كامل خلية التصحيح المشبك تسجيلات لتحديد الكهربية من أيون الانتقائية في تشانلرودوبسينز

Christiane Grimm; Johannes Vierock; Peter Hegemann; Jonas Wietek

doi:10.3791/55497

مقالة منهجية

كامل خلية التصحيح المشبك تسجيلات لتحديد الكهربية من أيون الانتقائية في تشانلرودوبسينز

DOI:

10.3791/55497

⸱

مايو 22, 2017

Christiane Grimm^*¹ , Johannes Vierock^*¹ , Peter Hegemann¹ , Jonas Wietek¹

¹Experimental Biophysics, Institute of Biology, Humboldt-Universität zu Berlin

^* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضح هذه المقالة كيف يتم تحديد انتقائية الأيونات للقناة رودوبسين من خلال تسجيلات مشبك التصحيح للخلية الكاملة الفيزيولوجية الكهربية باستخدام خلايا HEK293. هنا ، يتم توضيح الإجراء التجريبي للتحقيق في انتقائية الكلوريد لقناة الأنيونرودوبسين الانتقائية. ومع ذلك ، فإن الإجراء قابل للنقل إلى channelrhodopsins الأخرى ذات الانتقائية المميزة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على مدى العقد الماضي، أصبح تشانلرودوبسينز لا غنى عنه في البحوث علم الأعصاب حيث أنها تستخدم كأدوات للتلاعب غير الغازية العمليات الكهربائية في الخلايا المستهدفة. في هذا السياق، الانتقائية أيون من تشانلرودوبسين هي ذات أهمية خاصة. توضح هذه المقالة التحقيق في انتقائية الكلوريد ل أنيون-كونفيغنينغ تشانلرودوبسين من بروتيموناس سولكاتا عن طريق التسجيلات الكهربية التصحيح المشبك على خلايا HEK293. الإجراء التجريبي لقياس فوتوكرنتس بوابات الخفيفة يتطلب سريع للتحويل - أحادية اللون مثالي - مصدر الضوء إلى جانب المجهر من الإعداد على خلاف ذلك التصحيح المشبك التقليدي. يتم توضيح الإجراءات التحضيرية قبل التجربة التي تنطوي على إعداد حلول مخزنة، والاعتبارات على إمكانيات تقاطع السائل، والبذر وترنسفكأيشن من الخلايا، وسحب ماصات التصحيح. التسجيل الفعلي للعلاقة الجهد الحاليثانية لتحديد إمكانات انعكاس لمختلف تركيزات الكلوريد يأخذ مكان 24 ساعة إلى 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن. وأخيرا، يتم تحليل البيانات الكهربية فيما يتعلق الاعتبارات النظرية من توصيل الكلوريد.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تشانلرودوبسينز (شر) هي قنوات ايون ضوء بوابات التي تحدث في بقعة العين من الطحالب الخضراء المتحركة، وتكون بمثابة أجهزة الاستشعار الضوئية الأولية للالاستشعار والردود الرهابية ¹ . منذ وصفها الأول في عام 2002 ² ، شرس مهدت الطريق لمجال الناشئة من علم الوراثة الضوئية ويمكن تطبيقها في مجموعة متنوعة من الخلايا المنفعلة على سبيل المثال داخل العضلات والهيكل العظمي، والقلب، أو الدماغ ³ ^، ⁴ ^، ⁵ . التعبير عن شرس في الخلايا المستهدفة النتائج في نفاذية أيون الضوء يمكن السيطرة عليها من الخلية المعنية. في سياق الخلايا العصبية، وهذا يسمح تفعيل ⁶ ^، ⁷ ^، ⁸ أو تثبيط ⁹ ^، ¹⁰ من العمل المحتملة (أب) إطلاق - اعتمادا على أيون أجريت - مع المكانية والزمانيةدقة الضوء التي تؤكد كيفية انتقائية أيون من البديل شر يحدد تطبيق أوبتوجينيتيك لها.

وقد اكتشفت أول شرس من كلاميدوموناس راينهاردتي وفولفوكس كارتيري نفاذية للبروتونات، ولكن أيضا إلى الكاتيونات أحادي التكافؤ مثل الصوديوم والبوتاسيوم، وبدرجة أقل إلى الكاتيونات ثنائي التكافؤ مثل الكالسيوم والمغنيسيوم ¹¹ ^، ¹² ^، ¹³ . اليوم، أكثر من 70 الموجبة الطبيعية الموجبة تشانلرودودبسينز (سرس) ¹⁴ ^و ¹⁵ ^و ¹⁶ ^و ¹⁷ والعديد من المتغيرات المهندسة ¹⁸ ^و ¹⁹ ^و ²⁰ مع خصائص مختلفة مثل حجم فوتوكرنت، حساسية الطيفية، حركية، الانتقائية الموجبة المتاحة. بينما في علم الأعصاب، سرس أإعادة استخدامها لتنشيط الخلايا وإطلاق أبس، كانت المضخات الميكروبية مدفوعة ضوء المضادات المتاحة فقط لإسكات الخلايا العصبية لسنوات. في عام 2014، أظهرت مجموعتان في وقت واحد أن سرس يمكن تحويلها إلى أنيون-ترانزلاتيوندودوبسينز (أكرس) عن طريق تغيير القطبية على طول المسود أيون إجراء المسام عن طريق الهندسة الجزيئية ⁹ ^، ²¹ . وفي وقت لاحق، تم تحديد أكر الطبيعية في العديد من الطحالب كريبتوفيت ²² ^، ²³ ^، ²⁴ . الأهم من ذلك، تفعيل ضوء أكرس يتوسط تيارات الكلوريد في الخلايا العصبية البالغة السماح تثبيط نشاط الخلايا العصبية في شدة الضوء أقل بكثير من المضخات الميكروبية التي تنقل فقط رسوم واحدة لكل الفوتون استيعابها.

