توضح هذه المقالة كيف يتم تحديد انتقائية الأيونات للقناة رودوبسين من خلال تسجيلات مشبك التصحيح للخلية الكاملة الفيزيولوجية الكهربية باستخدام خلايا HEK293. هنا ، يتم توضيح الإجراء التجريبي للتحقيق في انتقائية الكلوريد لقناة الأنيونرودوبسين الانتقائية. ومع ذلك ، فإن الإجراء قابل للنقل إلى channelrhodopsins الأخرى ذات الانتقائية المميزة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
كامل خلية التصحيح المشبك تسجيلات لتحديد الكهربية من أيون الانتقائية في تشانلرودوبسينز
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
على مدى العقد الماضي، أصبح تشانلرودوبسينز لا غنى عنه في البحوث علم الأعصاب حيث أنها تستخدم كأدوات للتلاعب غير الغازية العمليات الكهربائية في الخلايا المستهدفة. في هذا السياق، الانتقائية أيون من تشانلرودوبسين هي ذات أهمية خاصة. توضح هذه المقالة التحقيق في انتقائية الكلوريد ل أنيون-كونفيغنينغ تشانلرودوبسين من بروتيموناس سولكاتا عن طريق التسجيلات الكهربية التصحيح المشبك على خلايا HEK293. الإجراء التجريبي لقياس فوتوكرنتس بوابات الخفيفة يتطلب سريع للتحويل - أحادية اللون مثالي - مصدر الضوء إلى جانب المجهر من الإعداد على خلاف ذلك التصحيح المشبك التقليدي. يتم توضيح الإجراءات التحضيرية قبل التجربة التي تنطوي على إعداد حلول مخزنة، والاعتبارات على إمكانيات تقاطع السائل، والبذر وترنسفكأيشن من الخلايا، وسحب ماصات التصحيح. التسجيل الفعلي للعلاقة الجهد الحاليثانية لتحديد إمكانات انعكاس لمختلف تركيزات الكلوريد يأخذ مكان 24 ساعة إلى 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن. وأخيرا، يتم تحليل البيانات الكهربية فيما يتعلق الاعتبارات النظرية من توصيل الكلوريد.
المقدمة
تشانلرودوبسينز (شر) هي قنوات ايون ضوء بوابات التي تحدث في بقعة العين من الطحالب الخضراء المتحركة، وتكون بمثابة أجهزة الاستشعار الضوئية الأولية للالاستشعار والردود الرهابية 1 . منذ وصفها الأول في عام 2002 2 ، شرس مهدت الطريق لمجال الناشئة من علم الوراثة الضوئية ويمكن تطبيقها في مجموعة متنوعة من الخلايا المنفعلة على سبيل المثال داخل العضلات والهيكل العظمي، والقلب، أو الدماغ 3 ، 4 ، 5 . التعبير عن شرس في الخلايا المستهدفة النتائج في نفاذية أيون الضوء يمكن السيطرة عليها من الخلية الم....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
الشكل 1: الإعداد التصحيح المشبك. (1) مصدر الضوء، (2) الألياف البصرية، (3) برمجة مصراع، (4) محول الأرقام، (5) سائق مصراع، (6) مكبر للصوت، (7) نظام نضح، (10) قفص فاراداي و (11) مرحلة مجهر و (12) مدخل نضح و (13) مخرج نضح و (14) غرفة تسجيل و 15 مستشعر مستوى السائل و 16 قطب حمام مع جسر اجار، (18) هيدستيج، (19) ميكرومانيبولاتور، (20) المجهر المقلوب، (21) السكن مصباح المجهر، (22) امدادات الطاقة مصباح المجهر، (23) أنبوب مليء بالماء U- صمام، (25) الجدول المضادة للاهتزاز، (26) كاميرا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويبين الشكل 2 النتائج التمثيلية التي تم الحصول عليها من القياسات التالية بروتوكول وصفها. خلال الإضاءة مع الضوء الأخضر، بس ACR1 يتميز تيار عابر سريع الذي يتحلل بسرعة إلى مستوى ثابت الحالي. بعد أن يتم إيقاف الضوء، فوتوكرنتس تسوس إلى الصفر في غضون ميلي ثانية ( الشكل 2A ). تبادل تركيز كلوريد خارج الخلية يسبب تحولا في إمكانية انعكاس التي يمكن رؤيتها مباشرة في آثار فوتوكرنت المكتسبة. تقييم إمكانات انعكاس م.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تحديد إمكانات عكس في ظروف الأيونية والكهربائية محددة يوفر معلومات عن الأنواع الأيونية المنقولة بعد تفعيل الضوء من شر. إذا تنوعت الأنواع الأيونية حصريا في وسط فسيولوجي معقد، وتحولت إمكانية الانعكاس التي تم الحصول عليها وفقا لإمكانية نيرنست النظرية، فإن هذا النوع من الأيونات هو النوع الوحيد المنقول.
