعى باستخدام نهج تجميد الاستبدال، يتم خلالها إذابة العينات الثابتة البرد ببطء بينما غمر في المواد الكيميائية البرد واقية وهي عشرأون جزءا لا يتجزأ من راتنجات المتخصصة، مثل Lowicryls. بعد تضمين immunolabeling يمكن بعد ذلك أجريت على هذه المواد (12). ومع ذلك، وتقنيات تجميد الإحلال والبرد تثبيت هي مضيعة للوقت. فهي تتطلب تركيب معدات إضافية ولا تزال تتطلب عينات أن تتعرض لالمذيبات العضوية وتثبيتي الكيميائية التي يمكن أن تغير التهندس الخلوي، على الرغم من استخدام درجة حرارة منخفضة 14 و 15. وبالتالي، على الرغم من كل التقدم التكنولوجي سواء على مستوى LM وEM، تثبيت الكيميائي للأنسجة المخ، وخاصة مع الأكرولين، لا تزال منخفضة التكلفة وفعالة وقت طريقة للجمع بين المناعية مع EM 16.

في العقود الماضية، كانت هناك العديد من المحاولات لإيجاد مزيج من الألدهيدات التي توفر أفضل الحفاظ على الأنسجة. قبل 1960s، وكان مثبت الكيميائية الوحيدة التي أعطت نتائج مقبولة للEM رباعي أكسيد الأوزميوم. ومع ذلك، رباعي أكسيد الأوزميوم عالية السمية ومكلفة، مما يحول دون استخدامه من خلال نظام الأوعية الدموية لإصلاح أجهزة مثل الدماغ. وقدم الأكرولين في أواخر 1950s باعتبارها وسيلة يمكن الاعتماد عليها للحيوان الحفاظ على النسيج مناسبة للمراقبة EM الهياكل الخلوية (17). انها تخترق الأنسجة أكثر عمقا ويتفاعل بسرعة أكثر من الألدهيدات أخرى عندما تستخدم لتثبيت عن طريق الغمر ويسمح الحفاظ جيد للمكونات حشوية، مع انكماش الحد الأدنى من الأنسجة (17). مثل هذه الميزة تعطي الأكرولين تثبيت ميزة واضحة على الألدهيدات أخرى عند استخدامها في أنسجة جديدة، من خلال السماح لتوطين أكثر دقة من الذين يعيشون مركبات جزيئية، مثل الإنزيمات والبروتينات الأخرى 18. في الواقع، تم التحقق من صحة ذلك من خلال سنوات وسيلة سهلة وفعالة ومنخفضة التكلفة لتثبيت التصور على مستوى EM في كثير من الأنواع، بما في ذلك البرمائيات والقوارض، كما stabili بكفاءةZES الببتيدات والبروتينات، تحتفظ استضداد ويوفر التركيب الدقيق سليمة نسبيا عندما تستخدم بالاقتران مع ألدهيد آخر تثبيتي 16 و 18 و 19 و 20 و 21. بروتوكولات لتثبيت الأكرولين في القوارض ومنذ ذلك الحين تم توحيدها واستخدامها على نطاق واسع، لا سيما من قبل مجموعة بيكيل، لتنفيذ immunolabeling المزدوج لEM 16، 22. وقد استخدمت مجموعات قليلة الأكرولين التثبيت في الأنسجة غير البشرية الرئيسيات الدماغ 23. ومع ذلك، على حد علمنا، هناك واحد فقط بروتوكول المنشورة التي تصف كفاءة التثبيت الكيميائية مع الأكرولين في الرئيسيات غير البشرية التي تتوافق مع EM immunolabeling 24.

في هذه المقالة، ونحن نقدم وسيلة سهلة وموثوق بها لإصلاح بكفاءة كيميائيا غير همهمة،على العقول الرئيسيات مع الأكرولين، والسماح لحفظ يحتمل أن تكون طويلة الأجل جنبا إلى جنب مع ما قبل التضمين immunolabeling وEM نقل الفحص.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أخلاقيات الإعلان: تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التي تنطوي على الحيوانات من قبل COMITE دي حماية قصر Animaux DE L'جامعة لافال وقدمت وفقا للمجلس الكندي للرعاية الحيوان دليل لرعاية واستخدام حيوانات التجارب (إد 2). تم تحسين بروتوكول صفها هنا للحيوانات البالغة حوالي 800 غرام. ينبغي تعديل حجم تثبيتي وفقا لحجم الحيوان.

1. إعداد حلول لTranscardiac الإرواء

  1. إعداد 1 L من حل 50 ملي مخزنة فوسفات الصوديوم المالحة (PBS) وفقا للخطوات التالية. إعداد الحل في معظم 24 ساعة قبل التروية والحفاظ على 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
    1. قياس 800 مل من الماء المقطر في دورق 1 L. إضافة 5.87 غرام من ثنائي القاعدة فوسفات الصوديوم اللامائية (نا 2 هبو 4)، 1.20 غرام من أحادي فوسفات الصوديوم مونوهيدرات (ناه 2 PO 4 · H 2 O)، و 9 زمن كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم). يحرك المزيج حتى يذوب.
    2. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 بإضافة تدريجيا 5 N هيدروكسيد الصوديوم. إضافة الماء المقطر للوصول إلى الحجم الكلي لل1 L.
      تنبيه: هيدروكسيد الصوديوم هو مركب كيميائي للتآكل. ارتداء المناسبة معدات الوقاية الشخصية (PPE؛ معطف المختبر، والقفازات، نظارات واقية، الخ).