نشاط كر يمكن معالجتها مباشرة عن طريق التسجيلات الكهربية التصحيح المشبك من التيارات التي يسببها الضوء في خلايا HEK293. التصحيح المشبكوقد تم تطوير تقنية أصلا في أواخر 1970s ²⁵ ومواصلة تحسينها من قبل هاميل وآخرون. ، مما يسمح لتسجيل كيان التيارات من خلية صغيرة (وضع خلية كاملة) مع ارتفاع القرار الحالي والتحكم المباشر من الجهد الغشاء ²⁶ . تطبق هذه التقنية في ثقافة الخلية، وتوفر التحكم الدقيق في ظروف التسجيل الأيونية وكذلك الكهربائية، وتمكن من دراسة الانتقائية الأيونية جنبا إلى جنب مع المساهمة النسبية للأيونات إلى التيار الكلي. هنا نحن تجسد فحص أيون الانتقائية ل أنيون-ترانزلاتيونرودوبسين من بروتيوموناس سولكاتا ( بس ACR1) ²² ^، ²³ عن طريق تسجيل العلاقات الجهد الحالي تحت مختلف تركيزات كلوريد خارج الخلية لإثبات ارتفاع كلوريد تصرف.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-protocol-1
الشكل 1: الإعداد التصحيح المشبك. (1) مصدر الضوء، (2) الألياف البصرية، (3) برمجة مصراع، (4) محول الأرقام، (5) سائق مصراع، (6) مكبر للصوت، (7) نظام نضح، (10) قفص فاراداي و (11) مرحلة مجهر و (12) مدخل نضح و (13) مخرج نضح و (14) غرفة تسجيل و 15 مستشعر مستوى السائل و 16 قطب حمام مع جسر اجار، (18) هيدستيج، (19) ميكرومانيبولاتور، (20) المجهر المقلوب، (21) السكن مصباح المجهر، (22) امدادات الطاقة مصباح المجهر، (23) أنبوب مليء بالماء U- صمام، (25) الجدول المضادة للاهتزاز، (26) كاميرا كسد. ( A ) صور و ( B ) التمثيل التخطيطي للإعداد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من tرقمه.

1. الإعداد قبل تسجيلات

	داخل.	extra.1	extra.2
	كلوريد عالي	كلوريد عالي	كلوريد منخفض
	c [مم]	c [مم]	c [مم]
نا-ASP	0	0	140
كلوريد الصوديوم	110	140	0
بوكل	1	1	1
CSCL	1	1	1
كاكل ₂	2	2	2
مغكل ₂	2	2	2
HEPES	10	10	10
EGTA	10	0	0
الرقم الهيدروجيني	7.2	7.2	7.2
الأسمولية	290 مسم	320 مسم	320 مسم

الجدول 1: التركيب الأيوني للحلول المخزنة مؤقتا. تكوين داخل الخلايا (داخل). وخارجية (إضافية.) مخازن للتجارب انتقائية الكلوريد في خلايا هيك. الاختصارات المستخدمة: إثيلين غليكول تيتراسيتيك أسيد (إغتا)، 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبيرازينيثانسولفونيك أسيد (هيبيس) و أسبارتاتي (أسب). جميع التركيزات هي في ملي.

