مقالة منهجية

بروتوكول تنقية مصممة HPLC أن ينتج عالية النقاء اميلويد بيتا اميلويد بيتا 42 و 40 الببتيدات، قادرة على قليل وحدات تشكيل

DOI:

10.3791/55482

⸱

مارس 27, 2017

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of California, Santa Cruz

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_content" >هنا نبلغ عن بروتوكول تنقية HPLC مخصص ينتج عنه ببتيدات أميلويد بيتا 42 (Aβ42) عالية النقاء وأميلويد بيتا 40 (Aβ40) ، قادرة على تكوين القلة. بيتا الأميلويد هو ببتيد شديد التراكم وكاره للماء متورط في مرض الزهايمر. تجعل الطبيعة النشوانية للببتيد تنقيتها تحديا.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الببتيدات النشوانية مثل أميلويد بيتا المتورط في مرض الزهايمر (Aβ) ، يمكن أن تمثل تحديا كبيرا عند محاولة الحصول على مادة عالية النقاء. نقدم هنا بروتوكول تنقية HPLC مخصص لإنتاج ببتيدات أميلويد بيتا 42 (Aβ42) عالية النقاء وأميلويد بيتا 40 (Aβ40). لقد وجدنا أن الجمع بين الطور الثابت المتاح تجاريا للبولي (الستايرين / ديفينيل بنزين) الثابت ، الطور العكسي لمختبر البوليمر - الستايرينيديفينيل بنزين (PLRP-S) في ظل ظروف الأس الهيدروجيني العالي ، يتيح تحقيق نقاء عالي (>95٪) Aβ42 في تشغيل كروماتوجرافي واحد. التنقية قابلة للتكرار بدرجة كبيرة ويمكن تعديلها إلى كل من الظروف شبه التحضيرية والتحليلية اعتمادا على كمية المواد المطلوب تنقيتها. يمكن أيضا تطبيق البروتوكول على الببتيد Aβ40 بنجاح مماثل ودون الحاجة إلى تغيير الطريقة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مرض الزهايمر هو اضطراب الاعصاب الذي آثار أكثر من 35 مليون شخص في جميع أنحاء العالم. 1 متورط بشدة في بداية وتطور هذا المرض، هو غاية تجميع عرضة، الببتيد مسعور اميلويد بيتا (Aβ). يتراوح 2 Aβ 36-43 الأحماض الأمينية في الطول، ولكن يعتقد أن 42 الأحماض الأمينية البديل، اميلويد بيتا 42 (Aβ42)، هو الشكل الأكثر سمية من البروتين. 3 ويرجع في معظم جزئيا إلى قدرة Aβ42 لتشكيل بسهولة قابل للانتشار، والأنواع بلازميدة قليلة القسيمات التي يعتقد أن تكون الكيانات السمية العصبية بشكل خاص. 4 من أجل تعزيز فهمنا للالببتيد Aβ، فمن الضروري الحصول بشكل روتيني المواد عالية النقاء. وقد تبين وجود شوائب التتبع إلى تغيير كبير في خصائص تجميع ميل الببتيد. 5

تيraditionally، وقد تم ذلك السائل اللوني (HPLC) فصل عالية الأداء من الببتيدات مسعور مثل Aβ من خلال استخدام مزيج من C 4 أو C 8 الأطوار الثابتة القائمة على السيليكا والطور المتحرك الحمضية. 6 ومع ذلك، يمكن لمثل هذه الظروف تحديا لتنقية الببتيد. نقطة تساوي الكهربية منخفضة من الببتيد Aβ (PI ما يقرب من 5.5) 7 يعني أنه في ظل الظروف الحمضية، يتم زيادة الببتيد تجميع ونتيجة لذلك يتم إنتاج واسعة، غير حلها، قمم HPLC التي غالبا ما تكون صعبة لعزل (الشكل 2A). وعلاوة على ذلك، فإن مثل هذه القمم واسعة غالبا ما تحتوي على الشوائب التي قد تؤثر على الشخصية تجميع الببتيد، وعادة تتطلب الجولات اللاحقة من تنقية والتي يمكن أن تؤثر بشكل كبير على كمية من الببتيد المنتجة.

