الطيف الكتلي والنهج القائم Luminogenic للتميز المرحلة الأولى الاستقلابية الكفاءة من<em&gt; في المختبر</em&gt; الثقافات خلية

ملخص

الكفاءة التمثيل الغذائي في المختبر الأنظمة هو شرط أساسي لأحيائي والتصرف فيها المخدرات والمواد السامة. في هذا البروتوكول، وصفنا تطبيق تحقيقات إشارة التمثيل الغذائي لتقييم المرحلة الأولى التمثيل الغذائي في مزارع الخلايا.

الملخص

أنزيمات استقلاب أجنبي بيولوجيا تلعب وظيفة أساسية في التحول الأحيائي من الأدوية والمواد السامة بإضافة المجموعات الوظيفية التي تزيد من الذوبان وتسهيل إفراز. في بعض الأحيان تلك التعديلات الهيكلية تؤدي إلى تشكيل المنتجات السامة الجديدة. من أجل الحد من التجارب على الحيوانات، المخاطر الكيميائية يمكن تقييم استخدام الخلايا المختصة عملية الأيض. التعبير عن الأنزيمات الأيضية، ولكن، ليست مستقرة على مر الزمن في العديد من أنظمة ثقافة الأولية في المختبر وغالبا ما يكون جزئيا أو غائبة في خطوط الخلايا. ولذلك، ينبغي من الناحية المثالية أن تجرى دراسة الأدوية والمواد المضافة، والبيئية الأيض الملوثات في المختبر في النظم الخلية حيث اتسم النشاط الأيضي. نشرح هنا نهجا لقياس نشاط فئة من الإنزيمات الأيضية (المرحلة الإنسان I) في خطوط الخلايا 2D و 3D الثقافات الأولية باستخدام المجسات الكيميائية ومنتجاتها الأيضية القابلة للقياس من قبل UPLC قياس الطيف الكتلي وluminometry. ويمكن تنفيذ هذه الطريقة لاختبار النشاط الأيضي في خطوط الخلايا والخلايا الأولية المستمدة من مجموعة متنوعة من الأنسجة.

المقدمة

الأيض أجنبي بيولوجيا هو عملية يتم من خلالها تعديل المواد الكيميائية الأجنبية إلى الجسم عن طريق إضافة مجموعة ماء وتقارن لتسهيل إفراز من ^1. عادة عملية التمثيل الغذائي للالاكسيوبيوتك هو عملية من خطوتين مع المرحلة الأولى التي تتكون في الغالب من الأكسدة مع إضافة واحدة أو عدة مجموعات الهيدروكسيل ^{1 و 2.} في المرحلة الثانية، يتم استخدام مجموعة الهيدروكسيل كما يقبلون لالمترافقة ماء مثل غلوكورونيد أو شاردة كبريتات ^{1 و 2.} إذا كانت المجموعة متقبل هي بالفعل موجودة على الجزيئات، يمكن أن الخطوة الاقتران يحدث بشكل مستقل عن المرحلة الأولى الأيض. يتم تنفيذ كل رد فعل من قبل مجموعة محددة من الانزيمات، على سبيل المثال، CYPs (السيتوكروم P450s)، التي تحفز على الهيدروكسيل (الشكل 1) ونزع الألكلة من ركائز الكيميائية ^3. Conjugatioن ويحفزه sulfotransferases، UDP-glucuronosyltransferases (الشكل 1)، الجلوتاثيون-S-ترانسفيراز وN-acetyltransferases ^4. وسيكون لكل الأنسجة والأعضاء لديهم الأيض تعريف معين التعبير الانزيم، مع الكبد معربا عن معظم هذه البروتينات.

الشكل 1: مثال من المرحلة الأولى والمرحلة الثانية الأيض لالكومارين. CYP2A6 / CYP2A13 تحفيز-الهيدروكسيل 7 من الكومارين. ومترافق 7 hydroxycoumarin إلى شاردة غلوكورونيد من المرحلة الثانية الانزيمات UGTs، مع UGT1A6 وUGT1A9 تظهر أعلى نشاط.

فهم عملية التمثيل الغذائي للالاكسيوبيوتك أمر بالغ الأهمية في تقييم مأمونية الأدوية ولتقييم المخاطر الكيميائية وذلك لسببين: سوف حركية التفاعل تحديد متى دواء أو مادة كيميائية سوف تبقى في الجسم في شكل نشطة أو غير نشطة بإفراز efore. والمركب الأصلي يمكن تعديل إلى أنواع أكثر على رد الفعل، غير مستقر والسامة بواسطة أنزيمات التمثيل الغذائي. ردود الفعل هذه التي تعرف أيضا باسم "التنشيط الحيوي" هي التي تحرك معظمهم من المرحلة الأولى CYP الأنزيمات ولكن أيضا في مناسبات نادرة من المرحلة الثانية الاقتران ^5.

وبناء على هذا، فإن قدرة نموذجا في المختبر على التنبؤ بدقة المخاطر المرتبطة دواء أو مادة كيميائية تعتمد بشكل كبير على كفاءة التمثيل الغذائي للنظام الخلية. خطوط الخلايا المشتقة من الأنسجة المريضة أو من تحول الخلايا الطبيعية كثيرا ما تفقد جزءا إن لم يكن كل من الأيض الشخصي انزيم ممثل أنسجتهم من أصل ^6. الحفاظ على البيانات الشخصية انزيم الأيض الطبيعي يبدو أفضل في مزارع الخلايا الأولية (على الأقل في المدى القصير الثقافات) وتحسنت مرة أخرى إذا كانت الأنسجة مثقف في مصفوفة والسماح لها بالاحتفاظ هيكل 3D في ^1. ولذلك، فإن شارacterization من كفاءة التمثيل الغذائي في المختبر نظام خلية خطوة أولية هامة في توجيه القرار بشأن أي نموذج الخلية المناسب لإجراء تقييمات للسلامة الكيميائية.

