يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

بروتوكول تنقية مصممة HPLC أن ينتج عالية النقاء اميلويد بيتا اميلويد بيتا 42 و 40 الببتيدات، قادرة على قليل وحدات تشكيل

11.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/55482

⸱

مارس 27, 2017

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of California, Santa Cruz

في هذه المقالة

ملخص

< p class = "jove_content" >هنا نبلغ عن بروتوكول تنقية HPLC مخصص ينتج عنه ببتيدات أميلويد بيتا 42 (Aβ42) عالية النقاء وأميلويد بيتا 40 (Aβ40) ، قادرة على تكوين القلة. بيتا الأميلويد هو ببتيد شديد التراكم وكاره للماء متورط في مرض الزهايمر. تجعل الطبيعة النشوانية للببتيد تنقيتها تحديا.

الملخص

الببتيدات النشوانية مثل أميلويد بيتا المتورط في مرض الزهايمر (Aβ) ، يمكن أن تمثل تحديا كبيرا عند محاولة الحصول على مادة عالية النقاء. نقدم هنا بروتوكول تنقية HPLC مخصص لإنتاج ببتيدات أميلويد بيتا 42 (Aβ42) عالية النقاء وأميلويد بيتا 40 (Aβ40). لقد وجدنا أن الجمع بين الطور الثابت المتاح تجاريا للبولي (الستايرين / ديفينيل بنزين) الثابت ، الطور العكسي لمختبر البوليمر - الستايرينيديفينيل بنزين (PLRP-S) في ظل ظروف الأس الهيدروجيني العالي ، يتيح تحقيق نقاء عالي (>95٪) Aβ42 في تشغيل كروماتوجرافي واحد. التنقية قابلة للتكرار بدرجة كبيرة ويمكن تعديلها إلى كل من الظروف شبه التحضيرية والتحليلية اعتمادا على كمية المواد المطلوب تنقيتها. يمكن أيضا تطبيق البروتوكول على الببتيد Aβ40 بنجاح مماثل ودون الحاجة إلى تغيير الطريقة.

المقدمة

مرض الزهايمر هو اضطراب الاعصاب الذي آثار أكثر من 35 مليون شخص في جميع أنحاء العالم. 1 متورط بشدة في بداية وتطور هذا المرض، هو غاية تجميع عرضة، الببتيد مسعور اميلويد بيتا (Aβ). يتراوح 2 Aβ 36-43 الأحماض الأمينية في الطول، ولكن يعتقد أن 42 الأحماض الأمينية البديل، اميلويد بيتا 42 (Aβ42)، هو الشكل الأكثر سمية من البروتين. 3 ويرجع في معظم جزئيا إلى قدرة Aβ42 لتشكيل بسهولة قابل للانتشار، والأنواع بلازميدة قليلة القسيمات التي يعتقد أن تكون الكيانات السمية العصبية بشكل خاص. 4 من أجل تعزيز فهمنا للالببتيد Aβ، فمن الضروري الحصول بشكل روتيني المواد عالية النقاء. وقد تبين وجود شوائب التتبع إلى تغيير كبير في خصائص تجميع ميل الببتيد. 5

تيraditionally، وقد تم ذلك السائل اللوني (HPLC) فصل عالية الأداء من الببتيدات مسعور مثل Aβ من خلال استخدام مزيج من C 4 أو C 8 الأطوار الثابتة القائمة على السيليكا والطور المتحرك الحمضية. 6 ومع ذلك، يمكن لمثل هذه الظروف تحديا لتنقية الببتيد. نقطة تساوي الكهربية منخفضة من الببتيد Aβ (PI ما يقرب من 5.5) 7 يعني أنه في ظل الظروف الحمضية، يتم زيادة الببتيد تجميع ونتيجة لذلك يتم إنتاج واسعة، غير حلها، قمم HPLC التي غالبا ما تكون صعبة لعزل (الشكل 2A). وعلاوة على ذلك، فإن مثل هذه القمم واسعة غالبا ما تحتوي على الشوائب التي قد تؤثر على الشخصية تجميع الببتيد، وعادة تتطلب الجولات اللاحقة من تنقية والتي يمكن أن تؤثر بشكل كبير على كمية من الببتيد المنتجة.