بولي (الستايرين / divinylbenzene) مرحلة ثابتة، PLRP-S، يمثل وسيلة بديلة لpurifيينغ الببتيدات مسعور. وقد استخدمت في مرحلة ثابتة في تنقية عدد من البروتينات المختلفة ورسوله الأحماض النووي الريبي (مرنا). 8، 9 مرحلة ثابتة PLRP-S يتطلب أي يجند ألكيل إضافي للفصل المرحلة العكسي، والأهم من ذلك هو مستقر كيميائيا عند درجة الحموضة العالية الأمر الذي يؤدي إلى deaggregation من الببتيد. 7 هنا، نحن الإبلاغ عن مصممة بروتوكول تنقية HPLC أن ينتج عالية النقاء اميلويد بيتا 42 (Aβ42) وبيتا 40 الببتيدات (Aβ40) اميلويد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فئة

1. تنقية HPLC التحضيرية للببتيد Aβ40 أو Aβ42

  1. قم بإعداد المخازن المؤقتة التالية لتنقية HPLC.
    1. قم بإعداد المخزن المؤقت A (20 ملي مولار NH4OH) عن طريق إضافة 1.3 مل من NH4OH (محلول 28٪) إلى 1,000 مل من الماء عالي النقاء.
    2. قم بإعداد العازلة B (80٪ أسيتونيتريل مع 20 ملي مولار NH4OH) عن طريق إضافة 1.3 مل من NH4OH (محلول 28٪) إلى محلول 800 مل من الأسيتونيتريل من الدرجة HPLC و 200 مل من الماء عالي النقاء.
    3. قم بإعداد مخزن ذوبان العينة (0.1٪ NH4OH) عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من NH4OH (محلول 28٪) إلى 100 مل من الماء عالي النقاء.
  2. قم بإعداد أداة HPLC كما هو موضح في الشكل 1.
    1. قم بتركيب زجاجات المذيبات التي تحتوي على المخزن المؤقت A و Buffer B على مداخل مضخة HPLC باستخدام أنابيب البوليمر. قم بتوصيل أنبوب البوليمر بمضخة HPLC بتركيب من قطعة واحدة. تأكد من تركيب أنبوب البوليمر لكل مخزن مؤقت على صمام المدخل الصحيح للأداة. قم بتركيب مضخة HPLC مع مزيل الغاز.
    2. قم بإقران مضخة HPLC بمدخل العمود التحضيري 300 Å 8 μm 25 مم × 300 مم (الشكل 1 ب ، العمود الأيسر الأقصى ، انظر قائمة المواد) باستخدام أنابيب البوليمر.
      1. قم بتوصيل أنبوب البوليمر بالعمود التحضيري بتركيب إصبع من قطعة واحدة. تأكد من توجيه عمود البوليمر بالطريقة الصحيحة.
        ملاحظة: تتكون المرحلة الثابتة للعمود التحضيري من جزيئات بولي (ستايرين-ديفينيل بنزين). يتم تمييز الاتجاه الصحيح لعمود البوليمر على الغلاف الخارجي بسهم اتجاهي واحد.
    3. قم بتوصيل مخرج العمود بكاشف الطول الموجي المزدوج باستخدام أنابيب البوليمر واضبط كاشف الطول الموجي على 214 نانومتر و 280 نانومتر.
      1. قم بتغيير الطول الموجي عن طريق تغيير معلمات الطول الموجي للكشف في خيار طريقة أداة الإعداد لبرنامج HPLC المدمج.
    4. قم بتوصيل أنبوب البوليمر بمدخل كاشف الطول الموجي بتركيب محكم بإصبع من قطعة واحدة. قم بتوصيل أنابيب البوليمر بصمام الإخراج لكاشف الطول الموجي. قم بتوصيل أنبوب البوليمر بصمام مخرج كاشف HPLC بتركيب محكم بإصبع من قطعة واحدة. سيكون هذا هو أنبوب جمع العينات.
      ملاحظة: إن عدم وجود كروموفور قوي على الببتيد Aβ يملي استخدام 214 نانومتر كطول موجي أولي للأشعة فوق البنفسجية (UV) لجمع الذروة.
< p class = "jove_content" >figure-protocol-1
الشكل 1: الإعداد التجريبي لأداة HPLC المستخدمة لتنقية ببتيدات بيتا النشوانية. (أ) مضخة HPLC الرباعية المزودة بمزيل الغاز وكاشف الطول الموجي المتغير المضبوطين على 214 نانومتر و280 نانومتر؛ (ب) أعمدة HPLC المستخدمة لتنقية ببتيدات بيتا الأميلويد، من اليسار إلى اليمين، 25 × 300 مم2 عمود تحضيري، 7.5 × 300 مم2 عمود شبه تحضيري، 4.6 × 250 مم2 عمود تحليلي؛ (ج) حاقن يدوي بحلقة حقن من الفولاذ المقاوم للصدأ سعة 20 ميكرولتر تستخدم في HPLC التحليلي؛ (د) حاقن يدوي مع حلقة حقن من الفولاذ المقاوم للصدأ سعة 10 مل تستخدم للتنقية التحضيرية وشبه التحضيرية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
  1. قم ببرمجة برنامج HPLC لتشغيل طريقة التنقية كما هو موضح في الجدول 1. أدخل طريقة التنقية عن طريق تغيير معلمة الجدول الزمني للمذيبات (في خيار طريقة أداة الإعداد المضمن في برنامج HPLC). قم بتشغيل مضخة HPLC بالنقر فوق الزر "تشغيل" في برنامج HPLC.< / > ملاحظة: ستبدأ المضخة في توفير نسبة بدء تشغيل المخزن المؤقت A والمخزن المؤقت B من خلال العمود التحضيري وأداة HPLC.
    1. اترك النظام لمدة 30 دقيقة حتى يتوازن تماما.
<جدول fo:keep-together.within-page="1"> الوقت / الدقيقة النسبة المئوية من المخزن المؤقت أأ النسبة المئوية من المخزن المؤقت بب معدل التدفقد / مل دقيقة -1 0 80 20 6 45 75.5 24.5 دولار 6 45.01 دولار 80 20 6 52.01 دولار 80 20 6 52.02 دولار 73 27 6 85 73 27 6 92 5 95ج 6