إعداد حلول التسجيل مع تركيزات أيون كما هو مبين في الجدول 1.
1. إعداد 15 مل من 2 M حلول الأسهم في الماء عالى النقاء ل مغكل ₂ ، كاكل ₂ ، بوكل و سكل.
2. وزن المكونات الصلبة ل 100 مل من الخلايا و500 مل من الحلول المخزنة خارج الخلية وفقا للجدول 1 في أكواب منفصلة وإضافة كمية منها من حلول الأسهم استعداد بعد ذلك. على سبيل المثال، لعازلة داخل الخلايا، واستخدام 0.3803 ز (10 ملم) إغتا، 0.2383 ز (10 ملي) هيبيس و 0.6428 ز (110 ملم) كلوريد الصوديوم وإضافة 100 ميكرولتر من 2 M مغكل ₂ و كاكل ₂ و 50 ميكرولتر من 2 M بوكل و سكل حلول الأسهم.
3. إضافة الماء عالى النقاء وضبط بعناية الرقم الهيدروجيني باستخدام الأحماض والقواعد، والتي لا تتداخل مع القياس، أي لا تجري من قبل شر، مثل حامض الستريك و N- ميثيل- D- الجلوكامين (نمغ ⁺ ).
4. ضبط الأسمولية إلى 290 مسم لداخل الخلايا و 320 مسم للحصول على حلول خارج الخلية مع الجلوكوز.
  ملاحظة: حلول الخلايا هيبوزموتيك قليلا زيادة نسبة النجاح من الترقيع ²⁶ .
5. تصفية معقمة جميع الحلول من خلال مرشحات 0.22 ميكرون. تخزين الحلول في 4 درجات مئوية لمدة أسبوعينs أو تجميد في -20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
حساب إمكانات تقاطع السائل وإعداد بروتوكولات تسجيل.
ملاحظة: تغيير تركيز كلوريد خارج الخلية بعد إنشاء تكوين خلية كاملة يسبب إمكانية كبيرة تقاطع السائل (لجب) التي يجب تصحيحها ²⁷ ^، ²⁸ . لجبس يمكن قياسها مباشرة أو حسابها، وهنا يتم استخدام الخيار الأخير. في هذا البروتوكول، وسوف تستخدم على الخط تصحيح تطالب بروتوكول تسجيل واحد لكل عازلة مؤقت. ومع ذلك، لمجموعة أكبر من الحلول الخارجية ينصح تصحيح آخر من لجب لتجنب تصحيح كاذب.
1. فتح تقاطع المحتملة آلة حاسبة (جيك) ²⁷ وفتح الحوار "تجربة جديدة". ثم حدد "التصحيح المشبك القياسات". حدد "القياسات خلية كاملة"، "معيار الملح الملح الكهربائي" ودخول درجة حرارة25 درجة مئوية. بين كل خطوة، والمضي قدما من خلال قبول اختيار عن طريق الضغط على زر "التالي".
  ملاحظة: يتم إجراء التجارب في درجة حرارة الغرفة من 25 درجة مئوية في مختبر مكيفة الهواء. تأكد من أن حلول المخزن المؤقت لها درجة حرارة الغرفة قبل بدء التجارب. لتغيير درجة حرارة العينة مرحلة الحضانة أو غرفة يمكن استخدامها. يمكن قياس درجة حرارة الحمام في كثير من الأحيان مع ميزان الحرارة.
2. إضافة جميع أنيون الفردية والتركيز الموجبة من محلول بيبيتد والعازلة كلوريد عالية وفقا لتركيزات المدرجة في الجدول 1 .
  ملاحظة: سوف جيك حساب لجب من -0.5 مف لظروف البداية.
3. انقر على "جديد حمام الحل" للدخول في تكوين الأيونية الموجبة من المخزن المؤقت كلوريد منخفضة.
  ملاحظة: سوف جيك الآن حساب لجب جديد من +12.6 مف وفقا لتغير حل تسجيل خارج الخلية.
4. إعداد اثنين من لبب تصحيح البروتوكولات لشرطين قياس بطرح لجب محسوبة من إمكانية عقد تطبيقية؛ -0.5 مف ل عالية و +12.6 مف للحلول الخارجية كلوريد منخفضة. وهكذا تبدأ البروتوكولات مع -79.5 مف (كلوريد عالية) و -92.6 مف (انخفاض الكلوريد)، على التوالي للحصول على لجب تصحيح بدء انطلاق إمكانية -80 مف في كلتا الحالتين.
  ملاحظة: تنطبق الخطوات التالية على برنامج الحصول على البيانات المذكورة في قائمة المواد.
5. افتح محرر البروتوكول في برنامج الاستحواذ. التبديل إلى "وضع" القائمة حدد "التحفيز العرضي" وتشمل 7 الاحتلالات.
6. التبديل إلى "الموجي" القائمة في المحرر وتشمل فترة 200 مللي ثانية مع 0 مللي أمبير عقد المحتملة تليها فترة 2 ثانية مع متفاوتة عقد محتملة ابتداء من -79.5 مف لكلوريد عالية. وتشمل "مستوى دلتا" من 20 مف للفترة الثانية لزيادة إمكانية عقد من قبل 20 مف في كل اكتساح.
7. ضمن خطوات الجهد من الموجي إدإيتور تطبيق فترة 500 مللي ثانية من الإضاءة مع 540 نانومتر ضوء (3.10 ميغاواط / مم ²). وللقيام بذلك، قم بتغيير "نمط البتات الرقمية" للمصراع المتصل الذي يتحكم في مصدر الضوء ليصبح نشطا مس 500 بعد الفترة الثانية الموصوفة أعلاه (انظر 1.2.6).
  ملاحظة: شدة الضوء يمكن أن تؤثر على الخصائص الفيزيائية الحيوية للتيارات قناة مثل السعة أو التعطيل. ولذلك، ينبغي دائما الإبلاغ عن كثافات الطاقة الخفيف. لقياس قوة الضوء بعد المرور من خلال جميع البصريات وساترة، واستخدام مقياس المعايرة معايرة. لحساب كثافة القدرة، حدد حقل مضيئة للهدف من قبل ميكرومتر كائن وتقسيم قوة الضوء المقاسة من قبل حقل مضيئة المحدد.