  2. إعداد 2 لتر من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) وفقا للخطوات التالية. هذا الحل يجب أن يكون مستعدا 24 على الأكثر ساعة قبل الجراحة والاحتفاظ بها في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
    1. قياس 1.5 لتر من الماء المقطر في دورق 2-L. إضافة 23.48 غرام من ثنائي القاعدة فوسفات الصوديوم اللامائية (نا 2 هبو 4) و4.80 غرام من أحادي فوسفات الصوديوم مونوهيدرات (ناه 2 PO 4 · H 2 O). يحرك المزيج حتى يذوب. إضافة الماء المقطر للوصول إلى الحجم الكلي لل2 L.
    2. الحرارة الحل تحت غطاء التنفيس حتى تصل درجة الحرارة الى ما يقرب من 45 - 55 درجة مئوية. لا تسخن إلى أكثر من 60 درجة مئوية.
    3. تدريجيا إضافة 80 غراما من PFA إلى حل ويحرك حتى يذوب تماما (حوالي 30-60 دقيقة). حافظ على مراقبة درجة الحرارة للحفاظ على أقل من 60 درجة مئوية.
      تنبيه: PFA متقلبة للغاية في شكل مسحوق لها. أنها شديدة السمية إذا كان في ملامسة العينين أو الجلد وغير الخطرة في حالة الاستنشاق أو الابتلاع. ارتداء معدات الوقاية الشخصية واستخدام بحذر تحت غطاء التنفيس.
    4. تبريد الحل وصولا الى 4 درجات مئوية والتصفية. تخزينها في 4 ° C.
  3. إعداد 1 L من 3٪ الأكرولين في 0.1 M الفوسفات العازلة (PB) وفقا للخطوات التالية. الحل PB ينبغي إعداد 24 على الأكثر ساعة قبل التروية.
    تنبيه: الأكرولين سامة للغاية إذا استنشق ويمكن ان تنتج الضرر المباشر. بل هو أيضا للتآكل وشديدة السمية إذا يمتص من خلال الجلد. ومن مسرطنة ومطفرة. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة واستخدام تحت غطاء التنفيس.
    1. قياس 800 مل من الماء المقطر. إضافة 8.66 غرام من ثنائي القاعدة فوسفات الصوديوم اللامائية (نا 2 HPO 4) و5.38 غرام من أحادي فوسفات الصوديوم مونوهيدرات (ناه 2 PO 4 · H 2 O). يحرك حتى تذوب جميع الأملاح. إضافة الماء المقطر للوصول إلى الحجم الكلي لل1 L. الحفاظ على الحل في 4 درجات مئوية.
    2. قبل الجراحة، ونقل 900 مل من محلول PB إلى وعاء زجاجي 1 L وإضافة 30.94 مل من 97٪ محلول الأكرولين تحت غطاء التنفيس. إضافة حل PB للوصول إلى الحجم الكلي لل1 L ويقلب. تصفية حل والاحتفاظ بها في 4 درجات مئوية.

2. Transcardiac الإرواء وتشريح الدماغ

  1. حافظ على الحلول على الجليد أثناء إجراء العمليات الجراحية بأكمله. تحضير المضخة عن طريق وضع أنبوب في الحل الأول لاستخدامها (PBS و 50 ملم) وتحول المضخة حتى لا يبقى الهواء في خرطوم. لنضح transcardiac من قرد المكاك، واستخدام 21 G إبرة وتعيين تدفق في حوالي 80 مل / دقيقة.
  2. تخدير الحيوانات مع الحقن العضلي من مزيجتلح الكيتامين (20 ملغ / كلغ)، زيلازين (4 ملغ / كلغ)، وآسيبرومازين (0.5 ملغ / كلغ). الحفاظ على الحيوانات تحت الأيزوفلورين (3٪) التخدير.
  3. إرفاق أطرافه الحيوان إلى جدول التنفيس.
  4. مع مشرط، وإزالة الجلد حتى الإبطين. قطع عضلات البطن. استخدام مقص جراحي الثقيلة لقطع أضلاعه أفقيا عن طريق تجنب بعناية الأعضاء الحيوية.
  5. قطع الحجاب الحاجز مع مقص جراحي ورفع القفص الصدري لكشف القلب. مرة واحدة يتم قطع الحجاب الحاجز، والمضي قدما بسرعة، لأن القلب سيتوقف الضرب في غضون دقائق.
  6. إزالة التامور بشفرة مشرط وادخال الإبرة في البطين الأيسر. مع مشرط، وجعل بعناية الختان صغير إلى الأذين الأيمن. البدء سريعا في مضخة في 72 مل / دقيقة، وعقد الإبرة في المكان. إذا كان ذلك ممكنا، والميل الحيوان من أجل أن يكون رئيسها على مستوى أدنى من القلب.
    ملاحظة: يجب الحرص على عدم اختراق حاجز بين البطينين عند إدخال الإبرة.
    1. Rinsالبريد الدم مع ما يقرب من 300 مل من PBS حتى الرئتين هم من البيض ولا يخرج الدم من الأذين الأيمن.
  7. وقف ضخ، بسرعة نقل خرطوم / أنابيب إلى حل الأكرولين 3٪، والبدء في ضخ مرة أخرى. تدريجيا زيادة سرعة ضخ 80 مل / دقيقة مرة واحدة في القلب قد توقف عن الخفقان. يروي حوالي 500 مل من محلول الأكرولين.
  8. وقف ضخ، بسرعة نقل خرطوم في حل PFA 4٪، والبدء في ضخ مرة أخرى. هذه الخطوة تتطلب ما يقرب من 1 L من PFA.
    ملاحظة: إن تثبيت اكتمال عندما الأمامية هي جامدة والرقبة قاسية.