الجدول 1: الجدول الزمني لتنقية الببتيدات Aβ42 و Aβ40 باستخدام عمود البوليمر 25 × 300 مم. أالمخزن المؤقت A - H2O مع 20 ملي NH4OH ؛ ب80٪ MeCN / 20٪ H2O مع 20 ملي NH4OH ؛ جركض لمدة 15 دقيقة لغسل العمود قبل الحقن التالي للعينة ؛ دمن أجل تشغيل معدل تدفق يبلغ 6 مل / دقيقة على أجهزة HPLC ، يجب تقليل حد الضغط إلى 200 بار.

  1. تنقية عينة الببتيد Aβ
    ملاحظة: تم الحصول على الببتيد الخام من خلال تخليق الببتيد الآلي في المرحلة الصلبة. <فئة الدعم = "xref">10
    1. قم بإذابة 3 مجم من الببتيد Aβ الخام في 4 مل من المخزن المؤقت لإذابة العينة. قم بتقطيع العينة لمدة 30-60 ثانية في درجة حرارة الغرفة وبتردد 40 كيلو هرتز للمساعدة في الذوبان.
      2. قم
    2. بحقن العينة بأكملها على عمود HPLC باستخدام حقنة بلاستيكية سعة 5 مل مزودة بإبرة من الفولاذ المقاوم للصدأ قياس 16. قم بتشغيل طريقة التنقية كما هو موضح في الخطوة الفرعية 1.3.
      ملاحظة: يتيح النظام إجراء حقن العينة من خلال استخدام حاقن يدوي مزود بحلقة حقن من الفولاذ المقاوم للصدأ سعة 10 مل (الشكل 1 د). سوف يتخلص الببتيد Aβ المطلوب بين 72 و 74 دقيقة كذروة حادة تم حلها (الشكل 2 ج).
    3. اجمع العينة في أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 50 مل. تأكد من هوية الذروة Aβ من خلال قياس الطيف الكتلي للحقن المباشر للمادة المجمعة. <فئة sup = "xref">11 قم بتخزين المادة المغلفة لمدة تصل إلى 12 ساعة عند -20 درجة مئوية.
      ملاحظة: لا ينصح بتخزين المحلول لفترات أطول من 12 ساعة بسبب احتمالية أكسدة الببتيد.
    4. اعزل الببتيد المنقى عن طريق التجميد السريع للحصص / الحصص المجمعة من الببتيد Aβ في النيتروجين السائل والتجميد بالتجميد. قم بإجراء التجفيد بالتجميد عن طريق تجفيف العينة بالتجميد عند درجة حرارة -60 درجة مئوية وضغط 20 mTorr لمدة 24 ساعة.
    5. قم بتشغيل بروتوكول HPLC التحليلي كما هو موضح أدناه لتحديد نقاء الببتيد Aβ. قم بتخزين الببتيدات في شكلها المجفف بالتجميد عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
< p class = "jove_title" >2. تحليل HPLC التحليلي لبروتين Aβ المنقى
  1. قم بإعداد المخازن المؤقتة ل HPLC كما هو موضح في القسم الفرعي 1.1. من البروتوكول أعلاه.
  2. قم بإعداد HPLC التحليلي وفقا للخطوة 1.2.1 وكما هو موضح في الشكل 1 مع العمود التحليلي 4.6 × 250 مم (الشكل 1 ب ، العمود الأيمن الأقصى) والحاقن اليدوي مع حلقة حقن الفولاذ المقاوم للصدأ 20 ميكرولتر (الشكل 1C) المثبتة على الأداة.
  3. قم ببرمجة برنامج HPLC لتشغيل الطريقة التحليلية كما هو موضح في الجدول 2 باتباع التعليمات المشابهة لتلك الواردة في الخطوة 1.3.
<جدول fo:keep-together.within-page="1"> الوقت / الدقيقة النسبة المئوية من المخزن المؤقت أأ النسبة المئوية من المخزن المؤقت بب معدل التدفق / مل دقيقة -1 0 95 5 1 30 50 50 1

الجدول 2: الجدول الزمني لتحليل نقاء HPLC للببتيد Aβ. أالمخزن المؤقت A - H2O مع 20 ملي NH4OH ؛ ب80٪ MeCN / 20٪ H2O مع 20 ملي مولار NH4OH.