8. حفظ بروتوكول حل كلوريد عالية خارج الخلية. تعديل البروتوكول واستبدال المستوى الأول محتملة من قبل -92.6 مف (كلوريد خارجي منخفض). حفظ هذا البروتوكول الثاني لقياس انخفاض كلوريد حالة خارج الخلية.
9. ليسين طلاء من زلات غطاء الزجاج وفقا للبروتوكول تكييفها ²⁹ .
  1. وضع عدة 100 زلات تغطية في طبق بتري الزجاج وإضافة 250 مل حمض الهيدروكلوريك (1 N).
  2. وضع طبق بتري مع زلات غطاء على شاكر الخطي ويهز في 120 دورة في الدقيقة لمدة 72 ساعة لتنظيف زلات الغطاء وبعد ذلك شطف مع الماء عالى النقاء لتحييد الرقم الهيدروجيني.
  3. نقع هذه في حجم صغير من الايثانول 95٪ لمزيد من التنظيف.
    ملاحظة: يمكن تخزين زلات غطاء نظيفة في الايثانول 70٪ قبل المتابعة. العمل تحت غطاء تدفق الصفحي للخطوات التالية.
  4. باستخدام الموقد بنسن وملاقط، لهب كل غطاء زلة ونقله إلى طبق بتري جديد.
  5. احتضان زلات غطاء الزجاج مع عقيمة 50 ميكروغرام / مل حل بولي- D- يسين لمدة 1 ساعة على الأقل (أو بين عشية وضحاها) في درجة حرارة الغرفة بينما يهز مع شاكر الخطي في 150 دورة في الدقيقة.
  6. غسل زلات غطاء مع الماء عالى النقاء لإزالة الزائد بولي-D- يسين.
  7. نشر زلات غطاء على ورقة معقمة لتجف لمدة 10 دقيقة، وتعريضهم للأشعة فوق البنفسجية للتعقيم (على الأقل 20 دقيقة).
  8. جمع زلات غطاء في طبق بتري معقمة مغطاة في رقائق الألومنيوم حتى الاستخدام.
10. إعداد الحمض النووي لجين ACR1 بس تنصهر ل مشيري باستخدام تقنيات البيولوجيا الجزيئية القياسية.
  1. استنساخ الإنسان كودون الأمثل تسلسل الجينات ترميز بس ACR1 في البلازميد بيغف-C1 (سمف المروج، مقاومة كاناميسين) في الإطار مع مشيري فلورفور باستخدام الإنزيمات تقييد أو غيرها من أساليب الاستنساخ المعمول بها.
    ملاحظة: فلوروفوريس أخرى يمكن استخدامها كذلك، ولكن تأكد من أن يكون المقابلة مرشح مجموعات المتاحة لمراقبة مضانهم تحت المجهر في الإعداد.
  2. تحويل الحمض النووي البلازميد إلى خلايا كيميائية XL1Blue E. كيمي من خلال صدمة الحرارة وفقا للبروتوكول القياسية وصفيحة على لوحات أجار (30 ميكروغرام / مل كانامايسين) ³⁰ سوب>. تنمو البكتيريا مطلي خلال الليل عند 37 درجة مئوية.
  3. في اليوم التالي، تطعيم 4 مل مستخلص مرق ليسوجيني تستكمل مع 30 ميكروغرام / مل كانامايسين مع خلايا من مستعمرات واحدة واحتضان لهم خلال الليل عند 37 درجة مئوية و 180 دورة في الدقيقة في حاضنة.
  4. بعد الحضانة بين عشية وضحاها، وتنقية الحمض النووي البلازميد من الثقافات باستخدام عدة متوفرة تجاريا (انظر المواد الجدول ) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
11. البذور الخلايا
  ملاحظة: تنفيذ الخطوات تحت غطاء محرك السيارة تدفق الصفحي.
  1. وضع ما يصل إلى ثلاثة ليسين المغلفة غطاء الزجاج زلات جنبا إلى جنب في طبق بتري 35 ملم.
    ملاحظة: اضغط بلطف لهم على الجزء السفلي من الطبق لمنع الانزلاق على بعضها البعض.
  2. البذور 1.5 × 10 ⁵ خلايا هيك في 2 مل معيار دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (دمم) تستكمل مع 10٪ مصل بقري الجنين (فبس) في كل طبق.
  3. ملحق جميع عبر شبكية العين فيتركيز النهائي من 1 ميكرومتر. تنمو الخلايا لمدة يوم واحد على الأقل قبل الشروع في الخطوة 1.6.
12. ترانسفيكت عابر الخلايا عبر ليبوفكتيون ³¹ .
  1. لكل طبق من الخلايا، وإعداد حل من 2 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد (كما أعدت في الخطوة 1.4) في 250 ميكرولتر دمم دون فبس و 6 ميكرولتر ترنسفكأيشن كاشف (انظر المواد الجدول ).
  2. بعد 15 دقيقة من الحضانة، بلطف (قطرة قطرة) إضافة الحل إلى الخلايا.
13. إعداد الجسور أجار
  1. إضافة 0.75 غرام أغاروس إلى 50 مل محلول كلوريد الصوديوم العقيمة (140 ملم) وحله عن طريق التسخين في الميكروويف.
    ملاحظة: 2 - 3 M بوكل ل أجار إعداد الجسر يقلل أيضا لجب بسبب تركيز أعلى (على سبيل المثال نشر مستمر من الجسر) والحركة على قدم المساواة من K ⁺ و كل ^- أيونات، ولكن تم تجنب لتقليل أيون (وخاصة كل ^- ) تسرب إلى t انه حل الحمام ³² .
  2. ملء 10 ميكرولتر نصائح ماصة (أو خرطوم قطره صغير) مع محلول الاغاروز السائل باستخدام حقنة.