ومع ذلك، بالنسبة ل شرس، والتحولات المحتملة عكس عادة ما تكون أقل وضوحا مما كان متوقعا من معادلة نيرنست بسبب نفاذية لمخ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
نشكر مايلا ريه، ثارسانا ثارمالينجام وخاصة ألتينا كلاين للمساعدة التقنية الممتازة. وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة البحوث الألمانية (SFB1078 B2، FOR1279 SPP1665 إلى ف) ومجموعة المفاهيم الموحدة التميز في الحفز، ونيكات، بيج-نس (جف) و E4 (ف).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| خلايا HEK293 | Sigma Aldrich | 85120602 | خلايا الكلى الجنينية البشرية |
| الشبكية | Sigma Aldrich | R2500 | |
| بالكامل فوجين HD | Promega | E2312 | كاشف التعداء |
| DMEM | Biochrome | FG 0445 | جسور Dulbecco المعدلة النسر المتوسط |
| Agarose | Roth | 3810 | جسور أجار |
| CaCl2< / sub> | Roth | 5239 | CaCl2< / sub> 2H2< / sub>O |
| CsCl | Biomol | 2452 | |
| EGTA | Roth | 3054 | |
| FBS | Biochrome | S0615 | زراعة الخلية |
| الجلوكوز | روث | HN06 | D (+) - الجلوكوز |
| KCl | روث | 6781 | |
| MgCl2< / sub> | Roth | 2189 | MgCl2< / sub> 6H2< / sub>O |
| كلوريد الصوديوم | روث | 3957 | |
| NMG | سيجما ألدريتش | M2004 | N-Methyl-D-glucamine |
| Na-Aspartate | Sigma Aldrich | A6683 | L-Aspartic حمض الصوديوم ملح أحادي الهيدرات |
| حمض الستريك | Roth | 6490 | |
| AgeI | ThermoFischerScientific | ER1462 | إنزيم التقييد |
| XhoI | ThermoFischerScientific | ER0695 | إنزيم التقييد |
| NheI | ThermoFischerScientific | ER0975 | إنزيم التقييد |
| XL1Blue E. القولوني< em> | Agilent Technologies | 200249 | Chemoefficient E. القولوني< em> |
| Kanamycin | Roth | T832 | |
| مرق Lysogeny متوسط | Roth | X964 | |
| Agar-Agar | Roth | 6494 | لوحات أجار |
| طقم تنقية البلازميد | Marchery-Nagel | 740727.25 | |
| Penicilin / Streptomycin | Biochrome | A 2213 | ثقافة الخلايا |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407-5MG | غطاء زلة |
| طلاء Microforge | مخصص تلميع | الحريق | |
| الماصات المصلية | TPP | أحجام | |
| مختلفة مقعد نظيف | Kojair | Biowizard SL130 | |
| Stirrer | IKA | RCT منتجات علوم الأسلاك الفضية الكلاسيكية | |
| AG-T25 ؛ أقطاب AG-T10 | ، 0.64 مم (حمام) 0.25 مم (قطب كهربائي) | ||
| مقياس الأس الهيدروجيني | الكالماريتري | ||
| Vogel | OM 815 | ||
| مجهر | كارل زايس | ID03 | حاضنة تلميع الحرائق |