في هذه الورقة نقدم بروتوكول لمحة عن النشاط والتعبير عن الانزيمات المرحلة الأولى CYP في المختبر مع أمثلة من تطبيقها مع خط الخلية الكبدية ⁷ و 3D الرئة الأولية الثقافات خلية ^8. موصوفة CYP ركائز محددة ومنتجاتها الأيضية والمانع الضوابط جنبا إلى جنب مع spectrometry- كتلة وأساليب القياس الكمي يستند luminogenic. منذ بعض CYPs هي محرض والبعض الآخر التأسيسي، كما سيتم إعطاء أمثلة لهذه السيناريوهات اثنين.

البروتوكول

ملاحظة: العمل العام لفحص النشاط الأيضي هو مبين في الشكل 2. كل خطوة من هذا العمل هو مفصل في وقت لاحق في الفقرات التالية. وترد جداول مفصلة من الكواشف والمعدات في جدول المواد.

الشكل 2: سير العمل لالاستقلابية مسبار الفحص. الخلايا هي المصنفة ونمت لكثافة كافية. قد تكون هناك حاجة لخطوة الاستقراء CYP اعتمادا على نشاط انزيم يعاير. وأضاف الركيزة التحقيق والمانع للثقافة الخلية. بعد فترة الحضانة، ويتم جمعها وسيلة لتحليل وهي lysed الخلايا لتقدير البروتين. تتم معالجة المتوسطة لتحليل المنتج الأيض الركيزة التحقيق التي كتبها الطيف الكتلي أو luminometry.إعلان / 55502 / 55502fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الثقافة 1. خلية

الشكل (3): نقل الضوء التجهير من خلية الكبدي الخط الثقافة. خط الخلية الموصوفة في هذا البروتوكول ⁵ تفرق عادة مع انشقاق 50٪ بين cholangiocytes وخلايا الكبد في الثقافة (100X). شريط مقياس = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

1. ثقافة خط الخلية الكبدية
   ملاحظة: تم استخدام المتاحة تجاريا خط الخلية الكبدية كمثال الخلايا المختصة عملية الأيض. وقد اشتق الخط خلية من سرطانة الكبد الناجم عن عدوى فيروسية ⁷. في confluency، وهذا خط الخلية يفرق في خلايا cholangiocyte- والكبدية مثل (الشكل 3) ومزيد من التفاصيل يمكن العثور عليها في Guillouzo ^7. إدراج 2٪ DMSO إلى مستنبت يدعم التفريق بين هذا الخط الخلية والتعبير عن مجموعة متنوعة من CYPs.
   1. إزالة قارورة المبردة مع الخلايا من النيتروجين السائل ووضع على الثلج الجاف للنقل. نقل cryovial إلى حمام الماء قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية لمدة 1-2 دقيقة، وتعقيم خارج القارورة مع الايثانول 70٪ قبل وضعها في غطاء تدفق الصفحي.
   2. بينما تعمل تحت ظروف معقمة، فتح بعناية القارورة المبردة لاطلاق سراح أي ضغط زائد وماصة محتويات القارورة المبردة في أنبوب 10 مل مليئة 9 مل من المتوسط ​​E استعد قبل ويليامز في 37 ° C.
   3. أجهزة الطرد المركزي الحل لمدة 10 دقيقة في 400 x ج في درجة حرارة الغرفة، ونبذ طاف، و resuspend الخلايا في 5 مل منالملكية المتوسطة ذوبان الجليد قبل تحسنت في 37 ° C، تستكمل مع الجلوتامين أو تكملة الجلوتامين (2 ملي تركيز النهائي) (وليامز 'E + الجلوتامين ملحق + ملاحق ذوبان الجليد).
   4. عدد خلايا قابلة للحياة باستخدام قسامة 500 ميكرولتر مع عداد الخلية أو أي تقنية عد الخلايا أخرى مناسبة.
   5. البذور الخلايا في 24 لوحة جيدا المغلفة الكولاجين في كثافة 0.6 × 10 ⁶ خلايا قابلة للحياة بشكل جيد / في الحجم النهائي من 0.5 مل من المتوسط ذوبان الجليد.
   6. وضع لوحة (ق) في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ / 95٪ CO ₂ / الهواء والرطوبة النسبية 100٪.
   7. 24 ساعة بعد البذر الخلايا، واستبدال المتوسطة مع 0.5 مل من قبل تحسنت صيانة / الأيض المتوسطة العاملة (ويليامز 'E + الجلوتامين ملحق + ملحق الأيض (هذه الوسيلة يحتوي بالفعل DMSO)). تغيير المتوسطة كل يومين.
   8. بعد بضعة أيام في الثقافة تشكل الخلايا هيكل تربيقية شبه متموجة (الشكل 3). الأيضية الأمثلوعادة ما لوحظ النشاط بين يوم 7 و 10 و هو أدنى مستوى في يوم 4.

الشكل 4: المقطع العرضي للخلايا الحنجرة الألسيان الأزرق المعشق نمت في واجهة الهواء السائل ^8.
مهدبة، وإنتاج المخاط والخلايا القاعدية هي واضحة للعيان. شريط مقياس = 250 ميكرون.