    ملاحظة: تجنب فقاعات الهواء في الجسر.
  3. بعد أن تم تبريد الجسور أجار وترسيخها، وتخزينها في العقيمة 140 ملي محلول كلوريد الصوديوم.
14. إعداد تسجيل وأقطاب حمام.
  1. إزالة الأسلاك الفضية للحمام وتسجيل القطب من الإعداد التصحيح المشبك.
  2. البولندية الأسلاك مع الصنفرة لإزالة كلوريد الفضة من التجارب السابقة. تزج الأسلاك الفضية النظيفة في 3 M بوكل وتوصيله إلى القطب الموجب للبطارية 1.5 V للطلاء كهربائيا مع كلوريد الفضة.
    ملاحظة: يمكن استخدام مصدر طاقة المختبر بدلا من البطارية.
15. سحب ماصات التصحيح مقاومة منخفضة (1.5-3.0 MΩ) من الشعيرات الدموية الزجاج مع مجتذب ميكروبيبيت والنار تلميعها كما هو موضح من قبل براون وآخرونلاس = "كريف"> 33. تخزين ماصات الغبار خالية ليوم القياس.
16. تشغيل جميع مكونات الإعداد لتسخين حتى درجة حرارة العمل 30 دقيقة التسجيلات السابقة. تأكد من أن المخازن المؤقتة في درجة حرارة الغرفة.
2. سيلكتيفيتي القياسات
1. بدء التسجيلات 24 إلى 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن عابر من الخلايا وصفها في 1.6.
2. وضع زلة غطاء واحد في غرفة القياس وختم عليه مع السيليكون لمنع تسرب العازلة الخارجية. تخزين طبق بتري مع زلات تغطية أخرى في حاضنة للمجموعة التالية من التجارب.
3. ملء بعناية الغرفة مع العازلة خارج الخلية (عالية [كل ^- ]) لمنع فصل الخلايا، ثم وضعه تحت المجهر واستخدام الهدف 40X لتصور الخلية.
4. وضع جسر أجار فوق القطب حمام ووضعه في غرفة جنبا إلى جنب مع جهاز استشعار مستوى السائل ومخرج نضح من معالج الحمام.
5. تبادل إكسحل الخلوي مرتين مع 1 مل من محلول خارجي جديد (عالية [كل ^- ]) لإزالة وسط الاستزراع المتبقية والخلايا منفصلة.
6. جعل الخلايا في التركيز والبحث عن خلية ترانزفكتد (الفلورسنت)، الذي يحتاج إلى أن تكون معزولة عن الخلايا الأخرى. استخدام الثلاثي النطاق مرشح مجموعة والبرتقالي ضوء (590 نانومتر، عرض النطاق الترددي 15 نانومتر، كثافة 100٪) لإثارة وتصور مشيري.
  ملاحظة: خلايا هيك يمكن أن يقترن كهربائيا لجيرانهم عن طريق تقاطعات الفجوة ³⁴ مما أدى إلى انخفاض مقاومة الغشاء في تكوين خلية كاملة.
7. ملء واحدة من ماصات سحبت مع حل الخلايا وإزالة فقاعات الهواء عن طريق التقليب ماصة عدة مرات.
8. جبل ماصة على حامل ماصة وتطبيق بعض الضغوط الإيجابية لمنع انسداد الطرف.
9. تحديد موقع غيض من ماصة التصحيح تحت المجهر والتنقل على مقربة من الخلية باستخدام ميكرومانيبولاتور.
  ملاحظة: تنطبق الخطوات التالية علىمكبر للصوت، والحصول على البيانات وتقييم البرمجيات المذكورة في قائمة المواد.
10. بدء "اختبار الغشاء" في برنامج الحصول على البيانات وتطبيق خطوة الجهد (نبض الاختبار؛ على سبيل المثال 5 مف ل 10 مس، خط الأساس في 0 مف)، يدويا أو تلقائيا عن طريق برنامج محدد باستخدام "وضع حمام" أثناء تشغيل "اختبار الغشاء" في برنامج الحصول على البيانات.
11. تحقق من أن المقاومة ماصة في النطاق المطلوب (1.5-3.0 MΩ).
12. صفر تعويض التيارات عن طريق تعديل إمكانية ماصة عن طريق تحويل مقبض ماصة تعويض في مكبر للصوت أثناء العمل في "وضع حمام" من "اختبار الغشاء".
13. إنشاء التصحيح في تكوين خلية كاملة ²⁶ .
  ملاحظة: الخطوات التالية تتطلب تطبيق الضغط الإيجابي والسلبي تسليمها إلى ميناء الجانب من حامل ماصة المستخدمة. ويمكن القيام بذلك عن طريق استخدام حقنة، عن طريق قطعة الفم أو يخدع إلكترونيامنظم الضغط. في هذا البروتوكول يتم تطبيق الضغط الإيجابي والسلبي عن طريق قطعة الفم.
  1. ببطء الاقتراب من الخلية مع ماصة التصحيح من أعلى وتخفيف الضغط الإيجابي الحق قبل لمسها.
    ملاحظة: عندما طرف قريب من الخلية، المقاومة سوف ترتفع قليلا؛ ويشار إلى ذلك من خلال انخفاض حجم نبض الاختبار.
  2. تغيير "اختبار الغشاء" من "وضع حمام" إلى "وضع التصحيح" وبالتالي القدرة على عقد المحتملة لاستعادة الخلايا المحتملة (-30 إلى -40 مف).
  3. في بعض الحالات تكوين الخلية المرفقة تشكل نفسها بعد الافراج عن الضغط الإيجابي (2.13.1)، إن لم يكن، وتطبيق بلطف الضغط السلبي للمساعدة في تشكيل القحز.
    ملاحظة: يتم إنشاء التكوين المرفقة الخلية عندما يتم تخفيض نبض الاختبار إلى قمم اثنين بالسعة الصغيرة في بداية ونهاية النبض ومقاومة الغشاء في نطاق G؛. الفولتية السلبية تصل إلى -60 مف mإايت تسهيل تشكيل الجيجاسي.