  9. قطع الرأس وتشريح بعناية الدماغ من الجمجمة. الحرص على عدم تلف الدماغ مع الأدوات الجراحية. نضح هو الأمثل عندما الدماغ هو شاحب (أي أثر الدم) وجامدة (الشكل 1A).
  10. تزج الدماغ سليمة في 4٪ PFA لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية.
  11. قطع متسلسل الدماغ مع تبريد vibratome (4 ° C)في الطائرة المطلوبة إلى 50 ميكرون أبواب سميكة وجمعها في برنامج تلفزيوني (0.1 M) (الشكل 1B).
    ملاحظة: يمكن تنفيذ هذه الخطوة في نواح كثيرة وفقا لبروتوكول المرجوة. نصفي الكرة الأرضية يمكن فصلها قبل vibratome القطع، أو كله أبقى. إذا كان الدماغ هو كبير جدا لمنصة vibratome، فإنه يمكن خفض إلى كتل أصغر. بعد هذه الخطوة، أقسام يمكن تخزينها لفترة طويلة من الزمن في -30 ° C في محلول مضاد مصنوعة من 40٪ PB (50 ملم)، و 30٪ الجلسرين، و 30٪ جلايكول الإثيلين.

3. قبل تضمين المناعية (الشكل 1C)

  1. إعداد 4 L حل سهم مخزنة تريس المالحة (TBS، 50 مم، ودرجة الحموضة 7.6) على النحو التالي.
    1. قياس 2L من الماء المقطر في الكأس 4 L، إضافة 24.23 غرام من aminomethane trihydroxymethyl (ثام، C 4 H 11 NO 3)، ويقلب إلى حل.
    2. ضبط درجة الحموضة إلى 7.6 مع ما يقرب من 148 مل من 1 N حمض الهيدروكلوريك. وينبغي أن يضاف حمض مع cautiعلى تجنب الوصول إلى درجة الحموضة أقل من 7.6. يجب أن يكون الحجم الكلي 4 L.
      تنبيه: حمض الهيدروكلوريك غير ضارة للغاية. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة.
  2. حدد الأجزاء (من الخطوة 2.11) تحتوي على منطقة الفائدة التي سيتم تجهيزها لEM المناعية.
  3. غسل أقسام التعويم الحر 3X في برنامج تلفزيوني (0.1 M، ودرجة الحموضة 7.4) لمدة 5 دقائق على RT لشطف حل التجمد.
  4. إعداد محلول 0.5٪ من NaBH 4 مخففة في برنامج تلفزيوني.
    1. تزن 0.05 غرام من NaBH 4 وتمييع في 10 مل من برنامج تلفزيوني. لا تغطي. يعد هذا الحل فقط قبل الاستخدام.
  5. احتضان المقاطع في حل الطازجة NaBH 4 لمدة 30 دقيقة في RT. صخرة بلطف. لا تغطي.
  6. غسل 3X في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة في RT، هزاز بقوة حتى أيا من الغاز رد فعل لا يزال قائما.
  7. يعد حل حظر ل EM مع 2٪ مصل طبيعي المناسب و 0.5٪ الجيلاتين الأسماك الباردة المخفف في برنامج تلفزيوني.
    ملاحظة: شول كميةد تحسب من أجل الحصول على ما يكفي للخطوات الثلاث التالية. استخدام المصل مصنوعة من أنواع الحيوانات نفسها استضافة الأجسام المضادة الثانوية. تجنب استخدام أساليب استرجاع مستضد أو إضافة كميات صغيرة من تريتون (لزيادة اختراق الأجسام المضادة)، وهذه الأساليب بخرق كبير في نوعية الأنسجة.
  8. احتضان المقاطع في عرقلة الحل لمدة 1 ساعة على RT. صخرة بلطف.
  9. يعد حل الأجسام المضادة الأولية مخففة في عرقلة الحل.
    ملاحظة: إن تركيز الأجسام المضادة الأولية عادة ما يكون نفس لالمناعية LM، ولكن النظر في إجراء التجارب مع تركيز الأجسام المضادة المختلفة مسبقا، حيث أن بعض الأجسام المضادة الأولية قد لا تعمل مع الأكرولين. إذا كان الأمر كذلك، فمن الممكن استخدام مزيج من غلوتارالدهيد (0،1-2٪) و 4٪ PFA لنضح transcardiac والحصول على نتائج مماثلة. تحسين فترة حضانة ودرجة الحرارة أيضا.
  10. احتضان المقاطع في حل الأجسام المضادة الأوليةبين عشية وضحاها في RT مع هزاز لطيف. استخدام اختبار قبل فترة حضانة ودرجة الحرارة.
  11. غسل أقسام 3X في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في RT مع هزاز لطيف.
  12. إعداد 1: الحل 1000 من الأجسام المضادة الثانوية المعقدة البيروكسيديز مخففة في عرقلة الحل.
    ملاحظة: يجب أن يتم رفع الأجسام المضادة الثانوية ضد الأنواع المضيفة استخدامها لتوليد الأجسام المضادة الأولية.
  13. احتضان المقاطع في حل الضد الثانوية لمدة 1.5 ساعة عند RT. صخرة بلطف.
  14. يعد حل أفيدين البيوتين-البيروكسيديز (ABC) 60 دقيقة على الأقل قبل نهاية الحضانة الأجسام المضادة الثانوية.
    1. استخدام ماصة معايرة لقياس 8.80 ميكرولتر / مل من الحلول A و B وتمييع لهم في برنامج تلفزيوني.
    2. صخرة أقل ما يقال لمدة 60 دقيقة على الأقل في RT للسماح لاستكمال الربط بين أفيدين والبيوتين الجزيئات.
