النماذج والمقايسات الجديدة التي من شأنها تحسين عملية تطوير الأدوية المبكرة للأدوية من الجيل التالي من الأدوية المضادة للسل مرغوبة للغاية. هنا ، نصف مقايسة سريعة وغير مكلفة ومتوافقة مع BSL-2 لتقييم فعالية الدواء ضد المتفطرة السلية التي يمكن تكييفها بسهولة للفحص عالي الإنتاجية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
وإنتاجية عالية الفحص المدعم لتقييم فعالية الدواء ضد بلعم Passaged
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يتم إعاقة عملية تطوير الأدوية المبكرة للأدوية المضادة للسل بسبب الترجمة غير الفعالة للمركبات ذات النشاط المختبري إلى الفعالية في البيئة السريرية. من المحتمل أن يكون هذا بسبب عدم مراعاة حواجز الاختراق الخلوي ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية الموجودة في المضيف المصاب. لقد أنشأنا مؤخرا نموذجا بديلا للعدوى يولد هياكل مجمعة كبيرة من البلاعم تحتوي على M. tuberculosis (Mtb) المعبأة بكثافة في جوهرها ، والذي كان مناسبا لاختبار الحساسية للأدوية. نموذج العدوى هذا غير مكلف وسريع والأهم من ذلك أنه متوافق مع BSL-2. هنا ، نصف الإجراءات التجريبية لتوليد هياكل مجمعة Mtb / البلاعم التي من شأنها أن تنتج Mtb يمر البلاعم لاختبار الحساسية للأدوية. على وجه الخصوص ، نوضح كيف يمكن تكييف نظام العدوى هذا مباشرة مع تنسيق اللوحة المكونة من 96 بئرا الذي يظهر قدرة الإنتاجية لفحص المكتبات المركبة مقابل Mtb. بشكل عام ، يعد هذا الاختبار إضافة قيمة إلى مجموعة أدوات اكتشاف الأدوية Mtb المتوفرة حاليا نظرا لبساطته وفعاليته من حيث التكلفة وقابليته للتوسع.
المقدمة
السل (TB) لا يزال يشكل تهديدا الصحة العالمية خطيرا على الرغم من توفر نظم العلاج الكيميائي لمكافحة السل لأكثر من 40 سنوات 1. وهذا يرجع جزئيا إلى شرط لفترات علاج طويلة لأكثر من 6 أشهر باستخدام مزيج من الادوية متعددة، الأمر الذي يؤدي إلى المريض عدم الامتثال 2 هذا. وظهور السل المقاوم للأدوية في السنوات الأخيرة من تعقيد المشاكل في الميدان حيث التنمية الناجحة من الأدوية المعتمدة سريريا هي شبه معدومة 3. في الواقع، على الرغم من تطوير الأدوية المضادة للسل شاملة، كان فقط دواء واحد وافقت ادارة الاغذية والعقاقير للاستخدام السريري في السنوات ال 40 الماضية
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: كما السل م مولودية 2 6206 هو سلالة الفوعة 17، 18، كل عمل في هذا البروتوكول لا يمكن أن يؤديها في 2 مرفق السلامة الأحيائية مستوى (BSL-2).
1. شروط الثقافة عن البروتين الفلوري الأخضر تعرب عن السل م مولودية 2 6206 (المتفطرات السلية -GFP)
ملاحظة: م. السل H37Rv المستمدة عوني التغذي سلالة مولودية 2 6206 (Δ panCD، Δ leuCD) تحولت مع استخدام GFP....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
لتأكيد متانة التكيف مع هذا النموذج العدوى إلى 96 بئرا شكل لوحة، ونحن هنا فحص قابلية المخدرات من المتفطرات السلية المستمدة من وجهة نظرنا 96-جيدا تكييفها نموذج العدوى إلى ريفامبيسين (RIF) وموكسيفلوكساسين (MOXI) وفقا لقالب معين في الشكل 1A. علينا أن نبرهن على توليد MTB / الهياكل الكلية بلعم الرئيسية لهذا الاختبار يمكن أن تنتج بشكل موثوق في شكل لوحة 96-جيدا (الشكل 2)، وبالتالي تمكين التوافق الإنتاجية .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هنا، التي وصفناها في التفاصيل بديلا المتفطرات السلية نموذج العدوى مناسبة لاختبار فعالية الدواء. يأخذ هذا النموذج في الاعتبار اثنين من العوامل الرئيسية التي ينبغي إيلاء المزيد من الاهتمام خلال عملية التنمية السل المخدرات في وقت مبكر: وجود الحواجز ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية للتغلغل المخدرات والتغيرات الأيضية من المتفطرات السلية خلال العدوى. في حين أظهرنا سابقا فوائد نموذج العدوى لدينا واقترح إمكانية توسيع نطاق العدوى لسرعة التوافق 16، .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
نشكر الدكتور فرانك وولشندورف على الوصول إلى قارئ لوحة التصوير الآلي Cytation 3. تم تمويل هذا العمل جزئيا من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة R01-AI104499 إلى OK. تم تنفيذ أجزاء من العمل في مرافق UAB CFAR ومن قبل UAB CFAR Flow Cytometry Core / Joint UAB Flow Flow Cellmetry Core ، والتي يتم تمويلها من قبل NIH / NIAID P30 AI027767 و NIH 5P30 AR048311.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 7H9 | BD Difco | 271310 | اتبع توصيات الشركة المصنعة |
| Middlebrook OADC | BD Biosciences | 212351 | |
| Tyloxapol | Sigma | T8761 | قم بإعداد محلول مخزون بنسبة 20٪ في H2< / sub>O ؛ فلتر تعقيم |
| ملح حمض D-Pantothenic hemicalcium | Sigma | P5710 | تحضير محلول مخزون 24 مجم / مل في H2 فلتر تعقيم |
| L-leucine | MP Biomedicals | 194694 | تحضير محلول مخزون 50 مجم / مل في H2< / sub>O ؛ فلتر تعقيم |
| Hygromycin B | EMD Millipore | 400051 | تحضير محلول مخزون 200 مجم / مل في H2< / sub>O |
| Nalgene Square زجاجة وسائط | PETG Thermo Fisher | 2019-0030 | |
| RPMI 1640 وسائط | Hyclone | SH30027.01 | |
| مصل الأبقار الجنيني | أتلانتا البيولوجي | S12450H | |
| L-glutamine | Corning | MT25005CI | |
| HEPES | Hyclone | SH30237.01 | |
| قارئ لوحة Cytation 3 | Biotek | قابل للتبديل مع أي قارئ لوحة فلورية وميكروسكوب | |
| Gen5 Software | Biotek | تسجيل وتحليل rezasurin coversion | |
| Rifampicin | فيشر العلمي | تحضير محلول مخزون 10 مجم / مل في H2< / sub>O | |
| Moxifloxacin Hydrochloride | Acros | Organics 457960010 | تحضير محلول مخزون 10 مجم / مل في H2< / sub>O |
| Resazurin ملح الصوديوم | Sigma | R7017 | تحضير 800 & mu ؛ جم / مل محلول مخزون في H2< / sub>O ؛ تصفية تعقيم |
| Tween-80 | Fisher Scientific | T164500 | تحضير محلول مخزون بنسبة 20٪ في H2< / sub>O ؛ تعقيم المرشح |
المراجع
- Barry, C. E. Lessons from seven decades of antituberculosis drug discovery. Curr Top Med Chem. 11 (10), 1216-1225 (2011).
- Bass, J. B. Jr, et al. Treatment of tuberculosis and t....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