  1. تحليل نقاء الببتيد Aβ
    1. قم بإعداد محلول 1 مجم / مل من الببتيد المنقى من خلال إذابة الببتيد في محلول العينة العازلة.
      ملاحظة: يمكن العثور على وصفة المخزن المؤقت في القسم الفرعي 1.1. يتم تحديد تركيز البروتين عن طريق قياس امتصاص البروتين عند 280 نانومتر (280 نانومتر). <فئة الدعم = "xref">12 معامل الانقراض المولي (ε) المستخدم لتحديد التركيز هو ε = 1،490 dm3 mol-1 cm-1. <فئة الدعم = "xref">13
    2. حقن 20 ميكرولتر من محلول 1 ملغم/مل (222 ميكرومتر) على عمود HPLC وقم بتشغيل الطريقة التحليلية التي تم إعدادها في الخطوة 2.3.
      ملاحظة: يمكن تجميد المحلول المتبقي غير المستخدم للتحليل في النيتروجين السائل وتجفيده بالتجميد لاستعادة الببتيد Aβ. يمكن العثور على تفاصيل التجميد في القسم الفرعي 1.4.4. سوف يتخلص الببتيد Aβ من العمود التحليلي بين 16 و 18 دقيقة (الشكل 2 د). استخدم برنامج تحليل التكامل المدمج المصاحب لأداة HPLC لتحديد نقاء الببتيد Aβ. يتم تحديد النقاء من خلال دمج كل من القمم الفردية على الطيف وحساب مساحة النسبة المئوية لذروة الببتيد. عادة ، يجب التأكد من تنقية بنسبة >95٪.
< p class = "jove_content" >figure-protocol-2
الشكل 2: آثار HPLC التمثيلية ل Aβ42. (أ) تنقية السيليكا التقليدية C4 ، الظروف: المخزن المؤقت A: H2O مع 0.1٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA) ، المخزن المؤقت B: MeCN (الأسيتونيتريل) بنسبة 0.1٪ TFA ، التدرج: 20 إلى 27٪ عازلة B على مدى 40 دقيقة متبوعة بمخزن مؤقت متساوي بنسبة 27٪ B ؛ (ب) التنقية التحضيرية باستخدام عمود البوليمر2 مقاس 25 × 300 مم ، الشروط: العازلة A: H2O مع 20 ملي مولار NH4OH ، المخزن المؤقت B: 80٪ MeCN / 20٪ H2O مع 20 ملي مولار NH4OH ، التدرج: 20 إلى 27٪ مخزن مؤقت B على مدى 70 دقيقة متبوعا بمخزن مؤقت متساوي 27٪ B ؛ (ج) التنقية التحضيرية المثلى باستخدام عمود البوليمر 2 مقاس 25 × 300 مم2، ويرد وصف للشروط في الجدول 1 الموجود في القسم الفرعي 1-3 من نص وصف البروتوكول؛ (د) HPLC تحليلي باستخدام عمود البوليمر2 4.6 × 250 مم ، الشروط: المخزن المؤقت A: H2O مع 20 ملي مولار NH4OH ، المخزن المؤقت B: 80٪ MeCN / 20٪ H2O مع 20 ملي NH4OH ، التدرج -5 إلى 50٪ المخزن المؤقت B خلال 30 دقيقة. بالنسبة للأجزاء A و B و C ، يتم تمييز الذروة المقابلة ل Aβ42 بعلامة النجمة. تكشف مجموعة الذروة Aβ42 المميزة في الجزء C عن نقاء بنسبة >95٪ كما هو موضح في الجزء D. تم استخدام قياس الطيف الكتلي لتحديد هوية ذروة Aβ42. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" > يؤدي تنقية الببتيد Aβ42 باستخدام مزيج من الطور الثابت PLRP-S والطور المتحرك عالي الأس الهيدروجيني إلى تكوين ذروة حادة وحلت للببتيد Aβ في وقت احتفاظ يتراوح بين 72 و 74 دقيقة (الشكل 2 ج). يتم تأكيد هوية الذروة من خلال قياس الطيف الكتلي بالحقن المباشر للمادة المجمعة. يمكن تخزين المادة المزيلة عند -20 درجة مئوية في محلول لمدة تصل إلى 12 ساعة. قد تؤدي فترات التخزين الأطول إلى أكسدة البروتين. لعزل الببتيد المنقى ، يتم تجميد المادة المزيلة في النيتروجين السائل وتجمي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعتمد تنقية HPLC للببتيد Aβ بشكل كبير على اختيار كل من المرحلة الثابتة المستخدمة في التنقية والطور المتحرك المختار لإزالة الببتيد. تجعل النقطة المتساوية الكهربية المنخفضة للببتيد والميل العالي للتجميع الظروف الكروماتوغرافية التقليدية لفصل البروتينات الكارهة للماء (المرحلة الثابتة C4 أو C8 إلى جانب مسدس متحرك حمضي) صعبة ، مع ببتيد Aβ يمسح كذروة واسعة طويلة وغير محلولة (الشكل 2 أ).

للتحايل على هذه المشكلة ، وجد أن المرحلة الثابتة PLRP-S ، المستقرة كيميائيا عند درجة الحموضة العال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلفون أن يشكروا Agilent على مساعدتهم الفنية. ينسب الفضل إلى كيت ماركهام ورافائيل بالومينو في مساعدتهما الأولية في تخليق وتنقية الببتيد Aβ وشكر الدكتور هسياو وي لي على مساعدته في إعداد الشكل 1 من المخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Agilent 1260 Infinity II مضخة ربع سنويةAgilentG7111Bhttp://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-pumps-vacuum-degassers/1260-infinity-ii-quaternary-pump
Agilent 1260 Infinity II كاشف الطول الموجي المتغير المزدوجAgilentG7114Ahttp://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-detectors/1260-infinity-ii-variable-wavelength-detector
حاقن يدوي Agilent 1260 Infinity II مزود بحلقة عينة من الفولاذ المقاوم للصدأ سعة 10 ملAgilent0101-1232
http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector Agilent 1260 Infinity II حاقن يدوي مزود ب 20 & micro ؛ L حلقة عينة من الفولاذ المقاومAgilentG1328Chttp://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector
حامل الحلقةتصاعد Agilent1400-3166
Agilent PLRP-S 300 & Ring; 5  ومايكرو. م 4.6 × 250 مم (تحليلي)AgilentPL1512-5501http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features
A & beta ؛ 42 أو A & beta ؛ 40 الببتيديتم تصنيعه داخليا باستخدام مركب الببتيد الآلي CEM liberty.
هيدروكسيد الأمونيوم (NH4< / sub>OH ، محلول 28٪)فيشر ScientificA669-500
أسيتونيتريلفيشر ScientificA998-4
HPLC درجة مياهفيشر ScientificW5-4
فالكون 50 مل أنبوب طرد مركزي مخروطيالشكل فيشر Scientific14-954-49A
Supelco PEEK Fitting قطعة واحدة محكمة الإصبع ، عبوة من 5 eaSigma-AldrichZ227250
Normject 5  cc حقنة معقمةفيشر Scientific1481729
16 مقياس SS إبرةRheodyne3725-086
للصدأ قوس