| CO2< / sub> حاضنة | الموثق | CB150 | |
| أطباق ثقافة الخلية | TPP | 93040 | 34 مم داخلي قطر |
| غطاء زلات | روث | P232 | 15 مم قطر |
| ميزان الحرارة | R & ouml; السفينة Messtechnik | MTM12 | |
| Beamsplitter | Chroma | 21011 | 90/10 |
| حامل ماصة | الحركة ALA Scientific Instruments | PPH-1P-AXU-0-1.5 | |
| الأجهزة الجزيئية | CV203BU | ||
| مكبر | الأجهزة الجزيئية | ||
| أجهزة جزيئية محول الأرقام | DigiData1400 | محول تناظري رقمي | |
| Lightsource | TILL Photonics | Polychrome V | ضبط على 540 نانومتر بكثافة كاملة |
| مجهر | كارل زايس | أكسيفرت 100 | |
| مصراع | فنسنت أسوشيتس | VS25 | |
| سائق مصراع | فنسنت أسوشيتس | VCM-D1 | |
| زجاج كابيلاريز | وارنر إنسترومنتس | G150F-3 | الشعيرات الدموية بورسليكات مع نهايات مصقولة بالنار OD 1.5 مم ID & nbsp; 0.86 مم |
| مجتذب ماصة | دقيقة أدوات Sutter | P1000 | |
| معالج الحمام | Lorenz Messger & auml ؛ tebau | MPCU | |
| ثلاثي النطاق مجموعة المرشحات | Chroma | 69008 | مرشح مضان ECFP/EYFP/mCherry |
| كاميرا CCD | Watec | Wat-221SCCD | |
| Optometer | Gigahertz Optik | P9710 | قياس شدة الضوء |
| الموضوعية | Carl Zeiss | 421462-9900-000 | W Plan-Apochromat 40X / 1.0 DIC |
| Micromanipulator | Scientifica | PatchStar | |
| غرفة التسجيل | |||
| امدادات | الطاقةManson | HCS-3202 | يتجنب الضوضاء الكهربائية من المجهر المدمج في إمدادات الطاقة |
| الاهتزاز طاولة معزولة | نيوبورت | M-VW-3636-OPT-01 | |
| قفص فاراداي | مخصص أو أي خراطيم طاولة | ||
| تجارية أي كومرسيال ؛ على سبيل المثال روث | أحجام ومواد مختلفة للتعامل مع الحمام وتطبيق ضغط الماصة ؛ جسور أجار | ||
| خطية شاكر | Sunlab Instruments | SU 1000 | |
| آلة حاسبة محتملة للتقاطع السائل | الأجهزة الجزيئية أو مباشرة من برنامج Peter H. Barry | يتم تضمينه في برنامج اقتناء Clampex أو يمكن الحصول عليها من p.barry@unsw.edu.au | |
| برنامج الحصول على البيانات | الأجهزة الجزيئية | Clampex 10.X | |
| برنامج تقييم البيانات | الأجهزة الجزيئية | Clampfit 10.X | |
| Ps< / em>ACR1 | GenBank أو Addgene | KF992074.1 أو Addgene plasmid # 85465 | ترميز الجينات ل Ps< / em>ACR1 |
| دليل | مضخم الأجهزة الجزيئية | دليل المحور العصبي |
المراجع
- Hegemann, P. Algal sensory photoreceptors. Annu. Rev. Plant Biol. 59, 167-189 (2008).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).
- Bruegmann, T., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