  15. بعد الحضانة في حل الضد الثانوية، وغسل 3X في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة في RT.
  16. احتضان المقاطع في ABC ذلكlution لمدة 1 ساعة على RT. صخرة بلطف.
  17. يغسل مرة واحدة في برنامج تلفزيوني ومرتين في TBS لمدة 10 دقيقة في RT مع هزاز لطيف.
  18. يعد حل الطازجة 0.05٪ 3،3'-diaminobenzidine (DAB) مع 0.005٪ H 2 O 2 مخففة في TBS.
    1. تزن 12.5 ملغ من DAB وتمييع في 25 مل من TBS الباردة. احم من الضوء.
      تنبيه: مسحوق DAB متقلبة للغاية وضارة في حالة استنشاقه. ومن مسرطنة وماسخة. وبالتالي، يجب على النساء الحوامل أو المرضعات عدم التعامل مع هذا المنتج، حتى عندما تضعف. استخدام قناع N95 عند التعامل مع وارتداء معدات الوقاية الشخصية.
    2. تصفية حل وإضافة 4.5 ميكرولتر من 30٪ H 2 O 2 قبل الاستخدام.
  19. احتضان المقاطع في حل DAB ل3-7 دقيقة في RT. صخرة بلطف.
    ملاحظة: راسب بني لا ينبغي أن تكون مظلمة للغاية من أجل تجنب مستوى عال من تلوين الخلفية. ينبغي أن يكون الأمثل فترة حضانة وفقا لذلك.
  20. وقف رد فعل عن طريق الغسيل بسرعة مرتينفي TBS الباردة، ثم مرتين لمدة 10 دقيقة في TBS الباردة في RT، تليها مرتين لمدة 10 دقيقة في PB، مع هزاز معتدل.
    ملاحظة: استخدام PB (وليس PBS) أمر بالغ الأهمية من أجل القضاء على أي آثار لكلوريد الصوديوم، كما أن تتفاعل مع الأوسيميوم وشكل بلورات.

4. المعاملة بالأوزميك والتضمين للالكترون مجهرية المراقبة

  1. يعد حل من 1٪ رباعي أكسيد الأوزميوم (أوسو 4) المخفف في PB. احم من الضوء.
    تنبيه: الأزميوم هو شديد السمية، وينبغي أن لا تأتي في اتصال مع الجلد والعينين والفم أو وينبغي ألا استنشاقه. ويمكن أن يسبب الموت إذا تناولها. وينبغي أن تستخدم إلا تحت غطاء التنفيس ومع PPE المناسبة.
  2. احتضان المقاطع في أوسو 4 الحل لمدة 30 دقيقة في RT تحت غطاء محرك السيارة التنفيس (بدون التحريض) وتغطيتها بورق الألمنيوم لحمايتهم من الضوء. تماما تتسطح الأقسام قبل إضافة حل أوسو 4.
    ملاحظة: أقسام تصبح مظلمة جدا وريدائرة المخابرات العامة، وينبغي معالجته بعناية بعد هذه الخطوة.
  3. إعداد راتنجات الايبوكسي بالماء طارد خلال المعاملة بالأوزميك.
    1. إضافة كميات مناسبة من كل مكون من مزيج راتنجات الايبوكسي (20 غرام من راتنجات الايبوكسي، 20 غراما من تصليب، 0.6 غرام من مسرع و 0.4 غرام من الملدنات) إلى كوب كبير من البلاستيك. يحرك بعصا خشبية أو ماصة بلاستيكية حتى يتم الحصول على اللون البني متجانسة.
      ملاحظة: من المهم جدا استخدام النسبة الدقيقة لكل مكون.
    2. نقل كميات متساوية في أكواب الألومنيوم ذات الأحجام المناسبة، اعتمادا على عدد من المقاطع لتتم معالجتها. السماح لها للراحة.
  4. غسل أقسام osmificated 3X في PB لمدة 10 دقيقة في RT مع انخفاض السرعة هزاز.
  5. يذوى المقاطع في السلسلة التالية من الايثانول متدرج لمدة 2 دقيقة لكل منهما: 2 مرات في 35٪ من الإيثانول. 1 مرة في كل 50، 70، 80، 90، و 95٪ من الإيثانول. و3X في الإيثانول بنسبة 100٪.
  6. نقل المقاطع لقوارير الزجاج لاستكمال dehydratiعلى عملية التي يحتضنها الأقسام 3 مرات لمدة 2 دقيقة في أكسيد البروبيلين.
    تنبيه: أكسيد البروبيلين هو مذيب عضوي شديد التقلب والسامة. ويمكن أن يسبب أضرارا خطيرة في العينين أو الجلد في حالة ملامسة أو في حالة استنشاقه أو ابتلاعه. وقد تم تصنيفها على أنها مادة مسرطنة الصف 2. وينبغي أن تستخدم إلا تحت غطاء التنفيس ومع PPE. بل هو أيضا سريع الاشتعال ويجب أن تبقى بعيدا عن أي مصدر حراري.
    ملاحظة: قبل هذه الخطوة، يجب نقل أقسام بعناية في قوارير زجاجية، منذ أكسيد البروبيلين هو المذيبات العضوية وغير متوافق مع البلاستيك. عند هذه النقطة، أقسام هشة جدا ويجب معالجته بعناية. أقسام يمكن نقل بدلا من ذلك إلى قارورة زجاجية السابقة إلى الخطوة 4.5.