2. متباينة الثقافات ظهارة الهوائية
   ملاحظة: يتم عرض بروتوكول مع المتاحة تجاريا ظهارة الهوائية الأساسي متباينة تماما نمت في واجهة الهواء السائل على إدراج ⁸ (الشكل 4). ثقافة الأنسجة تحتفظ النمط الظاهري mucocilliary وقطبية خلية ^8. يمكن أن تكون الخلايا الأنف أو الأصل الشعب الهوائية. هنا، استخدام الخلايا الشمية الإنسان. يتم تسليم الخلايا على شكل لوحة الثقافة مع 24إدراج في واجهة الهواء السائل. لتسهيل النقل وتجنب تسرب المتوسط ​​يتم شحنها إدراج مع قسم القاعدية جزءا لا يتجزأ من مصفوفة الاغاروز مختلطة مع الثقافة المتوسطة.
   1. عند تسليم الخلايا، وتعقيم لوحات تحتوي على 24 إدراج مع حل الإيثانول 70٪ قبل وضعها في غطاء تدفق الصفحي نظيفة.
   2. إعداد العقيمة 24 لوحة جيدا بإضافة استعد قبل 700 ميكرولتر مستنبت الملكية.
   3. استخدام ملاقط معقمة نقل إدراج الخلية إلى لوحة جديدة محملة مسبقا مع المتوسط ​​عن طريق طرد بلطف إدراج من المصفوفة الاغاروز.
   4. وضع لوحة (ق) في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ / 95٪ CO ₂ / الهواء والرطوبة النسبية 100٪.
   5. كل يوم 2 نقل إدراج إلى جديدة معقمة 24-جيدا لوحة محملة مسبقا مع 700 ميكرولتر الدافئة الملكية مستنبت خلايا الشعب الهوائية.
   6. تقييم سلامة الأنسجة مجرى الهواء باستخدام أساليب، مثل مقاومة عبر الظهارية (طير)، أوفاز أهداب التردد (البرازيلي) باستخدام مجهر مزودة نظام التصوير فيديو حية ^9. يوصف قياس طير والبرازيلي في كوين ^10.

2. CYP آخر الكمي في مزارع الخلايا

ملاحظة: كقاعدة عامة، والمذيبات مثل DMSO والميثانول يمكن استخدامها لإعداد حلول الأوراق المالية للتحقيقات ومثبطات الأيض المختلفة الواردة في هذه الورقة. ومع ذلك، فمن المستحسن للحفاظ على تركيز DMSO النهائي في مستنبت إلى أدنى حد ممكن (1٪ أو أقل) منذ تركيزات عالية يمكن أن تمنع الإنزيمات الأيضية. عندما يكون ذلك ممكنا، فمن المستحسن أيضا لاستخدام أحمر الفينول الحرة والمتوسطة مجانا المصل خلال الحضانة مع تحقيقات التمثيل الغذائي منذ أحمر الفينول يمكن أن تتداخل مع CYPs ونشاط انزيم المرحلة الثانية والمكون المصل مثل الزلال يمكن أن تقلل من توفر التحقيق. وليس من الممكن دائما التقيد الصارم لهذه القواعد الارشادية. على سبيل المثال، المتوسطة الهوائية ثقافة الخلية الملكية ويحتوي على الفينول الأحمر. الملكية خط الخلية الكبدية الأيض المتوسطة ⁷ يحتوي بالفعل DMSO أعلى من 1٪ كما هو مطلوب منها للخلايا لاعتماد النمط الظاهري مثل الكبدية.

ملاحظة: وأخيرا، وهنا، يستخدم مصطلح محدد مسبار / المانع ولكن هذا المصطلح لابد من النظر بحذر. في الواقع، فمن النادر جدا لتحقيق التمثيل الغذائي ليكون الركيزة حصرية الانزيم. تحقيقات وصفها هنا، ومع ذلك، لديها قابلية عالية للهدف الانزيم، وبالتالي تعتبر كعلامات موثوقة من النشاط.