  4. تعويض السعة ماصة عن طريق تحويل "ماصة السعة تعويض" المقابض للحصول على استجابة مسطحة من نبض الاختبار.
  5. تمزق التصحيح دون تدمير الختم عن طريق تطبيق نبضات قصيرة من الضغط السلبي أو الضغط السلبي مع زيادة القوة، للحصول على التشكل خلية كاملة.
    ملاحظة: الانتقال الناجح من خلية تعلق على تكوين خلية كاملة يشار إليه بزيادة القمم بالسعة.
  6. تطبيق سلسلة المقاومة التعويض عن طريق وضع كامل خلية المعلمة والتعويضات التعديلات من مكبر للصوت المستخدمة لقط دقيقة من الغشاء المحتملة إلى الجهد عقد المطلوب.
    1. تبديل "اختبار غشاء" إلى وضع "خلية كاملة"، في لوحة "تعويض المقاومة سلسلة" بدوره على "التنبؤ" و "تصحيح" تصل إلى 90٪ تجنب أوفيرشوتس والتذبذب للاستجابة بالسعة، وتحويل خلية كاملةالتبديل التعويضي على وضبط المعلمات خلية كاملة مع المقابض اللوحة الأمامية المناسبة ("قدرة الخلية الكاملة" و "سلسلة المقاومة") من مكبر للصوت بطريقة تكرارية للحصول على استجابة ختم اختبار شقة بشكل مثالي.
      ملاحظة: للحصول على وصف تفصيلي للتعويض المقاومة سلسلة وتصحيح الرجوع إلى دليل مكبر للصوت أو المبدأ التوجيهي لأن هذا الإجراء يختلف بين مختلف المصنوعات.
  7. بعد إنشاء التكوين خلية كاملة، انتظر 2 دقيقة على الأقل قبل تسجيل لضمان استبدال كاف من حل الخلايا من خلال ماصة التصحيح ³⁵ .
14. سجل التيارات التي يسببها ضوء في إمكانات عقد مختلفة باستخدام البروتوكولات التي تم الإعداد سابقا (في 1.2).
15. تبادل العازلة خارج الخلية إلى انخفاض [كل ^- ] في الغرفة خمس مرات على الأقل دون تدمير التصحيح وتسجيل آخر الجهد الحالي الجهد ( راجع الخطوة 1.2) في رانه تركيز الكلوريد الجديد.
  ملاحظة: نظام نضح لتبادل العازلة الآلي يسهل هذه العملية، ولكن ليس من الضروري.
16. كرر 2.15. لكل حالة الأيونية لفحصها، ولكن التحقق مرارا وتكرارا نوعية التصحيح بين القياسات من قبل "اختبار الغشاء" المذكورة أعلاه.
  ملاحظة: لضمان دقة غشاء الجهد ومستقرة داخل الخلية يجب أن تكون المقاومة أيون تكوين غشاء فوق 500 MΩ في حين أن مقاومة الوصول يجب أن لا تتجاوز 10 MΩ، انظر . 2.12.6). لا ننسى أن تبديل كامل خلية تعويض المعلمة قبالة لاختبار الغشاء.
17. كرر 2.2. إلى 2.15. لعدة خلايا، ولكن تأخذ زلة تغطية جديدة لكل سلسلة اختبار لضمان صحة الخلايا.
3. تقييم البيانات
1. ضبط خط الأساس لكل تتبع الحالي عن طريق طرح المتوسط الحالي قبل الإضاءة.
2. حساب متوسط فوتوكرنت ثابتة _{s ق} ( ملاحظة: تحليل ذروة فوتوكرنتس أو تختلف طول المتوسط لتحديد فوتوكرنت ثابتة اعتمادا على بروتوكول أو سؤال علمي.
3. كرر الخطوات 3.1) و 3.2) لجميع الظروف اختبار وخلايا مختلفة.
4. رسم فوتكرنتس يحدد مقابل إمكانات عقد منها.
  ملاحظة: إذا تم حساب متوسطات متعددة، يمكن تطبيع التسجيلات الفردية إلى حالة محددة أو السعة للخلية.
5. تقاطع العلاقة الجهد الحالي مع محور الجهد يمثل إمكانية عكس (صافي الحالي هو صفر). تحديد ذلك عن طريق الاستيفاء الخطي بين نقاط البيانات المجاورة اثنين.
  ملاحظة: إذا لم يكن هناك انقلاب قطبية من فوتوكرنتس، استقراء خطيا من آخر نقطتين قريبة من الصفر للحصول على تقريب من نقطة التقاطع.
6. متوسط rوإمكانات ظهري لنفس الظروف ومؤامرة لهم ضد تركيز الكلوريد من الحلول العازلة الخارجية ( راجع الشكل 2B ).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويبين الشكل 2 النتائج التمثيلية التي تم الحصول عليها من القياسات التالية بروتوكول وصفها. خلال الإضاءة مع الضوء الأخضر، بس ACR1 يتميز تيار عابر سريع الذي يتحلل بسرعة إلى مستوى ثابت الحالي. بعد أن يتم إيقاف الضوء، فوتوكرنتس تسوس إلى الصفر في غضون ميلي ثانية ( الشكل 2A ). تبادل تركيز كلوريد خارج الخلية يسبب تحولا في إمكانية انعكاس التي يمكن رؤيتها مباشرة في آثار فوتوكرنت المكتسبة. تقييم إمكانات انعكاس من قياس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحديد إمكانات عكس في ظروف الأيونية والكهربائية محددة يوفر معلومات عن الأنواع الأيونية المنقولة بعد تفعيل الضوء من شر. إذا تنوعت الأنواع الأيونية حصريا في وسط فسيولوجي معقد، وتحولت إمكانية الانعكاس التي تم الحصول عليها وفقا لإمكانية نيرنست النظرية، فإن هذا النوع من الأيونات هو النوع الوحيد المنقول.