  7. نقل المقاطع بعناية، واحدا تلو الآخر، في أكواب الألمنيوم وتجنب ملامسة الهواء قدر الإمكان. شقة-تضمين المقاطع في مختلطة سابقا راتنجات الايبوكسي بالماء طارد واحتضان لهم بين عشية وضحاها تحت ventinز هود في RT.
    ملاحظة: في هذه الخطوة، والمقاطع المجففة تماما وهشة للغاية، وينبغي التلاعب بها بعناية.
  8. استخدام الزيوت المعدنية، وإعداد الشرائح الزجاجية المغلفة الشحوم مع coverslips البلاستيك مدهون.
  9. تليين الراتنج التي يحتضنها أكواب الألومنيوم عند 60 درجة مئوية لمدة 12-15 دقيقة على الأكثر. بعناية تتسطح المقاطع على الجانب مدهون من شريحة زجاجية. ضع ساترة مدهون ودفع بعناية أي الهواء المتبقية.
  10. احتضان الشرائح في 60 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
    ملاحظة: من المهم جدا أن لا تتجاوز 48 ساعة فترة حضانة، والراتنج سيصبح صعبا للغاية.
  11. إزالة ساترة البلاستيك.

5. إعداد نموذج لسامسونج باجتزاء والمراقبة باستخدام مجهر نقل الكترون

  1. استخدام مناظير للعثور على المنطقة من اهتمام وقطع قطعة صغيرة من رباعي الزوايا حوالي 1 ملم 2 مع مشرط.
  2. ملف غيض من كتلة الراتنج والصمغ تشوقطعة adrangular على ذلك (الشكل 1C). السماح للالغراء لتجف لمدة 1 ساعة على الأقل أو قبل ليلة وضحاها إلى باجتزاء.
  3. باستخدام مشراح مستدق، وقطع قطعة رباعي الزوايا إلى 80 أقسام ميكرون سميكة (1D الشكل).
    1. وضع كتلة الراتنج في سطح السفينة مشراح مستدق في الوضع الرأسي و، باستخدام شفرة حلاقة حادة، وقطع تدريجيا كل جانب من كتلة الراتنج لتشكيل شبه منحرف مع الجانبين على نحو سلس.
    2. وضع سطح السفينة في موقفها الأفقي وتدوير كتلة حتى الجانب الأطول من شبه منحرف يواجه الهبوط.
    3. استخدام أداة الماس تقليم أو سكين الزجاج لخفض سطح قطعة رباعي الزوايا. تعيين مشراح مستدق إلى قطع 300 ميكرون أبواب سميكة في 1 ملم / ثانية. ضبط السكين ليكون عموديا موازية لقطعة رباعي الزوايا ولعرض زاوية أفقية صغيرة جدا من ما يقرب من 1 درجة.
      ملاحظة: هذا زاوية تسمح للمستخدم الاقتراب من الأنسجة موازية تقريبا لسطح بقفل، حيث من المرجح أن تكون وجدت العناصر immunolabeled. عند استخدام هذه المعلمات مع أداة الماس تقليم، ويعرض الراتنج لون أبيض لامع. عندما يتم قطع الأنسجة، فإنه يتحول إلى اللون الأرجواني أو الأخضر.
    4. استخدام فائقة 45 درجة سكين الماس مجهزة قارب مملوء بالماء المقطر لخفض 80 ميكرون أبواب سميكة، تنعيم الأجزاء التي يمر عليها بقطعة من امتصاص الورق يميل في الزيلين، وجمع الأجزاء المتسلسلة على شبكات فتحة النيكل formvar المغلفة أو العارية 150 شبكات النحاس الشبكة (الشكل 1E).
  4. وضع شبكات في صندوق تخزين الشبكة.
  5. وصمة عار على شبكات من الرصاص سترات.
    1. استخدام 5 مل حقنة وحقنة 0.2 ميكرومتر مرشح لإعداد 1: حل 1 من محلول المخزون سترات الرصاص تصفيتها وتصفية الماء المقطر. حمايتها من الضوء.
      ملاحظة: حل سهم سترات الرصاص ينبغي بذل جديدة كل شهر لتجنب تشكيل depos الصلبةانها. انظر ورقة البيانات المادية لصفة الأسهم. وبالإضافة إلى ذلك، إذا لا بد من ملطخة سلسلة العديد من الشبكات، تغيير محلول مخفف عندما يصبح حليبي.
    2. ضع كل شبكة على قطرة من محلول مخفف، مع القسم في اتصال مع الحل. احتضان لمدة 3 دقائق.
    3. استخدام ملاقط صغيرة لعقد الشبكة، وشطف جيدا في اثنين من الأكواب التي تحتوي على الماء المقطر.
    4. إزالة الماء الزائد باستخدام بلطف ورقة امتصاص. تخزين الشبكات في مربع الشبكة. انتظر 30 دقيقة قبل فحص الأجزاء التي نقل الإلكترون المجهري (TEM، الشكل 1F).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا القسم، نقدم نتائج ممثل التي تم الحصول عليها بعد الملاحظة، وعلى مستوى EM الإرسال، من immunostained أنسجة المخ الرئيسيات ثابتة كيميائيا مع خليط من 3٪ و 4٪ الأكرولين PFA. حققنا الحفاظ جيدا على التركيب الدقيق، كما يتضح من غمد المايلين سليمة نسبيا والتصور أنيق أغشية مزدوجة (الشكل 2A). يمكن بسهولة الاتصالات متشابك، جنبا إلى جنب مع العناصر العصبية من المكروية، الكشف عن هويته (الشكل 2B). يتم التعرف على العناصر العصب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه المقالة، نقدم بروتوكول موثوق بها لنضح transcardiac من الرئيسيات غير البشرية والمناعية قبل التضمين مناسبة لEM فحص العينة. وعلى الرغم من نموذجي البرد EM، مثل CEMOVIS، يوفر المحافظة لا بأس به من التركيب الدقيق الدماغ، كما أنه يحد من استخدام المناعية 12. تقنيات أخرى، بما في ذلك البرد الإحلال وتقنية Tokuyaso، تسمح بعد تضمين المناعية، ولكن هذه التقنيات غالية الثمن بسبب الأجهزة الإضافية اللازمة أثناء العملية، ويمكن أن يكون والمهارات تحدي <...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذه الدراسة من قبل العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC، 401٬848-2٬011 إلى MP). استقبل النائب جائزة مهنة من فون دي بحوث كيبيك-سانتيه (FRQ-S). كان LE المستفيدة من زمالة الدكتوراه من FRQ-S (FRQ-S 14D 29441). ونحن نشكر ماري جوزيه ولمان للحصول على المساعدة الفنية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
فوسفات الصوديوم اللامائي ثنائي القاعدة (Na2HPO4)Fisher scientificS374-500
أحادي القاعدة أحادي هيدرات فوسفات الصوديوم (NaH2PO4· H2< / sub>O)EM ScienceSX0710-1
كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)فيشر العلميS271-3
هيدروكسي ميثيل أمينوميثان (THAM) فيشرالعلميT370-500
حمض الهيدروكلوريك & nbsp ؛EMDHX0603-31 N التخفيف. المنتج أكال. استخدم مع الحماية المناسبة.
هيدروكسيد الصوديومEMDSX0590-1تخفيف 5 N. المنتج أكال. استخدم مع الحماية المناسبة.
بارافورمالدهيد (PFA)SigmaP61484٪ تخفيف. المنتج شديد التقلب في شكل مسحوق وشديد السمية. استخدمه بحذر تحت غطاء التهوية مع الحماية المناسبة.
Acrolein (90٪)Sigma1102213٪. المنتج شديد السمية. استخدمه تحت غطاء التهوية مع الحماية المناسبة.
طاولة تنفيس تشريح الجثةMopecCE400
مضخة الترويةالإلكترونية كول بارمرماستر فليكس L / S 7523-90
إبرة (نضح)terumo   ؛NN-1838R18 G 11/2
إبرةterumo NN-2713R21 جم 1/2
كيتامين20 مجم / كجم
زيلازين4 مجم / كجم
أسيبرومازين0.5 مجم / كجم
مشرط مشرط
ريشة   ؛                   لانس201011                    J9913رقم 22 للجراحة ورقم 11 للمقص
الجراحي
Rongeurs
VibratomeLeicaVT 1200Sمعايرة الشفرة قبل كل استخدام ، عندما يسمح الجهاز
بشفرة حلاقة Vibratomeجيليتجين 642107
الجلسرينفيشر العلميG33-430٪
الإيثيلين جلايكولفيشر العلميE178-430٪ تخفيف
بوروهيدريد الصوديوم (NaBH4< / sub>)سيجماS-9125
مصل الحصان العادي (NHS)مختبرات جاكسون المناعية008-000-1212٪ تخفيف
جيلاتين السمك الباردأوريون900.0330.5٪ تخفيف. يتركز المنتج الأصلي بنسبة 40٪
من الجسم المضاد الأولي ، SERTCruz للتكنولوجيا الحيويةSC-14581/500 تخفيف
الجسم المضاد الأساسي ، ChATChemicon (Millipore)AB144P1/25
تخفيف الجسم المضاد الأساسي ، THImmunoStar229411/1,000
تخفيف الجسم المضاد الثانوي البيوتينيل ،مختبرات ناقلاتBA-95001/1,000 التخفيف
الجسم المضاد الثانوي البيوتينيل,الفأر مختبرات ناقلاتBA-20001/1,000 التخفيف
Vectastain النخبة ABC عدةمختبرات ناقلاتPK61008.8 & لتر / مل من A و B لكل
منهما 3،3 '-diaminobenzidine (DAB)SigmaD56370.05٪ تخفيف. المنتج شديد التقلب في شكل مسحوق وسام. لا ترمي النفايات في الحوض.
بيروكسيد (H2< / sub>O2< / sub>) 30٪فيشر العلميH-3230.005٪ تخفيف
رباعي أكسيد الأوزميوم (OsO4< / sub>) علمالمجهري الإلكتروني2٪ 19152
4٪ 19150
يمكن أن يكون الحل الأصلي إما 2 أو 4٪. انتبه إلى أيهما يستخدم لحساب التخفيف النهائي بنسبة 1٪. المنتج حساس جدا للضوء. الأوزميوم شديد السمية. استخدم فقط تحت غطاء التهوية مع الحماية المناسبة.
راتنجات الايبوكسي الطاردة للماء DurcupanSigmaA: M راتنجات الايبوكسي (44611)
B: مقوي 964 (44612)
C: مسرع 960 (DY 060) (44613)
D: ملدنات (44614)  		بلمرة 48 ساعة عند 58 درجة ؛ ج قبل رمي النفايات.
أكواب الألومنيومعلم المجهري الإلكتروني70048-01
كحول الإيثانول التجاري1019Cتمييع في الماء المقطر بتركيز مناسب
أكسيد البروبيلينعلم المجهري الإلكترون20401مذيب عضوي. شديدة التقلب وسامة. استخدم تحت غطاء التهوية.
زجاجية متوسطة غير مطليةمختبرات أبحاث الدماغ3875-FRسطح الشحوم بالزيت المعدني
فيلم بلاستيكي (فيلم تضمين أكلر)علم الإلكترون المجهري50425-25سطح الشحوم بالزيت المعدني
UltramicrotomeLeica UC7EM UC7
أداة تشذيب الماس (ultratrim)Diatome   ؛UT 1081يمكن استخدام سكين زجاجي بدلا من
ذلك الترا 45 درجة ؛ دياتوم سكين الماسDiatome MC13437مجهزة بقارب
زيلينفيشر العلميX5SK-4
شبكات نحاسية 150 شبكةعلم مجهري إلكترونG150-cu
صندوق شبكيعلم مجهري إلكترون71138يمكن تخزين ما يصل إلى 100 شبكة
سترات الصوديومAnachemia81983
نترات الرصاصSigmaL-6258اصنع محلول مخزون من سترات الرصاص المصنوع من 1.33 & nbsp ؛ ز من نترات الرصاص و 1.76 & nbsp ؛ ز من سترات الصوديوم المخففة في 42 & nbsp ؛ مل من الماء المقطر المغلي والمبرد الذي 8   ؛ مل من 1  تتم إضافة N هيدروكسيد الصوديوم بعد اكتمال التحويل من نترات الرصاص إلى سترات الرصاص. يجب أن يكون الرقم الهيدروجيني حوالي 12. قم بتخزين المحلول في زجاجة بلاستيكية محكمة الغلق وحمايتها من الضوء.
حقنةterumo SS-05L5 مل
فلتر حقنةCorning4312220.2 & micro ؛ م
ورق امتصاص (ورق ثنائي)علم المجهري الإلكتروني70086-1
فيلم مختبربارافيلمPM-999
زيت معدنيسيجماM5904
تخفيف شفرات EM تخفيف Santa الماعز شرائح

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pozzi, P., Gandolfi, D., et al. High-throughput spatial light modulation two-photon microscopy for fast functional imaging. Neurophotonics. 2 (1), 015005(2015).
  2. Zhou, Y., et al. A comparison study of detecting gold nanorods in living cells with confocal reflectance microscopy and two-photon fluorescence microscopy. J. Microsc. 237 (2), 200-207 (2010).
  3. Chao, W., Kim, J., Rekawa, S., Fischer, P., Anderson, E. H. Demonstration of 12 nm resolution Fresnel zone plate lens based soft X-ray microscopy. Opt. Express. 17 (20), 17669-17677 (2009).
  4. Wachulak, P., Bartnik, A., Fiedorowicz, H. A 50 nm spatial resolution EUV imaging-resolution dependence on object thickness and illumination bandwidth. Opt Express. , (2011).
  5. Wachulak, P., et al. A compact "water window" microscope with 60 nm spatial resolution for applications in biology and nanotechnology. Microsc. Microanal. , 1-10 (2015).
  6. Stikov, N., et al. In vivo histology of the myelin g-ratio with magnetic resonance imaging. Neuroimage. 118, 397-405 (2015).
  7. Stikov, N., et al. Quantitative analysis of the myelin g-ratio from electron microscopy images of the macaque corpus callosum. Data Brief. 4, 368-373 (2015).
  8. Mollenhauer, H. H. Artifacts caused by dehydration and epoxy embedding in transmission electron microscopy. Microsc. Res. Tech. 26 (6), 496-512 (1993).
  9. Henderson, R. Realizing the potential of electron cryo-microscopy. Q. Rev. Biophys. 37 (1), 3-13 (2004).
  10. Sander, B., Golas, M. M. Visualization of bionanostructures using transmission electron microscopical techniques. Microsc. Res. Tech. 74 (7), 642-663 (2011).
  11. Ren, G., Rudenko, G., Ludtke, S. J., Deisenhofer, J., Chiu, W., Pownall, H. J. Model of human low-density lipoprotein and bound receptor based on cryoEM. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (3), 1059-1064 (2010).
  12. Webster, P., Schwarz, H., Griffiths, G. Preparation of cells and tissues for immuno EM. Methods Cell Biol. 88, 45-58 (2008).
  13. Kürner, J., Medalia, O., Linaroudis, A. A., Baumeister, W. New insights into the structural organization of eukaryotic and prokaryotic cytoskeletons using cryo-electron tomography. Exp. Cell Res. 301 (1), 38-42 (2004).
  14. Humbel, B. M. Freeze-substitution. Handbook of cryo-preparation methods for electron microscopy. 13, 319-341 (2009).
  15. Stierhof, Y., Humbel, B. M., van Donselaar, E., Schwarz, H. Cryo-fixation, freeze-substitution rehydration and Tokuyaso cryo-sectioning. Handbook of cryo-preparation methods for electron microscopy. 14, 344-365 (2009).
  16. Leranth, C., Pickel, M. V. Electron microscopic pre-embedding double-immunohistochemical methods. Neuroanatomical tract-tracing methods 2. , 129-172 (1989).
  17. Luft, J. H. The use of acrolein as a fixative for light and electron microscopy. Anat. Rec. 133, 305-305 (1959).
  18. Saito, T., Keino, H. Acrolein as a fixative for enzyme cytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 24 (12), 1258-1269 (1976).
  19. King, J. C., Lechan, R. M., Kugel, G., Anthony, E. L. Acrolein: a fixative for immunocytochemical localization of peptides in the central nervous system. J. Histochem. Cytochem. 31 (1), 62-68 (1983).
  20. Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. Cytochemistry and electron microscopy. The preservation of cellular ultrastructure and enzymatic activity by aldehyde fixation. J. Cell Biol. 17, 19-58 (1963).
  21. Karlsson, U., Schultz, R. Fixation of the central nervous system for electron microscopy by aldehyde perfusion: I. Preservation with aldehyde perfusates versus direct perfusion with osmium tetroxide with special reference to membranes and the extracellular space. J. Ultrastruct. Res. 12, 160-186 (1965).
  22. Sesack, S. R., Pickel, V. M. Dual ultrastructural localization of enkephalin and tyrosine hydroxylase immunoreactivity in the rat ventral tegmental area: multiple substrates for opiate-dopamine interactions. J. Neurosci. 12 (4), 1335-1350 (1992).
  23. Mathai, A., Ma, Y., Paré, J., Villalba, R. M., Wichmann, T., Smith, Y. Reduced cortical innervation of the subthalamic nucleus in MPTP-treated parkinsonian monkeys. Brain. 138 (4), 946-962 (2015).
  24. Villalba, R. M., Paré, J., Smith, Y. Three-dimensional electron microscopy imaging of spines in non-human primates. Transmission electron microscopy methods for understanding the brain. 115, 81-103 (2016).
  25. Eid, L., Champigny, M., Parent, A., Parent, M. Quantitative and ultrastructural study of serotonin innervation of the globus pallidus in squirrel monkeys. Eur. J. Neurosci. 37 (10), 1659-1668 (2013).
  26. Eid, L., Parent, A., Parent, M. Asynaptic feature and heterogeneous distribution of the cholinergic innervation of the globus pallidus in primates. Brain Struct. Funct. 221, 1139-1155 (2016).
  27. Eid, L., Parent, M. Morphological evidence for dopamine interactions with pallidal neurons in primates. Front. Neuroanat. 9, 111-114 (2015).
  28. McDonald, K. High-pressure freezing for preservation of high resolution fine structure and antigenicity for immunolabeling. Methods Mol. Biol. 117, 77-97 (1999).
  29. Gilkey, J., Staehelin, L. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. J. Electron Microsc. Tech. 3, 177-210 (1986).
  30. Korogod, N., Petersen, C. C. H., Knott, G. W. Ultrastructural analysis of adult mouse neocortex comparing aldehyde perfusion with cryo fixation. eLife. 4, (2015).
  31. Karlsson, U., Schultz, R. Fixation of the central nervous system for electron microscopy by aldehyde perfusion: III. Structural changes after exsanguination and delayed perfusion. J. Ultrastruct. Res. 14, 47-63 (1966).
  32. Schultz, R. L., Maynard, E. A., Pease, D. C. Electron microscopy of neurons and neuroglia of cerebral cortex and corpus callosum. Am. J. Anat. 100 (3), 369-407 (1957).
  33. Gocht, A. Use of LR white resin for post-embedding immunolabelling of brain tissue. Acta Anat. (Basel). 145 (4), 327-339 (1992).
  34. Eldred, W. D., Zucker, C., Karten, H. J., Yazulla, S. Comparison of fixation and penetration enhancement techniques for use in ultrastructural immunocytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 31 (2), 285-292 (1983).
  35. Manocha, S. L. Effect of glutaraldehyde fixation on the localization of various oxidative and hydrolytic enzymes in the brain of rhesus monkey, Macaca mulatta. Histochem. J. 2 (3), 249-260 (1970).
  36. Mrini, A., Moukhles, H., Jacomy, H., Bosler, O., Doucet, G. Efficient immunodetection of various protein antigens in glutaraldehyde-fixed brain tissue. J. Histochem. Cytochem. 43 (12), 1285-1291 (1995).
  37. Storm-Mathisen, J., Ottersen, O. P. Immunocytochemistry of glutamate at the synaptic level. J. Histochem. Cytochem. 38 (12), 1733-1743 (1990).
  38. Hwang, S. J., Rustioni, A., Valtschanoff, J. G. Kainate receptors in primary afferents to the rat gracile nucleus. Neurosci. Lett. 312 (3), 137-140 (2001).
  39. Palay, S. L., McGee-Russeel, S. M., Gordon, S. Jr, Grillo, M. A. Fixation of neural tissues for electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide. J. Cell Biol. 12, 385-410 (1962).
  40. Corthell, J. Chapter 9, Perfusion and Immersion Fixation. Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 1st ed, Academic Press. 83-90 (2014).
  41. Helander, K. G. Formaldehyde prepared from paraformaldehyde is stable. Biotech. Histochem. 75 (1), 19-22 (2000).
  42. van Harreveld, A., Khattab, F. I. Perfusion fixation with glutaraldehyde and post-fixation with osmium tetroxide for electron microscopy. J. Cell. Sci. 3 (4), 579-594 (1968).
  43. Renno, W. M. Post-embedding double-gold labeling immunoelectron microscopic co-localization of neurotransmitters in the rat brain. Med. Sci. Monit. 7 (2), 188-200 (2001).
  44. Ellisman, M. H., Deerinck, T. J., Shu, X., Sosinsky, G. E. Picking Faces out of a Crowd: Genetic Labels for Identification of Proteins in Correlated Light and Electron Microscopy Imaging. Methods Cell Biol. 111, 139-155 (2012).
  45. Labrecque, S., et al. Hyperspectral multiplex single-particle tracking of different receptor subtypes labeled with quantum dots in live neurons. J. Biomed. Opt. 21 (4), 046008(2016).
  46. Bailey, R., Smith, A., Nie, S. Quantum dots in biology and medicine. Physica E Low Dimens. Syst. Nanostruct. 25 (1), 1-12 (2004).
  47. Perkovic, M., et al. Correlative light- and electron microscopy with chemical tags. J. Struct. Biol. 186 (2), 205-213 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Acrolein FixationTissue SectioningAntibody IncubationDAB StainingOsmium TetroxideEpoxy Resin EmbeddingUltramicrotomy

مقالات ذات صلة