1. تحقيقات التمثيل الغذائي، المحرضات، ومثبطات
   1. تحقيقات باستخدام أساليب الطيف الكتلي على أساس
      ملاحظة: تحقيقات ومثبطات الموضحة في هذا القسم هي مناسبة لاختبار نشاط CYP2As ^11، CYP1A2 ^12،ووصف المرجع "> 13، CYP2B6 ^{7، 14،} CYP2F1 ^{15 و 16،} وCYP2E1 ¹⁷ بواسطة الطيف UPLC-الشامل. تحقيقات، ومثبطات CYP المقابلة في الجدول 1 مع المراجع المناظرة. يسرد الجدول 1 أيضا نتاج التمثيل الغذائي للCYP النشاط الذي كميا بواسطة مطياف الكتلة. كل عمل يستدعي الثقافة وحلول الأنسجة لاستخدامها في زراعة الأنسجة ليتم تنفيذها في نسيج الثقافة هود العقيمة. حل الأسهم يمكن أن تكون مستعدة في DMSO لجميع ركائز التحقيق.
      1. قبل التجربة إعداد مجموعتين من إدراج خلية أو الآبار، واستخدام سلسلة واحدة للتجربة تثبيط، والآخر لتحقيق التمثيل الغذائي فقط. إعداد سلسلة ثالثة من الخلايا كعنصر تحكم فارغة المتوسطة. ويمكن أن تكون على لوحات منفصلة أو في نفس لوحات مع ما لا يقل عن ثلاثة مكررات. مثال على لوحة يكمنمن يرد في الشكل (5).
      2. في يوم من التجربة، واستبدال مستنبت الخلية مع 450 ميكرولتر من متوسطة جديدة.
      3. إعداد في غطاء العقيمة تركيز 10X من الحلول التالية باستخدام مستنبت الخلية. مزيج 10X CYP التحقيق، 10X المانع CYP، والمانع 10X 10X CYP بالإضافة إلى التحقيق.
         ملاحظة: الحلول الأسهم ماجستير في المانع والتحقيق يمكن أن تكون مستعدة في 100٪ DMSO (على سبيل المثال، 1،000x الأسهم) وزيادة المخفف في وسائل الإعلام للحصول على حل 10X وذلك لتجنب تركيز DMSO نهائيا خلال فترة تتجاوز 1٪ مع ثقافة الخلية . وتظهر تركيزات 1X النهائية التي تهدف لالحضانة مع الخلايا في الجدول 1.
      4. تصفية حل 10X التحقيق مختلفة مع مرشح حقنة 0.2 ميكرون.
      5. إضافة 50 ميكرولتر من المتوسط ​​تحتوي على مثبط CYP 10X إلى سلسلة من الخلايا التي أعدت للتجربة تثبيط وقبل احتضان لمدة 30 دقيقة.
      6. Replace المتوسط ​​من الخلايا في سلسلة تثبيط مع 450 ميكرولتر من متوسطة جديدة وإضافة 50 ميكرولتر من المتوسط ​​تحتوي على كل 10X المانع CYP والركيزة 10X التحقيق.
      7. إضافة إلى الخلايا الأخرى 50 ميكرولتر من المتوسط مع لجنة التحقيق الركيزة 10x و إضافة مبلغ مساو من سيارة مخففة في المتوسط (على سبيل المثال، DMSO) للضوابط خلية فارغة كما هو موضح في الشكل (5).
      8. احتضان الخلايا لمدة 0-5 دقيقة (الوقت 0 والتحكم الخلفية) و 16 ساعة في حاضنة الخلية.
         ملاحظة: تم استخدام هذه المرة الحضانة بنجاح مع الخلايا الهوائية وخط الخلية الكبدية. لكن خلايا الكبد الأولية جديدة لديها الكفاءة الأيض عالية، في انتظار الجودة من إعداد الخلية والتركيب الجيني من الجهات المانحة، وبالتالي أقصر الأوقات (على سبيل المثال، 2-4 ح) قد تكون مناسبة. من المستحسن دائما لإجراء الوقت بالطبع التجربة عند اختبار خطوط الخلايا أو أنواع مختلفة من الخلايا.
      9. في نهاية فترة الحضانة، كولإلخ والمتوسطة في أنابيب المسمى منفصلة لتقدير حجم المنتج الأيضي للتحقيقات. تجميد المتوسطة للمعالجة في المستقبل.
      10. ليز الخلايا لتقدير البروتين.
          ملاحظة: أي قياسية عدة البروتين الكمي والبروتوكول هو مناسبة لهذه الخطوة. BCA هو خيار واحد مناسب. هذه الخطوة اختيارية في حالة وجود خلايا لاستخدامها في فحص آخر.
   2. العلاج المتوسطة
      ملاحظة: والمتوسطة التي تم جمعها من مرحلة الحضانة يحتوي على مادة كيميائية التحقيق الوالدين وكذلك منتجاتها الأيضية. لقياس النشاط CYP محددة فقط نتاج رد فعل يحفزه على CYP من الفائدة يجب أن يكون كميا. وغالبا ما يتم معالجة مرحلة المنتجات I التمثيل الغذائي جنبا إلى جنب مع المرحلة الثانية الأيض (الاقتران)، وبالتالي لا يمكن الكشف على هذا النحو. وهكذا من أجل الحصول على تقدير أدق لنشاط CYP، لا بد من خطوة deconjugation لإزالة أيالمرحلة الثانية الأيض التعديل. منذ اقتران المرحلة الأولى الأيض غالبا ما ينطوي على اقتران غلوكوروني أو الكبرتة، ويتحقق deconjugation عن طريق العلاج من العينات التي glucuronidases وsulfatases ^18. غلوكورونيداز والنشاط سلفاتاز هو الرقم الهيدروجيني تعتمد مع أعلى نشاط غلوكورونيداز تتحقق في درجة الحموضة 4،5-5،0 وسلفاتاز النشاط يجري أعلى مستوى عند درجة الحموضة 6،0-6،5. ولذلك، هذه الخطوة تتطلب تعديل درجة الحموضة. في وصف طريقة هنا، يمكننا قياس الرقم الهيدروجيني باستخدام شرائح الأس الهيدروجيني لأسباب عملية منذ تحقيقات متر معظم الرقم الهيدروجيني لا يصلح في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. شرائح الأس الهيدروجيني المتاحة تجاريا يمكن العثور عليها مع قرار منخفضة تصل إلى 0،3-0،2 درجة الحموضة وحدات.
      1. نقل 250 ميكرولتر من المتوسطة الحضانة إلى 1.5 مل microtube وإضافة 4 methylumbelliferone الداخلية حل الأسهم القياسية للوصول إلى تركيز النهائي من 100 نانومتر.
      2. ضبط درجة الحموضة من المتوسط ​​إلى 4،5-5،0 بإضافة 1 M حمض الهيدروكلوريك. إضافة 1 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك في وقت والتحقق من الرقم الهيدروجينيقبل pipetting 2 ميكرولتر من المتوسطة على شريط الأس الهيدروجيني. الوصول إلى الرقم الهيدروجيني من 5.0 سوف عادة لا تحتاج إلى أكثر من 5-10 ميكرولتر من 1 M حمض الهيدروكلوريك.