ومع ذلك، بالنسبة ل شرس، والتحولات المحتملة عكس عادة ما تكون أقل وضوحا مما كان متوقعا من معادلة نيرنست بسبب نفاذية لمخ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر مايلا ريه، ثارسانا ثارمالينجام وخاصة ألتينا كلاين للمساعدة التقنية الممتازة. وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة البحوث الألمانية (SFB1078 B2، FOR1279 SPP1665 إلى ف) ومجموعة المفاهيم الموحدة التميز في الحفز، ونيكات، بيج-نس (جف) و E4 (ف).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
خلايا HEK293	Sigma Aldrich	85120602	خلايا الكلى الجنينية البشرية
الشبكية	Sigma Aldrich	R2500
بالكامل فوجين HD	Promega	E2312	كاشف التعداء
DMEM	Biochrome	FG 0445	جسور Dulbecco المعدلة النسر المتوسط
Agarose	Roth	3810	جسور أجار
CaCl_{2< / sub>}	Roth	5239	CaCl_{2< / sub> 2H_{2< / sub>O}}
CsCl	Biomol	2452
EGTA	Roth	3054
FBS	Biochrome	S0615	زراعة الخلية
الجلوكوز	روث	HN06	D (+) - الجلوكوز
KCl	روث	6781
MgCl_{2< / sub>}	Roth	2189	MgCl_{2< / sub> 6H_{2< / sub>O}}
كلوريد الصوديوم	روث	3957
NMG	سيجما ألدريتش	M2004	N-Methyl-D-glucamine
Na-Aspartate	Sigma Aldrich	A6683	L-Aspartic حمض الصوديوم ملح أحادي الهيدرات
حمض الستريك	Roth	6490
AgeI	ThermoFischerScientific	ER1462	إنزيم التقييد
XhoI	ThermoFischerScientific	ER0695	إنزيم التقييد
NheI	ThermoFischerScientific	ER0975	إنزيم التقييد
XL1Blue E. القولوني< em>	Agilent Technologies	200249	Chemoefficient E. القولوني< em>
Kanamycin	Roth	T832
مرق Lysogeny متوسط	Roth	X964
Agar-Agar	Roth	6494	لوحات أجار
طقم تنقية البلازميد	Marchery-Nagel	740727.25
Penicilin / Streptomycin	Biochrome	A 2213	ثقافة الخلايا
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma Aldrich	P6407-5MG	غطاء زلة
طلاء Microforge	مخصص تلميع		الحريق
الماصات المصلية	TPP		أحجام
مختلفة مقعد نظيف	Kojair	Biowizard SL130
Stirrer	IKA	RCT منتجات علوم الأسلاك الفضية الكلاسيكية
		AG-T25 ؛ أقطاب AG-T10	، 0.64 مم (حمام) 0.25 مم (قطب كهربائي)
مقياس الأس الهيدروجيني		الكالماريتري
	Vogel	OM 815
مجهر	كارل زايس	ID03	حاضنة تلميع الحرائق
CO_{2< / sub> حاضنة}	الموثق	CB150
أطباق ثقافة الخلية	TPP	93040	34 مم داخلي قطر
غطاء زلات	روث	P232	15 مم قطر
ميزان الحرارة	R & ouml; السفينة Messtechnik	MTM12
Beamsplitter	Chroma	21011	90/10
حامل ماصة	الحركة ALA Scientific Instruments	PPH-1P-AXU-0-1.5
	الأجهزة الجزيئية	CV203BU
مكبر	الأجهزة الجزيئية
أجهزة جزيئية محول الأرقام		DigiData1400	محول تناظري رقمي
Lightsource	TILL Photonics	Polychrome V	ضبط على 540 نانومتر بكثافة كاملة
مجهر	كارل زايس	أكسيفرت 100
مصراع	فنسنت أسوشيتس	VS25
سائق مصراع	فنسنت أسوشيتس	VCM-D1
زجاج كابيلاريز	وارنر إنسترومنتس	G150F-3	الشعيرات الدموية بورسليكات مع نهايات مصقولة بالنار OD 1.5 مم ID & nbsp; 0.86 مم
مجتذب ماصة	دقيقة أدوات Sutter	P1000
معالج الحمام	Lorenz Messger & auml ؛ tebau	MPCU
ثلاثي النطاق مجموعة المرشحات	Chroma	69008	مرشح مضان ECFP/EYFP/mCherry
كاميرا CCD	Watec	Wat-221SCCD
Optometer	Gigahertz Optik	P9710	قياس شدة الضوء
الموضوعية	Carl Zeiss	421462-9900-000	W Plan-Apochromat 40X / 1.0 DIC
Micromanipulator	Scientifica	PatchStar
غرفة التسجيل
امدادات	الطاقةManson	HCS-3202	يتجنب الضوضاء الكهربائية من المجهر المدمج في إمدادات الطاقة
الاهتزاز طاولة معزولة	نيوبورت	M-VW-3636-OPT-01
قفص فاراداي	مخصص أو أي خراطيم طاولة
	تجارية أي كومرسيال ؛ على سبيل المثال روث		أحجام ومواد مختلفة للتعامل مع الحمام وتطبيق ضغط الماصة ؛ جسور أجار
خطية شاكر	Sunlab Instruments	SU 1000
آلة حاسبة محتملة للتقاطع السائل	الأجهزة الجزيئية أو مباشرة من برنامج Peter H. Barry		يتم تضمينه في برنامج اقتناء Clampex أو يمكن الحصول عليها من p.barry@unsw.edu.au
برنامج الحصول على البيانات	الأجهزة الجزيئية	Clampex 10.X
برنامج تقييم البيانات	الأجهزة الجزيئية	Clampfit 10.X
Ps< / em>ACR1	GenBank أو Addgene	KF992074.1 أو Addgene plasmid # 85465	ترميز الجينات ل Ps< / em>ACR1
دليل	مضخم الأجهزة الجزيئية	دليل المحور العصبي