بولي (الستايرين / divinylbenzene) مرحلة ثابتة، PLRP-S، يمثل وسيلة بديلة لpurifيينغ الببتيدات مسعور. وقد استخدمت في مرحلة ثابتة في تنقية عدد من البروتينات المختلفة ورسوله الأحماض النووي الريبي (مرنا). 8، 9 مرحلة ثابتة PLRP-S يتطلب أي يجند ألكيل إضافي للفصل المرحلة العكسي، والأهم من ذلك هو مستقر كيميائيا عند درجة الحموضة العالية الأمر الذي يؤدي إلى deaggregation من الببتيد. 7 هنا، نحن الإبلاغ عن مصممة بروتوكول تنقية HPLC أن ينتج عالية النقاء اميلويد بيتا 42 (Aβ42) وبيتا 40 الببتيدات (Aβ40) اميلويد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. تنقية ببتيد Aβ40 أو Aβ42 باستخدام تقنية HPLC التحضيرية

  1. قم بتحضير المحاليل المنظمة التالية لتنقية HPLC.
    1. حضر المحلول المنظم A (20 mM NH4OH) بإضافة 1.3 mL من NH4OH (محلول بتركيز 28%) إلى 1,00 mL من الماء عالي النقاء.
    2. حضر المحلول المنظم B (80% أسيتونتريل مع 20 mM NH4OH) بإضافة 1.3 mL من NH4OH (محلول بتركيز 28%) إلى محلول مكون من 80 mL من الأسيتونتريل بدرجة HPLC و20 mL من الماء عالي النقاء.
    3. حضر محلول إذابة العينات المنظم (0.1% NH4OH) بإضافة 10 µL من NH4OH (محلول بتركيز 28%) إلى 10 mL من الماء عالي النقاء.
  2. قم بإعداد جهاز HPLC كما هو موضح في الشكل 1.
    1. قم بتركيب زجاجات المذيبات التي تحتوي على المحلول المنظم A والمحلول المنظم B في مداخل مضخة HPLC باستخدام أنابيب بوليمرية. قم بتوصيل الأنابيب البوليمرية بمضخة HPLC باستخدام وصلة قطعة واحدة. تأكد من تركيب الأنبوب البوليمري لكل محلول منظم في صمام المدخل الصحيح للجهاز. قم بتجهيز مضخة HPLC بجهاز إزالة الغازات (degasser).
    2. قم بتوصيل مضخة HPLC بمدخل العمود التحضيري 30 Å 8 µm 25 mm х 300 mm (الشكل 1B، العمود في أقصى اليسار، انظر قائمة المواد) باستخدام أنابيب بوليمرية.
      1. قم بتوصيل الأنابيب البوليمرية بالعمود التحضيري باستخدام وصلة قطعة واحدة تُثبت باليد. تأكد من توجيه العمود البوليمري بالطريقة الصحيحة.
        ملاحظة: تتكون الطور الساكن للعمود التحضيري من جسيمات poly(styrene-divinylbenzene). يتم تحديد التوجيه الصحيح للعمود البوليمري على الغلاف الخارجي بسهم اتجاه واحد.
    3. قم بتوصيل مخرج العمود بكاشف الطول الموجي المزدوج باستخدام أنابيب بوليمرية، واضبط كاشف الطول الموجي على 214 nm و280 nm.
      1. قم بتغيير الطول الموجي عن طريق تعديل معلمات الطول الموجي للكشف في خيار طريقة إعداد الجهاز ضمن برنامج HPLC المدمج.
    4. قم بتوصيل الأنابيب البوليمرية بمدخل كاشف الطول الموجي باستخدام وصلة قطعة واحدة تُثبت باليد. قم بتوصيل أنابيب بوليمرية بصمام الخرج لكاشف الطول الموجي. قم بتوصيل الأنابيب البوليمرية بصمام الخرج لكاشف HPLC باستخدام وصلة قطعة واحدة تُثبت باليد؛ وسيكون هذا هو أنبوب تجميع العينات.
      ملاحظة: نظراً لافتقار ببتيد Aβ إلى حامل لون (chromophore) قوي، يجب استخدام 214 nm كطول موجي أساسي للأشعة فوق البنفسجية (UV) لجمع القمم.

إعداد نظام الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) لفصل المركبات وتحليلها.
الشكل 1: الإعداد التجريبي لجهاز الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) المستخدم لتنقية ببتيدات أميلويد بيتا. (Aمضخة HPLC رباعية مزودة بجهاز إزالة الغازات وكاشف طول موجي متغير مضبوط على 214 نانومتر و280 نانومتر؛Bأعمدة الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) المستخدمة لتنقية ببتيدات الأميلويد بيتا، من اليسار إلى اليمين، 25 × 30 مم2 عمود تحضيري، 7.5 × 30 ملم2 عمود شبه تحضيري ومقاس 4.6 × 250 مم2 عمود تحليلي؛ (سيمحقن يدوي مع 20 µL حلقة حقن من الفولاذ المقاوم للصدأ تُستخدم في تقنية الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) التحليلية؛ (دحاقن يدوي مزود بحلقة حقن من الفولاذ المقاوم للصدأ سعة 10 مل، يُستخدم للتنقية التحضيرية وشبه التحضيرية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

  1. قم ببرمجة برنامج HPLC لتشغيل طريقة التنقية كما هو موضح في الجدول 1. أدخل طريقة التنقية عن طريق تغيير معلمة الجدول الزمني للمذيب (في خيار إعداد طريقة الجهاز المدمج في برنامج HPLC). قم بتشغيل مضخة HPLC بالضغط على زر "on" في برنامج HPLC.
    ملاحظة: ستبدأ المضخة في تزويد النسبة البدئية من المنظم A والمنظم B عبر العمود التحضيري وجهاز HPLC.
    1. اترك النظام لمدة 30 min للوصول إلى حالة التوازن التام.
الوقت / minنسبة Buffer Aaنسبة Buffer Bbمعدل التدفقd / mL min-1
080206
4575.524.56
45.0180206
52.0180206
52.0273276
8573276
92595c6

الجدول 1: الجدول الزمني لتنقية ببتيدات Aβ42 و Aβ40 باستخدام عمود بوليمر بمقاس 25 × 30 mm. aالمحلول المنظم A - H2O مع 20 mM NH4OH؛ b80% MeCN / 20% H2O مع 20 mM NH4OH؛ cشُغل لمدة 15 min لغسل العمود قبل حقن العينة التالية؛ dمن أجل تشغيل معدل تدفق قدره 6 mL/min على أجهزة HPLC، يجب خفض حد الضغط إلى 20 bar.

  1. تنقية عينة ببتيد Aβ
    ملاحظة: تم الحصول على الببتيد الخام من خلال اصطناع الببتيد الآلي في الطور الصلب.10
    1. أذب 3 mg من ببتيد Aβ الخام في 4 mL من منظم إذابة العينة. قم بمعالجة العينة بالموجات فوق الصوتية لمدة 30-60 s في درجة حرارة الغرفة وبتردد 40 kHz للمساعدة في الإذابة.
    2. احقن العينة بأكملها في عمود HPLC باستخدام حقنة بلاستيكية سعة 5 mL مزودة بإبرة من الفولاذ المقاوم للصدأ مقاس 16. نفذ طريقة التنقية كما هو موضح في الخطوة الفرعية 1.3.
      ملاحظة: يتيح النظام إجراء حقن العينة باستخدام حاقن يدوي مزود بحلقة حقن من الفولاذ المقاوم للصدأ سعة 10 mL (الشكل 1D). سوف يشطف ببتيد Aβ المطلوب بين الدقيقة 72 و74 على شكل قمة حادة ومحددة (الشكل 2C).
    3. اجمع العينة في أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 50 mL. تأكد من هوية قمة Aβ من خلال قياس الطيف الكتلي بالحقن المباشر للمادة المستخلصة المجموعة.1 احفظ المادة المستخلصة لمدة تصل إلى 12 h عند -20 °C.
      ملاحظة: لا ينصح بتخزين المحلول لفترات تزيد عن 12 h بسبب احتمالية أكسدة الببتيد.
    4. اعزل الببتيد المُنقى عن طريق التجميد السريع للجزء أو الأجزاء المجموعة من ببتيد Aβ في النيتروجين السائل ثم قم بالتجفيف بالتجميد. نفذ عملية التجفيف بالتجميد للعينة عند درجة حرارة -60 °C وضغط 20 mTorr لمدة 24 h.
    5. نفذ بروتوكول HPLC التحلي كما هو موضح أدناه لتحديد نقاء ببتيد Aβ. احفظ الببتيدات في شكلها المجف بالتجميد عند -20 °C لمدة تصل إلى 6 أشهر.