      3. إضافة 150 وحدة (1.8 ميكرولتر من 85،000 وحدة / مل الأسهم) من β غلوكورونيداز / الأريل سلفاتاز من اللولب pomatia واحتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. وقف رد الفعل من خلال إضافة 250 ميكرولتر من الميثانول الباردة (-20 ° C). تخزين العينات في -20 ° C أو عملية أخرى.
      4. تتبخر المذيب باستخدام جهاز للطرد المركزي فراغ في 45 ° C. إعادة تشكيل العينات مع 500 ميكرولتر من أسيتونتريل 30٪: المحلول المائي. العينات جاهزة للتحليل الطيف الكتلي ويمكن تخزينها في -20 درجة مئوية في قوارير أمبر غلاس.
   3. الطيف الكتلي الكمي القائم
      ملاحظة: جميع UPLC ومطياف الكتلة الإعدادات المفصلة في الجدول التكميلي مخصص 1. للاطلاع على تحليل الكمي، وإنشاء منحنى المعايرة هو مطلوب. كالييتم الحصول على منحنى bration عن طريق تشغيل مجموعة والتخفيف من المعروف المجمع ليكون كميا. في هذه الحالة، تم إنشاء منحنيات المعايرة أكثر من 10 تركيزات مختلفة (الجدول 2)، 6 منها على الأقل يجب أن يكون في غضون 20٪ من مجموعة خطية ^19. يتم تحديد أدنى مستوى للكشف كما أدنى تركيز مما يعطي إشارة أكبر من أو يساوي إلى 3x متوسط ​​إشارة الخلفية. يتم تحديد أدنى مستوى الكمي كما العينة من أدنى تركيز مما يعطي إشارة أكبر، أو يساوي من 10X متوسط ​​إشارة الخلفية على حد سواء والتي يتم تحديدها على الأقل 3 أشواط مستقلة مع عينات ثلاث نسخ.
      1. إعداد التخفيف المتسلسل من المستقلب الاصطناعية في مستنبت النسيج وفقا للجدول 2، بما في ذلك معيار الداخلية. A الحجم النهائي من 250 ميكرولتر في التخفيف هو معيار كاف.
      2. تتبخر التخفيفات المسلسل من مستوى كما هو موضح في الحادي والعشرينالجيش الشعبي 2.1.2.4 و resuspend في حجم 30٪ أسيتونيتريل: تعادل المياه إلى حجم وسائل الاعلام التبخر السابقة (على سبيل المثال، 250 ميكرولتر 30٪ أسيتونيتريل: الماء إذا كان الحل مستوى بدءا 250 ميكرولتر من المتوسطة).
      3. إضافة 250 ميكرولتر من كل مستوى التخفيف المتسلسل إلى العنبر UPLC قارورة زجاجية للحقن في الاوتوماتيكى UPLC-MS.
      4. إضافة عينات الاختبار (250 ميكرولتر) إلى العنبر قوارير UPLC ووضعها في الاوتوماتيكى UPLC.
      5. بطريقة عشوائية كل قارورة.
         ملاحظة: التكوين مطياف الكتلة استخدمنا عبارة عن هجين ثلاثي رباعي / الخطية مطياف الكتلة فخ أيون إلى جانب لUPLC مفصل في الجدول التكميلي 1. سوف منصات أخرى لديها برامج مختلفة والتكوين ولكنها تتبع خطوات مماثلة لأداء الكمي.
      6. تشغيل UPLC-MS باستخدام الإعدادات المفصلة في الجدول التكميلي 1 اعتمادا على التحقيق محدد لقياس.
      7. استعمالو"Quantitate - بناء طريقة الكميات" أداة في أدوات مطياف الكمي الجماعية (جدول المواد) لتوليد منحنى المعايرة من معيار الاصطناعية المكتسبة ومعيار الداخلية.
      8. استخدام "معالج الكميات" لتحديد دفعة العينة وعينات لتحديد وتنفيذ "أسلوب الكميات". يعرض البرنامج مطياف الكمي الشامل جدول مع القيم الكميات من مجمع هدف في كل عينة الاختبار.
   4. تحقيقات باستخدام أساليب التلألؤ على أساس
      ملاحظة: تحقيقات Luminogenic لقياس مجموعة من الأنشطة CYP متاحة تجاريا. ومع ذلك، ليست كلها مناسبة لفحوصات خلية القاعدة. هنا، يتم تقديم بروتوكولا لقياس نشاط CYP1A1 / CYP1B1. وقد تم اختيار CYP1A1 / 1B1 لتوضيح كيفية لفحص نشاط CYPs محرض وإعطاء مثال عن كيفية تحقيقات luminogenic يمكن استخدامها بوصفها المذبحالأصلي إلى أساليب تعتمد على مطياف الكتلة. ويلخص الجدول 3 تركيزات وحضانة وقت كنا للخلايا الشعب الهوائية وخط الخلية الكبدية. ومع ذلك، قد تضطر إلى أن تتكيف لأنواع الخلايا الأخرى تلك. هي تحقيقات luminogenic الأخرى المتاحة تجاريا، ويمكن استخدامها بمثابة ركائز لمجموعة متنوعة من CYPs.
      1. إعداد خلايا كافية لتشمل مراقبة غير التي يسببها، اختبارا التي يسببها، والتي يسببها + المانع الاختبار. ويرد مثال على تخطيط لوحة في الشكل 5B.
      2. للحث على CYP1A1 / 1B1، واحتضان الخلايا مع تركيز النهائي من 10 نانومتر TCDD في المتوسط ​​لمدة 72 ساعة (فترات أقصر من 24 إلى 48 ساعة قد تكون أيضا مناسبة).
         تنبيه: TCDD هي مادة مسرطنة ومشوه. ارتداء معدات الوقاية المناسبة، مراجعة MSDS ورقة المورد وإجراء تقييم المخاطر قبل الاستخدام.
      3. بعد هذه الفترة، وإزالة المتوسطة، وشطف الآبار مع PBS 3 مرات، وإضافة بعض المتوسط ​​الطازجة.
      4. العلاقات العامةIOR إلى احتضان الخلايا مع التحقيق الصحفي luminogenic، قبل احتضان فرعية معينة من الخلايا التي يسببها لمدة 30 دقيقة مع تركيز النهائي من 10 ميكرومتر CYP1A1 / 1B1 المانع، α-naphthoflavone، في المتوسط.
      5. إضافة التحقيق luminogenic LUC-CEE (وسيفيرين 6'-chloroethyl الأثير) بتركيز نهائي من 50 ميكرومتر إلى + المانع الخلايا غير التي يسببها، التي يسببها، والتي يسببها.
      6. احتضان لمدة 4 ساعات في حاضنة الثقافة الخلية. في نهاية فترة حضانة جمع سيلة لتقدير لجنة التحقيق luminogenic.
      7. نقل 25 ميكرولتر من مستنبت لبيضاء معتمة 96 لوحة جيدا وإضافة 25 ميكرولتر من كشف وسيفيرين كاشف المقدمة من قبل الشركة المصنعة. احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قراءة لوحة فورا باستخدام luminometer.
      8. شطف الخلايا مع برنامج تلفزيوني وليز لمجموع الكمي البروتين.
         ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية إذا تم الإبقاء على الخلايا الحية لإجراء التجارب في المستقبل. أنار المهم أن نلاحظ مع ذلك أن محرضات مثل TCDD سامة، وسوف تدمر الخلايا.

الجدول 1: قائمة ايض تحقيقات والمنتجات ومثبطات أنزيم مع من المقابلة. وأشار أيضا إلى الوزن الجزيئي وتركيزات أوصى استخدامها مع مجرى الهواء والخلايا الكبدية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (5): اقترح 24 جيدا لوحة تخطيط لإجراء الفحص CYP. (A) ويشمل تخطيط الموصى بها لCYPs أعرب جوهري سلسلة من الآبار على المدى المتوسط فارغةوالتحقيق الأيض، والأيض التحقيق بالإضافة إلى مثبط. ويمكن أن تتضاعف هذا التخطيط من قبل عدد من النقاط الزمنية التي يجري اختبارها. (B) ويشمل تخطيط سبيل المثال لCYPs محرض سلسلة من جيد للبياض المتوسط، تحقيق التمثيل الغذائي السيطرة فقط، والخلايا التي يسببها (على سبيل المثال، مع TCDD) حضنت مع تحقيقات وحضنت مع تحقيقات والمانع.

الجدول 2: التخفيف من معايير الاصطناعية المستخدمة في منحنيات المعايرة وLODs المعنية و LOQs. مجموعة التخفيف من استخدام يمكن أن تختلف استنادا إلى منصة مطياف الكتلة والحساسية. هنا، استخدمنا الثلاثي رباعي / الخطية مطياف الكتلة فخ أيون الهجين مرتبطة UPLC. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذاالشكل.

الجدول 3: Luminogenic التحقيق، محفز والمانع للCYP1A1 / 1B1 الفحص. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

النتائج

وترد أمثلة على النشاط الأيضي قياس لاثنين من أزواج من CYPs (CYP1A1 / 1B1 وCYP2A6 / 2A13) في مزارع الخلايا الهوائية من ثلاث جهات مانحة مختلفة (مجرى الهواء M360، M370، M417) وخط الخلية الكبدية (خط التهاب الكبد) في الشكل (6) ^20.

النشاط CYP تقاس luminometry
ويبين الشكل 6A التلألؤ النسبي الناجم عن النشاط CYP1A1 / 1B1 O-نزع الألكلة لوك-CEE (وسيفيرين 6'-chloroethyl الأثير) في خلايا الشعب الهوائية (3 المانحين) وخلايا الكبد مع وبدون TCDD الاستقراء. CYP1A1 / 1B1 هي الانزيمات محرض للغاية وعادة ما تكون غير وأعرب على المستوى التأسيسي في معظم الأنسجة. كما يمكن أن يرى في الشكل 6A، لم يتم الكشف عن إشارة luminogenic عندما لا يسببها الخلايا. عند كل أنواع الخلايا وقبل المحتضنة مع TCDD، قوي CYP1A1 / 1B1 محفز، علامةتم الكشف عن إشارة إد luminogenic مقارنة بالمجموعة الضابطة (الشكل 6A). هذا يدل على أن التحقيق لوك-CEE تم استقلاب الرائدة إلى الإفراج عن شاردة وسيفيرين أن وكميا في وقت لاحق. عموما النشاط من خط الخلية الكبدية TCDD معاملة أقل مما كانت عليه في خلايا الشعب الهوائية، حتى بعد تطبيع مجموع البروتين. هذا ليس من غير المألوف منذ خطوط الخلايا تميل إلى أن تكون أقل نشاطا أيضي من الخلايا الأولية. إضافة α-naphthoflavone لها تأثير كابح بشكل واضح على النشاط CYP1A1 / 1B1 في جميع أنواع الخلايا مما يؤكد كذلك CYP التبعية الأيض لوك-CEE.

الكمي لنواتج CYP450 باستخدام UPLC-MS
ويوضح الشكل 6B تقدير حجم CYP2A6 / النشاط 2A13 في خلايا الشعب الهوائية من 3 المانحين (مجرى الهواء M343، M345، M347) والخلايا الكبدية (خط التهاب الكبد) بعد الحضانة مع الكومارين في وجود وغياب inhibitor 8 ميثوكسي. وتطبيع البيانات عن البروتين الكلي. في السيطرة الكومارين الحضانة 0 دقيقة، تم الكشف عن عدم hydroxycoumarin 7 (الشكل 6B). وأعرب CYP2A6 / 2A13 جوهري في أنسجة معينة وبالتالي يتم الكشف بعد 16 ساعة الحضانة مع تشكيل الكومارين من 7 hydroxycoumarin في أنواع مختلفة من الخلايا اختبار، حتى من دون تحريض. عندما 8 ميثوكسي، يضاف مثبط CYP2A (الشكل 6B)، يتم تقليل تشكيل 7 hydroxycoumarin إلى حد كبير.