شبكية العين 765 مقياس التناضح ناقل للصوت AxoPatch200B مخصص مطابقة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hegemann, P. Algal sensory photoreceptors. Annu. Rev. Plant Biol. 59, 167-189 (2008).
Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).
Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of contractile function in skeletal muscle. Nat. Commun. 6 (7153), 1-8 (2015).
Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nat. Methods. 7 (11), 897-900 (2010).
Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).
Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr. Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
Li, X., et al. Fast noninvasive activation and inhibition of neural and network activity by vertebrate rhodopsin and green algae channelrhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (49), 17816-17821 (2005).
Ishizuka, T., Kakuda, M., Araki, R., Yawo, H. Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels. Neurosci. Res. 54 (2), 85-94 (2006).
Wietek, J., et al. Conversion of channelrhodopsin into a light-gated chloride channel. Science. 344 (6182), 409-412 (2014).
Berndt, A., et al. Structural foundations of optogenetics: Determinants of channelrhodopsin ion selectivity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 113 (4), 822-829 (2016).
Tsunoda, S. P., Hegemann, P. Glu 87 of Channelrhodopsin-1 Causes pH-dependent Color Tuning and Fast Photocurrent Inactivation. Photochem. Photobiol. 85 (2), 564-569 (2009).
Schneider, F., Gradmann, D., Hegemann, P. Ion selectivity and competition in channelrhodopsins. Biophys. J. 105 (1), 91-100 (2013).
Prigge, M. Über die elektrophysiologische Untersuchung und Entwicklung von farbverschobenen Kanalrhodopsinchimären aus der Grünalge Volvox carteri. , Diss. Humboldt-Universität zu Berlin. Available from: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:11-100203476 (2012).
Govorunova, E. G., Spudich, E. N., Lane, C. E., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. New Channelrhodopsin with a Red-Shifted Spectrum and Rapid Kinetics from Mesostigma viride. MBio. 2 (3), 1-9 (2011).
Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Li, H., Janz, R., Spudich, J. L. Characterization of a highly efficient blue-shifted channelrhodopsin from the marine alga Platymonas subcordiformis. J. Biol. Chem. 288 (41), 29911-29922 (2013).
Hou, S. -Y., et al. Diversity of Chlamydomonas Channelrhodopsins. Photochem. Photobiol. 88 (1), 119-128 (2012).
Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat. Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophys. J. 96 (5), 1803-1814 (2009).
Yizhar, O., et al. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. Nature. 477 (7363), 171-178 (2011).
Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. a, Hegemann, P., Deisseroth, K. Bi-stable neural state switches. Nat. Neurosci. 12 (2), 229-234 (2009).
Berndt, A., Lee, S. Y., Ramakrishnan, C., Deisseroth, K. Structure-Guided Transformation of Channelrhodopsin into a Light-Activated Chloride Channel. Science. 344 (6182), 420-424 (2014).
Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. Proteomonas sulcata ACR1: A Fast Anion Channelrhodopsin. Photochem. Photobiol. 92 (2), 257-263 (2016).
Wietek, J., Broser, M., Krause, B. S., Hegemann, P. Identification of a Natural Green Light Absorbing Chloride Conducting Channelrhodopsin from Proteomonas sulcata. J. Biol. Chem. 291 (8), 4121-4127 (2016).
Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Janz, R., Liu, X., Spudich, J. L. Natural light-gated anion channels: A family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics. Science. 349 (6248), 647-650 (2015).
Neher, E., Sakmann, B., Steinbach, J. H. The extracellular patch clamp: A method for resolving currents through individual open channels in biological membranes. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. 375 (2), 219-228 (1978).
Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. Arch. Eur. J. Physiol. 391 (2), 85-100 (1981).
Barry, P. H. JPCalc, a software package for calculating liquid junction potential corrections in patch-clamp, intracellular, epithelial and bilayer measurements and for correcting junction potential measurements. J. Neurosci. Methods. 51 (1), 107-116 (1994).
Amtmann, A., Sanders, D. A unified procedure for the correction of liquid junction potentials in patch clamp experiments on endo- and plasma membranes. J. Exp. Bot. 48, (Special) 361-364 (1997).
Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J. Vis. Exp. (63), e1-e18 (2012).
Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84 (21), 7413-7417 (1987).
Halliwell, J., Whitaker, M., Ogden, D. Using microelectrodes. Microelectrode Tech. Plymouth Work. Handb. 3, 1-15 (1949).
Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J. Vis. Exp. (20), e1-e2 (2008).
Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
Pusch, M., Neher, E. Rates of diffusional exchange between small cells and a measuring patch pipette. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. 411 (2), 204-211 (1988).
Berndt, A. Mechanismus und anwendungsbezogene Optimierung von Channelrhodopsin-2. , Diss Humboldt-Universität zu Berlin. Available from: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:11-100191266 (2011).
Prigge, M., et al. Color-tuned channelrhodopsins for multiwavelength optogenetics. J. Biol. Chem. 287 (38), 31804-31812 (2012).
Gradmann, D., Berndt, A., Schneider, F., Hegemann, P. Rectification of the channelrhodopsin early conductance. Biophys. J. 101 (5), 1057-1068 (2011).
Beppu, K., et al. Optogenetic countering of glial acidosis suppresses glial glutamate release and ischemic brain damage. Neuron. 81 (2), 314-320 (2014).
Wietek, J., Prigge, M. Enhancing Channelrhodopsins: An Overview. Methods Mol. Biol. 1408, 141-165 (2016).
Ferenczi, E. A., et al. Optogenetic approaches addressing extracellular modulation of neural excitability. Sci. Rep. 6, 1-20 (2016).
Zhang, F., et al. Red-shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox carteri. Nat. Neurosci. 11 (6), 631-633 (2008).
Sugiyama, Y., et al. Photocurrent attenuation by a single polar-to-nonpolar point mutation of channelrhodopsin-2. Photochem. Photobiol. Sci. 8 (3), 328-336 (2009).
Kleinlogel, S., et al. Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca2+-permeable channelrhodopsin CatCh. Nat. Neurosci. 14 (4), 513-518 (2011).
Wang, H., et al. Molecular determinants differentiating photocurrent properties of two channelrhodopsins from chlamydomonas. J. Biol. Chem. 284 (9), 5685-5696 (2009).
Gradinaru, V., Thompson, K. R., Deisseroth, K. eNpHR: a Natronomonas halorhodopsin enhanced for optogenetic applications. Brain Cell Biol. 36 (1-4), 129-139 (2008).
Berglund, K., et al. Luminopsins integrate opto- and chemogenetics by using physical and biological light sources for opsin activation. Proc. Natl. Acad. Sci. 113 (3), 358-367 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

HEK293

كامل خلية التصحيح المشبك تسجيلات لتحديد الكهربية من أيون الانتقائية في تشانلرودوبسينز

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة