Method Article

تعزيز نموذج المتعدد من الأنسجة عن طريق الجمع بين السلائف النظائر وسمها وإسوي الضغط توصيف (cPILOT)

DOI:

10.3791/55406

⸱

May 1st, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Pittsburgh, 2SGS North America Inc., 3Large Molecule Analytical Development, Pharmaceutical Development & Manufacturing Science, Janssen Research and Development

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جنبا إلى جنب السلائف وضع العلامات النظائر ووضع علامات إسوي الضغط (cPILOT) هو استراتيجية البروتينات الكمية التي تعزز القدرات المتنوعة عينة من علامات إسوي الضغط. يصف هذا البروتوكول تطبيق cPILOT إلى الأنسجة من نموذج الفأر المرض والبرية من نوع ضوابط مرض الزهايمر.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وهناك طلب متزايد على تحليل العديد من العينات البيولوجية لفهم المرض واكتشاف العلامات البيولوجية. استراتيجيات البروتينات الكمية التي تسمح بقياس وقت واحد من عينات متعددة أصبحت على نطاق واسع والحد بشكل كبير من تكاليف التجريبية والأوقات. وضعت لدينا مختبر تقنية تسمى مجتمعة السلائف وضع العلامات النظائر ووضع علامات إسوي الضغط (cPILOT)، مما يعزز عينة مضاعفة لوضع العلامات النظائر التقليدية أو النهج علامات إسوي الضغط. cPILOT العالمية يمكن تطبيقها على عينات القادمة من الخلايا والأنسجة وسوائل الجسم، أو الكائنات الحية كلها ويعطي معلومات عن وفرة البروتين النسبية في الظروف عينة مختلفة. cPILOT يعمل عن طريق 1) باستخدام الظروف عازلة انخفاض الرقم الهيدروجيني بشكل انتقائي الببتيد dimethylate N-ترميني و 2) باستخدام الظروف عازلة عالية الحموضة لتسمية الأمينات الأولية من بقايا يسين مع الكواشف إسوي الضغط المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد / الكواشف). درجة العينة مضاعفة المتاح هو يعتمد على عدد من التسميات السلائف المستخدمة وكاشف علامات إسوي الضغط. هنا، نقدم تحليل 12 نوع plex باستخدام الضوء وdimethylation الثقيلة جنبا إلى جنب مع الكواشف إسوي الضغط ستة نوع plex لتحليل 12 عينة من الأنسجة الماوس في تحليل واحد. تعزيز مضاعفة مفيد لتقليل الوقت والتكلفة التجريبية والأهم من ذلك، مما يسمح المقارنة بين العديد من الظروف العينة (مكررات البيولوجية، ومرحلة المرض، والعلاج بالعقاقير، المورثات، أو طولية نقاط الوقت) مع ميل أقل التجريبية والخطأ. في هذا العمل، ويستخدم النهج cPILOT العالمي لتحليل الدماغ والقلب والكبد والأنسجة عبر مكررات البيولوجية من نموذج الفأر المرض والبرية من نوع ضوابط مرض الزهايمر. يمكن تطبيقها العالمية cPILOT لدراسة العمليات البيولوجية الأخرى وتكييفها لزيادة عينة المتنوعة إلى أكثر من 20 عينة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروتينات غالبا ما ينطوي على تحليل العديد من العينات المستخدمة لفهم أفضل لعمليات المرض، حركية الانزيم، التعديلات بعد متعدية، والاستجابة للمؤثرات البيئية والاستجابة للعلاجات العلاجية، واكتشاف العلامات البيولوجية، أو آليات المخدرات. يمكن استخدام الأساليب الكمية لقياس الفروق النسبية في مستويات البروتين في عينات ويمكن أن تكون خالية من التسمية أو تنطوي على وضع العلامات النظائر (التمثيل الغذائي أو الكيميائية أو الأنزيمية). نمت أساليب النظائر المستقرة العلامات شعبية لأنها تسمح للكثير من عينات لتحليلها في وقت واحد ومناسبة لعينات من خلايا مختلفة، والأنسجة وسوائل الجسم، أو الكائنات الحية كلها. النظائر الوسم طرق 1،....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم شراء الفئران من غير ربحية مؤسسة البحوث الطبية الحيوية مستقلة ومقرها في شعبة الثروة الحيوانية مختبر في جامعة بيتسبرغ: الأخلاقيات بيان. تمت الموافقة على جميع البروتوكولات الحيوانية من لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في جامعة بيتسبرغ.

1. البروتين استخراج وتوليد الببتيدات لالكيميائية وضع العلامات

  1. استخراج البروتين من أنسجة أو خلايا أو سوائل الجسم.
    1. التجانس 60-90 ملغ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يستخدم cPILOT الكيمياء القائم على أمين كيميائيا الببتيدات التسمية في N-محطة وبقايا يسين ويعزز القدرات المتنوعة العينة. ويبين الشكل 2 البيانات MS التمثيلي التي يتم الحصول عليها من تحليل cPILOT 12 نوع plex من الدماغ والقلب والكبد والأنسجة من نموذج الفأر المرض والبرية من نوع ضوابط مرض الزهايمر. كما هو مبين في الجدول رقم 1، وشملت اثنين من مكررات البيولوجية للمرض والبرية من نوع الفئران الزهايمر في هذا التحليل 12 نوع ple.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

cPILOT يسمح لقياس وقت واحد من أكثر من 12 عينة فريدة من نوعها. من أجل ضمان وضع علامات ناجحة في كل من N-محطة ويسين بقايا من الببتيدات، لا بد أن يكون الرقم الهيدروجيني الصحيحة لكل مجموعة من ردود الفعل ولأداء رد فعل dimethylation أولا لوضع العلامات الببتيد. يتم تنفيذ dimethylation انتقائية في N-محطة من خلال وجود درجة الحموضة في ~ 2.5 (± 0.2). ويتحقق ذلك من خلال استغلال الاختلافات في ال PKA المجموعات الأمينية على يسين وN-محطة. في الرقم الهيدروجيني 2.5، ليسين غير نشط (PKA ~ 10.5)؛ ومع ذ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم المصالح المتنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون تقر جامعة بيتسبرغ صناديق البدء والمعاهد الوطنية للصحة، منحة NIGMS R01 (GM 117191-01) لRASR.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
الماء - الكمية MS GradeFisher ScientificW6-44 L ليست ضرورية
الأسيتونيتريل - MS GradeFisher ScientificA955-44 L الكمية ليست ضرورية
حمض الأسيتيكJT Baker9508-01
محلول هيدروكسيد الأمونيوم (28 - 30٪)Sigma Aldrich320145-500ML
فورمات الأمونيومAcros Organics208-753-9
حمض الفورميكفلوكا التحليلي94318-250ML-F
BCA مجموعةالبروتين بيرس ثيرمو فيشر العلمي23227
اليوريابيوراد161-0731
تريسبيوراد161-0716
ديثيوثريوتول (DTT)فيشر سينتيفكBP172-5
يودوأسيتاميد (IAM)Acros Organics144-48-9
L-CysteineSigma Aldrich ، الكيمياء168149-25G
L-1-tosylamido-2 فينيل إيثيل كولورميثيل كيتون (TPCK) المعالج بالتربسين من البنكرياس البقريسيجما ألدريتش ، علوم الحياةT1426-100MG
الفورمالديهايد (CH2< / sub>O) محلول ؛ 36.5 - 38٪ في H2< / sub>OSigma Aldrich ، علومالحياةF8775-25ML
الفورمالديهايد (13< / sup>CD2< / sub>O) محلول ؛ 20 بالوزن ٪ في D2< / sub>O ، 98 ذرة ٪ D ، 99 ذرة ٪ 13< / sup>Cسيجما ألدريتش ، الكيمياء596388-1G
سيانوبوروهيدريد الصوديوم ؛ درجة الكاشف ، 95٪سيجما ألدريتش156159-10G
سيانوبوروتيتيريد الصوديوم ؛ 96 ذرة ٪ د ، 98٪ CPSigma Aldrich ، الكيمياء190020-1G
نصائح الدوران القوية للتبادل الكاتيوني (SCX) عينة طقم إعدادعينة Protea BioSciencesSP-155-24kit
إيثيل بيكربونات الأمونيوم (TEAB) عازلةSigma Aldrich ، Life ScienceT7408-100ML