وتجدر الإشارة إلى أنه في وجود المانع CYP، فمن الطبيعي أن لا يزال الكشف عن بعض النشاط المتبقي كما تثبيط نادرا ما كاملة ومنذ CYPs أخرى قد تكون ايضا قادرة على التعرف على الركيزة ولكن معالجة ذلك أقل بكثير من الكفاءة. ويمكن أيضا ملاحظة أن النشاط الأيضي سجلت يمكن أن تكون مختلفة بين الجهات المانحة عند استخدام الخلايا الأولية كما هو الحال بالنسبة CYP2A6 في خلايا الشعب الهوائية مرئية(الشكل 6B). ومن المتوقع لهذا النشاط كما CYP من شأنه أن النمط الجيني كل جهة مانحة والأشكال.

الشكل 6: آخر الفحص النتيجة لCYP1A1 / 1B1 آخر (A) وCYP2A6 / 2A13 النشاط (B) في خط خلية كبد وفي ثلاثة مجرى الهواء خلية الجهات المانحة (M360، M370، M417). يظهر (A) لوك-CEE النشاط نزع الألكلة مع وبدون تحريض CYP1A1 / 1B1 التي كتبها TCDD. α-naphthoflavone كانت تستخدم مثبطات CYP1A1 / 1B1. وأعرب عن النشاط وحدات النسبية التلألؤ (RLU) تطبيع قبل فترة حضانة في دقيقة (دقيقة) والبروتين الكلي (ملغ). (B) CYP2A6 / 2A13 لا تتطلب الاستقراء كما يعبر عنها بشكل جوهري. يظهر الكومارين النشاط 7 الهيدروكسيل في البروتينات بمول / دقيقة / ملغ في نقاط زمنية مختلفة مع وبدون المانع 8 methoxypsorألين. يتم عرض كل النتائج كقيمة يعني من ثلاثة قياسات مستقلة مع الانحرافات المعيارية للمتوسط. تم تعديل هذا الرقم من باكستر ^20.

التكميلي الجدول 1: UPLC وإعدادات مطياف الكتلة. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

حاليا، العديد من أنظمة اختبار السمية موحدة تستخدم بكتيريا مهندسة، خطوط الخلايا أو الخلايا الجنينية التي ليست ممثلة التمثيل الغذائي الإنسان العادي ^1. هذا يمكن أن يؤدي إلى توقعات غير دقيقة من النشاط السامة المحتملة لمادة كيميائية أو دواء. مبتكرة نماذج في المختبر، مثل مزارع الخلايا 3D والجهاز على شريحة، يجري تطويرها في محاولة لتكرار أفضل التشكل الطبيعي والنشاط الأيضي للأنسجة البشرية ^{21 و 22 و 23.} الكفاءة الأيضية هي معيار واحد التي يمكن استخدامها على فك التي هي الأنسب نماذج لدراسات تقييم والتحول الأحيائي المخدرات السمية.

تم تصميم بروتوكول ذكرناها في هذه الورقة لقياس نشاط الانزيمات CYP باستخدام الخلايا الحية. أنها مرنة، ويمكن استخدامها لأنظمة مختلفة من الخلايا في 2D أو 3D الثقافيهوفاق ويوفر خيار لاستخدام إما probe- luminogenic أو النهج القائم على قياس الطيف الكتلي. كلتا الطريقتين حساسة بما يكفي للكشف عن كميات نانوغرام من المواد وتتطلب سوى عدد قليل من الخلايا المزروعة في شكل multiwell. كما يمكن تطبيقها على كروي أو خلايا نمت في مصفوفات معقدة. اختيار الركيزة التحقيق ومن الواضح أن عنصرا حاسما في البروتوكول. خصوصية الفحص تعتمد على التحقيق يجري انتقائية للانزيم CYP وطبقة أخرى من الضمان يمكن الحصول عليها عن طريق استخدام مثبط CYP انتقائي. ركائز ومثبطات المدرجة في هذه الورقة هي مجرد أمثلة قليلة، ولكن الآخرين يمكن العثور عليها في الأدب.

من المهم أن تنظر في حضانة مرات متعددة عند العمل مع نوع من الخلايا الجديدة كما CYP نتيجة النشاط السلبية يمكن أن يكون راجعا إلى إنزيم يجري التعبير عنه عند مستوى منخفض. بالإضافة إلى وجود نوع من الخلايا التي يمكن استخدامها كعنصر تحكم إيجابية مستحسنة لضمان أنلا يرتبط نتائج سلبية لقضية فنية وللمساعدة في أي حل المشاكل. خلايا الكبد الأساسية هي المختصة عملية الأيض، ويمكن استخدامها لمكافحة، على سبيل المثال خلايا الكبد الأولية في تعليق من السهل جدا للاستخدام ولكن قدرتها على الاستمرار محدودة في الوقت المناسب. خطوط الخلايا الكبدية هي البدائل الممكنة التي من السهل نسبيا للاستخدام كما هو موضح في هذا البروتوكول، ولكن بعضها أفضل من غيرها من حيث النشاط الأيضي ^{6، 21.}

منذ الاختبار هو غير مدمرة، ما لم يكن كميا البروتين الكلي، فمن الممكن لمتابعة النشاط CYP مع مرور الوقت في الدراسات الطولية ^20. وهذه نقطة مهمة لأن بعض الخلايا سيكون النشاط CYP متغير مع مرور الوقت في الثقافة. قد تكون مرتبطة النتيجة السلبية مع عدم وجود confluency، تقدم مع تمايز أو فقد التمايز في المختبر. في هذه الحالة، فإن هذا النهج هو شبه quantitati-لقد لأنه لا تطبيع البيانات عن طريق المبلغ الإجمالي من البروتين في كل ثقافة الخلية. وليس من الممكن دائما أو الموصى بها لإعادة النسيج بعد قياس النشاط CYP عن التعرض للتحقيقات، مثبطات أو محرضات يمكن أن يكون لها تأثير سام على الأنسجة كما هو الحال بالنسبة لTCDD.

ويمكن أيضا أن أجزاء الخلية مثل microsomes ل أن تستخدم لوصف النشاط CYP من نوع خلية معينة. صغرور الاستعدادات، ومع ذلك، تتطلب الكثير من المواد الخلية، إضافة العوامل المساعدة الكافية والعازلة للتأكد من أن الإنزيمات تبقى نشطة. استخدام الخلايا الحية يلغي خطوة إعداد صغرور صعبة والعمل بها والتي مخازن والعوامل المساعدة بشكل أفضل.

كما توصية عامة، بل هو أفضل الممارسات لزيادة تميز الشخصية تعبير عن CYPs في مزارع الخلايا للتحقق من أن يطابق النشاط الأنزيمي. وأوصى نظرا لهذا مستوى إضافي من التحقق من أن تحقيقات التمثيل الغذائي لا انتيتعتمد محددة لCYP واحد، وأنه يعطي زيادة الثقة في أن النشاط الأيضي قياس يقابله التعبير انزيم المقابلة. منذ CYPs هي بروتينات غشاء أنها صعبة نسبيا للتحضير لالبقع الغربية، وبالتالي الكمي RT-PCR كان النهج المفضل لمحة هذه الانزيمات ^20.

ومن المهم أن نلاحظ أن هذا البروتوكول يصف طريقة لنشاط انزيم فحص CYP أن يمثل سوى عائلة واحدة من الإنزيمات الأيضية، وإن كانت هامة. مرونة نهج قياس الطيف الكتلي تسمح للتطوير أساليب اكتساب لالتحولات الأيضية الأخرى من ركائز التحقيق. ومع ذلك، فقد لتطوير تلك في وقت واحد، وهناك عدد أقل حاليا تحقيقات محددة معروفة ومثبطات انتقائية للأسر انزيم الأيضية الأخرى. وينبغي معالجة هذه الفجوة لإتاحة إجراء تقييم شامل لكفاءة التمثيل الغذائي في المختبر خلية التنفسيالآنسة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
<قوي > كاشف & الخلايا< / قوي>
2 & مو ؛ مرشح المحقنة	م واتمان	UN203NPEORG
24 لوحة بئر	Corning	3524
4-methylumbelliferone	Sigma Aldrich	M1381
5-phenyl pentyne	Sigma Aldrich	CD5001437
6-hydroxybupropion	Sigma Aldrich	H3167
6-hydroxychlorzoxazone	Sigma Aldrich	UC148
7-إيثوكسي كومارين	سيجما ألدريتش	195642
7-هيدروكسي كومارين	سيجما ألدريتش	H24003
8-ميثوكسيبيسورالين	سيجما ألدريتش	M3501
حمض الأسيتيك	سيجما ألدريتش	695092
أسيتونيتريل	فيشر	أ / 0626/17
& ألفا ؛ -نافتوفلافون	سيجما مجموعة Aldrich	N5757
BCA	Thermo Scientific	23227
b-glucuronidase / arylsulfatase	Sigma Aldrich	G0876
Bupropion	Sigma Aldrich	B102
Carbamazepine	Sigma Aldrich	C4024
chlorzoxasone	Sigma Aldrich	C4397
كولاجين	أنظمة الخلية	5005-B
coumarin	سيجما ألدريتش	C4261
ديسولفيرام	سيجما ألدريتش	86720
فلوفوكسامين	سيجما ألدريتش	F2802
جلوتاماكس (مكمل الجلوتامين)	فيشر	35050061
هيباRG مكمل التمثيل الغذائي	ميرك	MMAD621
HepaRG ذوبان الجليد مكمل الوسائط	Merck	MMADD671
HepaRG	Merck	MMHPR116
Luciferin-CEE	Promega	V8751
الميثانول	فيشر	M / 4056/17
MucilAir خلايا مجرى الهواء	Epithelix	EP01
MucilAir خلايا صيانة مجرى الهواء	Epithelix	EP04MM
فينومينكس كينيتكس 2.6 & م ، PFP 100A	Phenomenex	00B-4477-AN
TCDD	Sigma Aldrich	48599
thioTEPA	Sigma Aldrich	T6069
Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 & micro ؛ م 2.1 × 50 مم	ووتر	86003538
ويليامز البريد وسائل الإعلام	فيشر	17704-024
name	Company	>Catalog Number	Comments
Equipment
UPLC	Waters	Acquity
QTRAP MS	Sciex	ABI Sciex 4000
QTRAP MS software	Sciex	محلل 1.4.2
مقياس الإضاءة	الأجهزة الجزيئية	SpectraMax M3
الطيف	الأجهزة الجزيئية	SpectraMax M3
عداد الخلايا	بيكمان كولتر	Vi-Cell XR
المبخر الدوار	Eppendorf	Eppendorf-5301