2. تحليل HPLC التحلي لبروتين Aβ المنقى

  1. قم بتحضير محاليل HPLC المنظمة كما هو موضح في القسم الفرعي 1.1 من البروتوكول المذكور أعلاه.
  2. قم بإعداد نظام الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) التحلي وفقاً للخطوة 1.2.1 وكما هو موضح في الشكل 1 باستخدام العمود التحلي مقاس 4.6 × 250 مم (الشكل 1ب، العمود أقصى اليمين) والمحقن اليدوي مع 20 µL حلقة حقن من الفولاذ المقاوم للصدأ (الشكل 1جمُثبتة في الجهاز.
  3. قم ببرمجة برنامج جهاز الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) لتشغيل الطريقة التحليلية كما هو موضح في الجدول ٢ باتباع تعليمات مماثلة لتلك الواردة في الخطوة 1.3.
الزمن / minنسبة Buffer Aaنسبة Buffer Bbمعدل التدفق / mL min-1
09551
3050501

الجدول 2: الجدول الزمني لتحليل النقاء باستخدام تقنية HPLC لببتيد Aβ.aالمحلول المنظم A - H2O مع 20 mM NH4OH؛ b80% MeCN / 20% H2O مع 20 mM NH4OH.

  1. تحليل نقاء ببتيد Aβ
    1. قم بتحضير محلول بتركيز 1 mg/mL من الببتيد المنقى عن طريق إذابة الببتيد في محلول منظم العينة.
      ملاحظة: يمكن العثور على وصفة المحلول المنظم في القسم الفرعي 1.1. يتم تحديد تركيز البروتين عن طريق قياس امتصاص البروتين عند 280 nm (A280nm).12 معامل الانقراض المولي (ε) المستخدم لتحديد التركيز هو ε = 1,490 dm3 mol-1 cm-1.13
    2. احقن 20 µL من المحلول بتركيز 1 mg/mL (2 µM) في عمود HPLC وقم بتشغيل الطريقة التحليلية التي تم إعدادها في الخطوة 2.3.
      ملاحظة: يمكن تجميد المحلول المتبقي غير المستخدم في التحليل تجميداً سريعاً في النيتروجين السائل ثم تجفيفه بالتجميد لاستعادة ببتيد Aβ. يمكن العثور على تفاصيل التجفيف بالتجميد في القسم الفرعي 1.4.4. سيخرج ببتيد Aβ من العمود التحلي بين 16 و 18 min (الشكل 2D). استخدم برنامج تحليل التكامل المدمج الملحق بجهاز HPLC لتحديد نقاء ببتيد Aβ. يتم تحديد النقاء عن طريق تكامل كل ذروة فردية في الطيف وحساب النسبة المئوية لمساحة ذروة الببتيد. عادةً، يجب التأكد من أن النقاء >95%.

نتائج الكروماتوغرافيا، مخطط الامتصاصية مقابل الزمن، تحليل فصل البروتين، القمم محددة.
الشكل 2: آثار كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء (HPLC) ممثلة لـ Aβ42. (A) C التقليدية4 تنقية السيليكا، الظروف: منظم A: H2O مع 0.1% حمض ثلاثي فلورو الأسيتيك (TFA)، المحلول المنظم B: MeCN (أسيتونتريل) مع 0.1% TFA، التدرج: من 20 إلى 27% من المحلول المنظم B على مدى 40 دقيقة، يليه تركيز ثابت بنسبة 27% من المحلول المنظم B؛ (Bالتنقية التحضيرية باستخدام العمود مقاس 25 × 30 مم2 عمود بوليمر، الظروف: المنظم أ: H2O مع 20 ملي مولار من NH4هيدروكسيد، المحلول المنظم ب: 80% أسيتونتريل / 20% ماء2O بتركيز 20 ملي مولار من NH4هيدروكسيد، تدرج: من 20 إلى 27% من المحلول المنظم B على مدى 70 دقيقة، يليه تدفق متساوي التركيز بنسبة 27% من المحلول المنظم B؛ (كربونتنقية تحضيرية مُحسّنة باستخدام العمود مقاس 25 × 30 مم2 عمود بوليمري، وتوصَف الظروف في الجدول 1 الموجود في القسم الفرعي 1.3 من نص وصف البروتوكول؛ (دكروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء (HPLC) تحليلية باستخدام عمود بمقاس 4.6 × 250 مم2 عمود بوليمر، الشروط: المنظم أ: H2O مع 20 ملي مولار من NH4+4هيدروكسيد، المحلول المنظم ب: 80% أسيتونيتريل / 20% H2O مع 20 ملي مولار من NH4+4هيدروكسيد OH، وتدريج من 5% إلى 50% من المنظم B على مدار 30 دقيقة. وبالنسبة للأجزاء A وB وC، تمييز القمة المقابلة لـ Aβ42 بنجمة. ويظهر جمع قمة Aβ42 المميزة في الجزء C درجة نقاء تصل إلى >بنسبة 95% كما هو موضح في الجزء D. وقد استُخدم مطياف الكتلة لتحديد هوية ذروة Aβ42. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تؤدي تنقية ببتيد Aβ42 باستخدام مزيج من الطور الساكن PLRP-S والطور المتحرك ذي الرقم الهيدروجيني المرتفع إلى تكوين قمة حادة ومنفصلة لببتيد Aβ عند زمن احتجاز يتراوح بين 72 و74 دقيقة (الشكل 2ج). يتم تأكيد هوية القمة من خلال مطيافية الكتلة بالحقن المباشر للمادة المستخلصة التي تم جمعها. ويمكن تخزين المادة المستخلصة في درجة حرارة -20 °C في المحلول لمدة تصل إلى 12 ساعة، حيث قد يؤدي التخزين لفترات أطول إلى أكسدة البروتين. ولعزل الببتيد المُنقّى، يتم تجميد السائل الشطفي سريعاً في ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يعتمد تنقية HPLC للببتيد Aβ بشكل كبير على اختيار كل من المرحلة الثابتة المستخدمة في التنقية والطور المتحرك المختار لإزالة الببتيد. تجعل النقطة المتساوية الكهربية المنخفضة للببتيد والميل العالي للتجميع الظروف الكروماتوغرافية التقليدية لفصل البروتينات الكارهة للماء (المرحلة الثابتة C4 أو C8 إلى جانب مسدس متحرك حمضي) صعبة ، مع ببتيد Aβ يمسح كذروة واسعة طويلة وغير محلولة (الشكل 2 أ).

للتحايل على هذه المشكلة ، وجد أن المرحلة الثابتة PLRP-S ، المستقرة كيميائيا عند درجة الحموضة العال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

يود المؤلفون أن يشكروا Agilent على مساعدتهم الفنية. ينسب الفضل إلى كيت ماركهام ورافائيل بالومينو في مساعدتهما الأولية في تخليق وتنقية الببتيد Aβ وشكر الدكتور هسياو وي لي على مساعدته في إعداد الشكل 1 من المخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Agilent 1260 Infinity II مضخة ربع سنويةAgilentG7111Bhttp://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-pumps-vacuum-degassers/1260-infinity-ii-quaternary-pump
Agilent 1260 Infinity II كاشف الطول الموجي المتغير المزدوجAgilentG7114Ahttp://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-detectors/1260-infinity-ii-variable-wavelength-detector
حاقن يدوي Agilent 1260 Infinity II مزود بحلقة عينة من الفولاذ المقاوم للصدأ سعة 10 ملAgilent0101-1232
http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector Agilent 1260 Infinity II حاقن يدوي مزود ب 20 & micro ؛ L حلقة عينة من الفولاذ المقاومAgilentG1328Chttp://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector
حامل الحلقةتصاعد Agilent1400-3166
Agilent PLRP-S 300 & Ring; 5  ومايكرو. م 4.6 × 250 مم (تحليلي)AgilentPL1512-5501http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features
A & beta ؛ 42 أو A & beta ؛ 40 الببتيديتم تصنيعه داخليا باستخدام مركب الببتيد الآلي CEM liberty.
هيدروكسيد الأمونيوم (NH4< / sub>OH ، محلول 28٪)فيشر ScientificA669-500
أسيتونيتريلفيشر ScientificA998-4
HPLC درجة مياهفيشر ScientificW5-4
فالكون 50 مل أنبوب طرد مركزي مخروطيالشكل فيشر Scientific14-954-49A
Supelco PEEK Fitting قطعة واحدة محكمة الإصبع ، عبوة من 5 eaSigma-AldrichZ227250
Normject 5  cc حقنة معقمةفيشر Scientific1481729
16 مقياس SS إبرةRheodyne3725-086
للصدأ قوس

المراجع

  1. Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer's Disease. N. Engl. J. Med. 362 (4), 329-344 (2010).
  2. McGowan, E., et al. Aβ42 Is Essential for Parenchymal and Vascular Amyloid Deposition in Mice. Neuron. 47 (2), 191-199 (2005).
  3. Gong, Y., et al. Alzheimer's disease-affected brain: Presence of oligomeric Aβ ligands (ADDLs) suggests a molecular basis for reversible memory loss. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (18), 10417-10422 (2003).
  4. Selkoe, D. J. Soluble Oligomers of the Amyloid β-Protein Impair Synaptic Plasticity and Behavior. Behav Brain Res. 192 (1), 106-113 (2008).
  5. Zagorski, M. G., Yang, J., Shao, H., Ma, K., Zeng, H., Hong, A. Methodological and Chemical Factors Affecting Amyloid β Peptide Amyloidogenicity. Methods Enzymol. 309, 189-204 (1999).
  6. Kim, W., Hecht, M. H. Mutations Enhance the Aggregation Propensity of the Alzheimer's Aβ Peptide. J Mol Bio. 377 (2), 565-574 (2008).
  7. Fezoui, Y., et al. An improved method of preparing the amyloid beta-protein for fibrillogenesis and neurotoxicity experiments. Amyloid. 7 (3), 166-178 (2000).
  8. Zhelev, N. Z., Barratt, M. J., Mahadevan, L. C. Use of reversed-phase high-performance liquid chromatography on polystyrene-divinylbenzene columns for the rapid separation and purification of acid-soluble nuclear proteins. J Chromatogr A. 763 (1-2), 65-70 (1997).
  9. Thess, A., et al. Sequence-engineered mRNA Without Chemical Nucleoside Modifications Enables an Effective Protein Therapy in Large Animals. Mol Ther. 23 (9), 1456-1464 (2015).
  10. Warner, C. J. A., Dutta, S., Foley, A. R., Raskatov, J. A. Introduction of D-glutamate at a critical residue of Aβ42 stabilizes a pre-fibrillary aggregate with enhanced toxicity. Chem Eur J. 22 (34), 11967-11970 (2016).
  11. Thompson, J. A., Lim, T. K., Barrow, C. J. On-line High-performance Liquid Chromatography/Mass Spectrometric Investigation of Amyloid-β Peptide Variants Found in Alzheimer's Disease. Rapid Commun. Mass Spectrom. 13 (23), 2348-2351 (1999).
  12. Layne, E. Spectrophotometric and turbidimetric methods for measuring proteins. Met. Enzymology. 3, 447-455 (1957).
  13. Ioannou, J. C., Donald, A. M., Tromp, R. H. Characterizing the secondary structure changes occurring in high density systems of BLG dissolved in aqueous pH 3 buffer. Food Hydro. 46, 216-225 (2015).
  14. Rahimi, F., Maiti, P., Bitan, G. Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins (PICUP) Applied to Amyloidogenic Peptides. J. Vis. Exp. (23), e1071(2009).
  15. Bitan, G., Kirkitadze, M. D., Lomakin, A., Vollers, S. S., Benedek, G. B., Teplow, D. B. Amyloid β-protein (Aβ) assembly: Aβ40 and Aβ42 oligomerize through distinct pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (1), 330-335 (2003).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

بروتوكول تنقية مصممة HPLC أن ينتج عالية النقاء اميلويد بيتا اميلويد بيتا 42 و 40 الببتيدات، قادرة على قليل وحدات تشكيل
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.