Isobaric Tagging Kit (TMT 6 plex) - 6 تفاعلات (1 × 0.8 مجم)Thermo Fisher Scientific90061
هيدروكسي لامين هيدروكلوريدسيجما ألدريتش ، كيمياء255580-100G
خلاط دوامة قياسيفيشر ساينتفيك2215365يمكن استخدام أي خلاط
خراطيش استخراج Oasis HLB 1 cc (10 mgWaters186000383هذه هي خراطيش C18< / sub> مشعب
فراغ Visiprep SPE ، DL (بطانة يمكن التخلص منها) ، طراز 24 منفذاSigma Aldrich57265نموذج 12 منفذا كاف أيضا
Speed-vacThermo ScientificSPD1010أي علامة تجارية من سرعة vac كافية
غرفة حمام مائيThermo Scientific2825/2826أي علامة تجارية لغرفة الحمام المائي مع درجات حرارة خاضعة للرسيبة كافية.
الخالط الميكانيكي (i.< / em> FastPrep-24 5G)MP Biomedicals116005500
Eksigent Nano LC - Ultra 2D مع جهاز أخذ العينات الآلي Nano LC AS-2Sciex-لميعد هذا النموذج متاحا. أي نانو LC مع جهاز أخذ العينات التلقائي كاف.
LTQ Orbitrap Velos مطياف الكتلةالحراريةالعلمية-لميعد هذا النموذج متاحا. يمكن استخدام أدوات أخرى عالية الدقة ( على سبيل المثال < / em > Orbitrap Elite أو Orbitrap Fusion أو Orbitrap Fusion Lumos).
برنامج البروتين (على سبيل المثال< / em> Proteome Discoverer) ThermoScientificIQLAAEGABSFAKJMAUH   ؛
الميزان التحليليMettler ToledoAL54
Stir plateVWR12365-382أي نوع من ألواح التحريك كافية
مقياس الأس الهيدروجيني (متوافق مع Tris)فيشر ساينتفيك (Accumet)13-620-183أي علامة تجارية لمقياس الأس الهيدروجيني كافية
الحموضة 10 عازلةفيشر ساينتفيك06-664-261أي علامة تجارية من المخزن المؤقت للأس الهيدروجيني 10 كافية
7 عازلةفيشر Scientific06-664-260أي علامة تجارية الأس الهيدروجيني عازل 7 كاف
1.5 مل أنابيب eppendorf ، 500 pkفيشر Scientific05-408-129أي علامة تجارية من أنابيب eppendorf سعة 1.5 مل كافية
0.6 مل أنابيب eppendorf ، 500 pkفيشر Scientific04-408-120أي علامة تجارية من أنابيب eppendorf سعة 0.6 مل كافية
0.65 & micro ؛ م وحدات تصفية الطرد المركزي MC DV فائقة الحريةEMD MilliporeUFC30DV00
2 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، 72 وحدةThermo Scientific69720
C18< / sub> مواد التعبئة (5 & nbsp; ومايكرو. م ، 100 Å ؛)BrukerPM5 / 61100/000لم يعد هذا المنتج متاحا من Bruker. ستكون مواد التعبئة البديلة ذات المواصفات المدرجة كافية
C18< / sub> مواد التعبئة (5 & nbsp; ومايكرو. م ، 200 Å ؛)BrukerPM5/61200/000لم يعد هذا المنتج متوفرا من Bruker. ستكون مواد التعبئة البديلة ذات المواصفات المذكورة كافية
فحص ثلاثي ) درجة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ong, S. -E., et al. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  2. Koehler, C. J., Arntzen, M. Ø, de Souza, G. A., Thiede, B.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

cPILOTIsobaric TaggingDimethylation LabelingSample MultiplexingProteomics AnalysisTissue HomogenizationStrong Cation ExchangeMass SpectrometryAlzheimer Disease ModelBiological Replicates

Related Articles