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer's Disease. N. Engl. J. Med. 362 (4), 329-344 (2010).
  2. McGowan, E., et al. Aβ42 Is Essential for Parenchymal and Vascular Amyloid Deposition in Mice. Neuron. 47 (2), 191-199 (2005).
  3. Gong, Y., et al. Alzheimer's disease-affected brain: Presence of oligomeric Aβ ligands (ADDLs) suggests a molecular basis for reversible memory loss. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (18), 10417-10422 (2003).
  4. Selkoe, D. J. Soluble Oligomers of the Amyloid β-Protein Impair Synaptic Plasticity and Behavior. Behav Brain Res. 192 (1), 106-113 (2008).
  5. Zagorski, M. G., Yang, J., Shao, H., Ma, K., Zeng, H., Hong, A. Methodological and Chemical Factors Affecting Amyloid β Peptide Amyloidogenicity. Methods Enzymol. 309, 189-204 (1999).
  6. Kim, W., Hecht, M. H. Mutations Enhance the Aggregation Propensity of the Alzheimer's Aβ Peptide. J Mol Bio. 377 (2), 565-574 (2008).
  7. Fezoui, Y., et al. An improved method of preparing the amyloid beta-protein for fibrillogenesis and neurotoxicity experiments. Amyloid. 7 (3), 166-178 (2000).
  8. Zhelev, N. Z., Barratt, M. J., Mahadevan, L. C. Use of reversed-phase high-performance liquid chromatography on polystyrene-divinylbenzene columns for the rapid separation and purification of acid-soluble nuclear proteins. J Chromatogr A. 763 (1-2), 65-70 (1997).
  9. Thess, A., et al. Sequence-engineered mRNA Without Chemical Nucleoside Modifications Enables an Effective Protein Therapy in Large Animals. Mol Ther. 23 (9), 1456-1464 (2015).
  10. Warner, C. J. A., Dutta, S., Foley, A. R., Raskatov, J. A. Introduction of D-glutamate at a critical residue of Aβ42 stabilizes a pre-fibrillary aggregate with enhanced toxicity. Chem Eur J. 22 (34), 11967-11970 (2016).
  11. Thompson, J. A., Lim, T. K., Barrow, C. J. On-line High-performance Liquid Chromatography/Mass Spectrometric Investigation of Amyloid-β Peptide Variants Found in Alzheimer's Disease. Rapid Commun. Mass Spectrom. 13 (23), 2348-2351 (1999).
  12. Layne, E. Spectrophotometric and turbidimetric methods for measuring proteins. Met. Enzymology. 3, 447-455 (1957).
  13. Ioannou, J. C., Donald, A. M., Tromp, R. H. Characterizing the secondary structure changes occurring in high density systems of BLG dissolved in aqueous pH 3 buffer. Food Hydro. 46, 216-225 (2015).
  14. Rahimi, F., Maiti, P., Bitan, G. Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins (PICUP) Applied to Amyloidogenic Peptides. J. Vis. Exp. (23), e1071(2009).
  15. Bitan, G., Kirkitadze, M. D., Lomakin, A., Vollers, S. S., Benedek, G. B., Teplow, D. B. Amyloid β-protein (Aβ) assembly: Aβ40 and Aβ42 oligomerize through distinct pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (1), 330-335 (2003).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة